本發(fā)明涉及中藥飲片質量控制領域，具體涉及一種槐花炭的質量控制方法。

背景技術：

中藥制炭后用于止血距今已有兩千年的歷史，因其功效顯著，至今仍廣泛用于臨床。“炒炭存性”最早記載于《金匱要略方論》，曰：“燒灰存性，勿令灰過”。宋元時代，開始用炒法和煅法來控制存性程度。近現(xiàn)代認為炭藥既保存了原藥的部分功效，又具有止血及其它治療作用，方可謂之存性?；被ㄌ繛槲覈Ｓ弥兴庯嬈詻鑫犊?，入肝和大腸經；主要功能清熱和涼血止血；善治腸風便血、痔血、尿血、血淋、崩漏、衄血、赤白痢下、風熱目赤、癰疽瘡毒等，止血效果好于生槐花。

槐花炭臨床應用廣泛，適用于多種出血癥，但目前尚無統(tǒng)一的質量控制方法，難以保證其臨床療效的穩(wěn)定性，所以炭藥質量的控制是臨床用藥的重要保障。有研究認為槐花中的槐樹皂苷Ⅰ、異鼠李素-3-O-蕓香糖苷及蘆丁、鞣質是槐花炭中的主要止血成分，且異鼠李素-3-O-蕓香糖苷的止血作用最優(yōu)(趙雍,郭靜,劉婷等.槐花制炭后新止血成分的藥理研究[J].中國中藥雜志，2010，35(17):2346-2349)，但另有研究發(fā)現(xiàn)這些成分在加熱炮制后含量均不同程度下降(王愛芳,華衛(wèi)國,吳溢敏.槐米炭的炮制研究[J].中國藥學雜志,1982,10:55.；文獻1)，此結果與槐花炒炭后止血作用顯著增強的變化不一致。故槐花炭由于缺少好的質量控制方法，難以保證其臨床療效的穩(wěn)定性。

槐花炭加熱產物中產生的兩種化合物是主要止血成分，并結合NMR和MS數(shù)據(jù)確定其化學結構(見下圖)，

被命名為Huaicarbon A和Huaicarbon B(文獻1：Chen YQ,Yu HL,Wu H*,Pan YZ,Wang KL,Liu LP,Jin YP,Zhang CC.Tracing novel hemostatic compounds from heating products of total flavonoids in Flos Sophorae by spectrum-effect relationships and column chromatography.

Journal of separation science，2015,38(10)1691-1699)。

技術實現(xiàn)要素：

解決的技術問題：為了解決上述問題，本發(fā)明的目的在于提供一種槐花炭的質量控制方法。

技術方案：黃酮類止血成分Huaicarbon A和Huaicarbon B在槐花炭質量控制中的應用。

所述應用的具體方法為，通過測定槐花炭中黃酮類止血成分Huaicarbon A和Huaicarbon B的含量來控制槐花炭的質量。

測定方法為照高效液相法色譜法測定：色譜條件：色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-0.1％甲酸的水溶液為流動相梯度洗脫；檢測波長：254nm；梯度洗脫程序：0～10min，48wt.％甲醇；10～15min，48wt.％甲醇～60wt.％甲醇；15～30min，60wt.％甲醇；對照品溶液的制備：分別取相同重量的Huaicarbon A、Huaicarbon B對照品各2.0～10.0mg，，精密稱定，置于10mL容量瓶中，用甲醇溶解，并定容至刻度，作為單標母液；精密移取Huaicarbon A和Huaicarbon B單標母液混合，體積比5:2，并定容至10mL容量瓶中，配制為混標溶液，備用；供試品溶液的制備：取槐花炭粉末，0.5～2.0g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇20mL浸泡，稱定重量，超聲處理30min，補足減失的重量，濾過，得供試品溶液；含量測定：精密吸取對照品及供試品溶液10μL，注入液相色譜儀測定，即得槐花炭中Huaicarbon A及Huaicarbon B含量。

槐花炭中Huaicarbon A含量不低于0.10％，Huaicarbon B含量不低于0.03％。

有益效果：本發(fā)明對槐花炭建立了質量控制方法，該方法提供了利用高效液相色譜法同時測定槐花炭中Huaicarbon A和Huaicarbon B兩種止血指標性成分含量的質量控制方法，該質量標準簡便，且能更好地控制藥品的質量。本發(fā)明的質量控制方法，具有較強的專屬性和良好的重現(xiàn)性，真正體現(xiàn)體現(xiàn)藥品安全有效、質量可控。

附圖說明

圖1混合對照品及槐花及其6個炮制品甲醇提取物的HPLC色譜圖?；旌蠈φ掌?MRS)：1、蘆??；2、山奈酚-3-O-蕓香糖苷；3、異鼠李素-3-O-蕓香糖苷；4、槲皮素；5、Huaicarbon A；6、Huaicarbon B；7、山奈酚；8、異鼠李素，槐花(FS)，槐花250℃炒制8min(FSC1)、10min(FSC2)、12min(FSC3)、15min(FSC4)，市售槐花炭1(FSCP1)、市售槐花炭2(FSCP2)。

圖2為不同批次槐花炭鼠尾出血時間；注：*數(shù)據(jù)以平均值±SD表示，n＝6。與空白組比較，*p＜0.05，**p＜0.01；市售炭品組與相應的自制炭品組比較，##p＜0.01。

具體實施方式

以下實施例進一步說明本發(fā)明的內容，但不應理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改和替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段。

結合具體實施方式，對本發(fā)明進一步說明如下：

實施例1

1.兩種成分同時測定的含量測定方法為：

1.1藥材、儀器與試劑

自制的槐花炭(FSC)：稱取100g槐花(FS)飲片，待鍋面溫度達到250℃開始投藥，不斷均勻翻炒8min(FSC1)、10min(FSC2)、12min(FSC3)、15min(FSC4)，至藥物表面呈焦褐色。市售的槐花炭1(FSCP1，130430)，購自亳州市永剛飲片產有限公司；槐花炭2(FSCP2，140920)，購自南京海源中藥飲片有限公司。

Waters 2695-2489 PDA高效液相色譜系統(tǒng)；Milli-Q純水儀；BP211D電子天平(德國Sartorius公司)；KQ-500DE型醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

分析用對照品：蘆丁、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、異鼠李素-3-O-蕓香糖苷、槲皮素、山奈酚、異鼠李素，純度均大于98％，購自中國食品藥品檢定研究院。Huaicarbon A、Huaicarbon B(提取純化依據(jù)文獻1)，純度大于92％。HPLC用甲醇、乙腈及甲酸均為色譜純，超純水；其余試劑均為分析純。

1.2方法與結果

1.2.1色譜條件

Waters 2695-2489 PDA高效液相色譜；色譜柱：Dubhe C18(250mm×4.6mm，5.0μm)；流動相：甲醇-0.1％甲酸的水溶液梯度洗脫；流速：1mL/min；柱溫：30℃；進樣量：10μL。檢測波長：254nm。

梯度洗脫程序：0～10min，48wt.％甲醇；10～15min，48wt.％甲醇～60wt.％甲醇；15～30min，60wt.％甲醇。

1.2.2對照品溶液的制備

分別取蘆丁10mg、山奈酚-3-O-蕓香糖苷2.5mg、異鼠李素-3-O-蕓香糖苷4mg、槲皮素8mg、Huaicarbon A 3mg、Huaicarbon B 3mg、山奈酚3mg、異鼠李素3mg，精密稱定，置于10mL容量瓶中，用甲醇溶解，并定容至刻度，作為單標母液。取各藥物單標溶液，Huaicarbon A與Huaicarbon B單標母液混合，體積比5：2，并定容至10mL容量瓶中，配制為混標溶液，備用。

1.2.3供試品溶液的制備

取槐花炭粉末0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇20mL浸泡，稱定重量，超聲處理30min，補足減失的重量，濾過，得供試品溶液。

1.2.4線性關系考察

取1.2.2項下的混合對照品溶液，精密稀釋至母液的1/2、1/4、1/8、1/16、1/32，制備6個濃度水平的對照品溶液，進樣分析，以峰面積和進樣濃度建立每個目標分析物的回歸方程。結果見表1，所有化合物在檢測范圍內有較好的線性。線性回歸分析結果表明標準曲線的相關系數(shù)值>0.9990。數(shù)據(jù)呈現(xiàn)良好的重現(xiàn)性。

1.2.5最低檢測限和最低定量限

取1.2.2項下的混合對照品溶液，加入各藥物分析用的起始流動相，稀釋成一系列濃度由高到低的溶液，取信噪比為(S/N)3及10時的對照品濃度為最低檢測限(LOD)和最低定量限(LOQ)。結果見表1，LOD值在0.17～0.72μg/mL，LOQ值在0.60～2.5μg/mL。

表1槐花各標準品的線性回歸方程、相關系數(shù)、線性范圍、最低檢測限及最低定量限

1.2.6精密度試驗

精密吸取1.2.2項下的混合對照品溶液10μL，連續(xù)進樣6次，考察日內精密度，連續(xù)分析3天，考察日間精密度。用于目標分析物定量的精密度結果見表2，結果顯示所有的相對標準差(RSD)值不超過5.0％。

1.2.7穩(wěn)定性和重復性試驗

精密吸取1.2.3項下制備的供試品溶液適量，于0h、4h、8h、12h、24h及48h測定樣品，考察定量分析的穩(wěn)定性。按照1.2.3項下供試品制備的方法制備6份樣品，分別進樣，考察定量分析的重復性。用于目標分析物定量的重復性、穩(wěn)定性結果見表2，結果顯示所有的相對標準差(RSD)值不超過5.0％。

1.2.8加樣回收率

取已知被測成分含量的樣品6份，精密稱定，分別精密加入一定量的被測成分對照品(加入量與所取樣品含量之比為1:1)，按1.2.3項下的方法制備樣品后進樣。按回收率(％)＝(加標樣品測定值-樣品測定值)/加標量×100％計算回收率。結果見表2，所有待測成分的回收率值在95.32％～103.29％范圍內，符合要求。

表2槐花各標準品重復性、穩(wěn)定性、精密度及加樣回收率的測定結果

1.2.9樣品含量測定

取1.2.2項下各藥物的混合對照品溶液及1.2.3項下各藥物供試品溶液，進樣10μL，各批次槐花炭色譜圖見圖1將得到的各藥物中待測成分的峰面積代入線性方程中計算含量，結果見表3。

表3槐花及槐花炭中黃酮類成分定量分析結果

從結果可見，生品中含有多種黃酮類成分，炒炭后黃酮苷類均減少，而黃酮苷元增加，并且生成了Huaicarbon A和Huaicarbon B。黃酮苷元未見有止血作用的報道，而Huaicarbon A和Huaicarbon B被認為具有顯著的止血作用(見文獻1)。

2.不同批次炭藥及huaicarbonA/B的止血作用差異

2.1分組及給藥

取大鼠42只，隨機分為空白組、陽性藥組、FSC3組、FSCP1組、FSCP2組、Huaicarbon A和Huaicarbon B組，每組6只。按等效給藥劑量＝臨床劑量/60kg×6.3，再折算成生藥劑量為1.05g/kg，0.5％CMC-Na溶液作空白，云南白藥(YNBY)作陽性對照藥(0.3g/kg)；動物適應性飼養(yǎng)一段時間后開始灌胃，一天兩次，藥物的灌胃給藥體積為1.0mL/100g。于第4天灌胃后的30min開始指標測定。

2.2鼠尾出血時間(Bleeding Time，BT)測定

用1％戊巴比妥鈉(40mg/kg，腹腔注射)將大鼠麻醉。先將鼠尾沉浸在37℃生理鹽水中預溫2min，距鼠尾1mm處用干凈的手術刀剪斷誘導出血。出血時間是從剪斷開始出血到停止出血所需時間，待血流停止30s為停止出血。

2.3結果

由見圖2結果顯示。與空白組比較，自制的槐花炭3(FSC3)及Huaicarbon A和Huaicarbon B能極顯著縮短出血時間，說明它們均有止血作用。

與不含huaicarbon B及huaicarbon A含量極低的市場購買炭品(FSCP2)比較，自制炭品(FSC3)及和含huaicarbonA/B市售炭品(FSCP1)的止血作用顯著強于FSCP2，因Huaicarbon A和Huaicarbon B具有止血作用(文獻1)，表明Huaicarbon A和Huaicarbon B可能是槐花炭的主要止血活性成分，也說明炒炭的炮制工藝會顯著影響炭品的體內藥效。Huaicarbon A和Huaicarbon B的存在與否，將顯著影響槐花炭的止血作用。各批次槐花炭鼠尾出血時間見圖2。