本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種HPLC檢測(cè)醋酸去氨加壓素有關(guān)物質(zhì)的方法。

背景技術(shù)：

去氨加壓素是天然精氨加壓素的結(jié)構(gòu)類似物，系對(duì)天然激素的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行兩處改動(dòng)而得，即1-半胱氨酸脫去氨基和以8-D-精氨酸取代8-L-精氨酸。去氨加壓素的肽序結(jié)構(gòu)為:Mpa-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-D-Arg-Gly-NH₂(其中Mpa與Cys通過(guò)二硫鍵成環(huán))。

去氨加壓素主要用于治療中樞性尿崩癥、夜間遺尿及血友病等，也用于腎尿液濃縮功能的測(cè)試，還可用作術(shù)后止血。

目前，關(guān)于醋酸去氨加壓素的有關(guān)物質(zhì)分析方法，多采用磷酸鹽溶液和乙腈作為流動(dòng)相，通過(guò)梯度洗脫分離醋酸去氨加壓素各個(gè)雜質(zhì)。其中，《中國(guó)藥典2015版》中醋酸去氨加壓素質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，采用磷酸鹽溶液（取0.067mol/L磷酸氫二鉀與0.067mol/L磷酸二氫鉀等體積混合，調(diào)節(jié)pH值至7.0）為流動(dòng)相A，以乙腈為流動(dòng)相B，按下表梯度洗脫：

該方法存在流動(dòng)相配制復(fù)雜，檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，對(duì)儀器要求高，不利于快速分析等不足。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種HPLC檢測(cè)醋酸去氨加壓素有關(guān)物質(zhì)的方法，能夠快速的檢測(cè)醋酸去氨加壓素的有關(guān)物質(zhì)情況。

本發(fā)明提供的一種HPLC檢測(cè)醋酸去氨加壓素有關(guān)物質(zhì)的方法，包括以下步驟：

（1）取醋酸去氨加壓素標(biāo)準(zhǔn)品采用水制備醋酸去氨加壓素標(biāo)準(zhǔn)溶液，取醋酸去氨加壓素各已知雜質(zhì)對(duì)照品采用水制備醋酸去氨加壓素雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液；

（2）取待測(cè)樣品采用水制備待測(cè)樣品溶液；

（3）系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：取醋酸去氨加壓素適量，精密稱定，加水溶解并稀釋制成每1mL中含醋酸去氨加壓素0.5mg的溶液作為供試品溶液；精密量取供試品溶液1.0mL置100mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，配制成系統(tǒng)適用性溶液，取系統(tǒng)適用性溶液進(jìn)樣20μL，醋酸去氨加壓素峰與各雜質(zhì)峰分離度R>1.5；

（4）檢測(cè)限試驗(yàn)：取醋酸去氨加壓素已知雜質(zhì)，精密稱定，加水溶解并稀釋制成1.0~1.5μg/mL的稀溶液，依次改變進(jìn)樣量，當(dāng)信噪比（S/N）約為3∶1時(shí)樣品的量為檢測(cè)限；

（5）取步驟（2）配制的待測(cè)樣品溶液10~20μL注入液相色譜儀，流動(dòng)相流速為0.6~1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為：210nm；檢測(cè)器：DAD；柱溫：33~37℃；

所述流動(dòng)相包括A相和B相，A相為乙酸-水；B相：乙酸-乙腈；所述的A相中乙酸與水的體積比為0.1:100；B相中的乙酸與乙腈的體積比為0.1:100；A相與B相的體積比為78:22。

采用步驟（5）檢測(cè)條件測(cè)定步驟（1）配置的標(biāo)準(zhǔn)溶液或混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，能都達(dá)到有效分離。

根據(jù)上述的HPLC檢測(cè)醋酸去氨加壓素有關(guān)物質(zhì)的方法，其特征在于：步驟（1）所述醋酸去氨加壓素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0.5~1.0mg/mL;混合標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為0.004~0.01mg/mL。

根據(jù)上述的HPLC檢測(cè)醋酸去氨加壓素有關(guān)物質(zhì)的方法，步驟（1）混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制方法為，分別取醋酸去氨加壓素及其雜質(zhì)對(duì)照品適量，配制成0.5mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別取上述各標(biāo)準(zhǔn)品溶液100μL置于10mL容量瓶中，用水稀釋定容，得到濃度為5μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

根據(jù)上述的HPLC檢測(cè)醋酸去氨加壓素有關(guān)物質(zhì)的方法，步驟（2）所述待測(cè)樣品溶液的質(zhì)量濃度為0.3~0.8mg/mL。

根據(jù)上述的HPLC檢測(cè)醋酸去氨加壓素有關(guān)物質(zhì)的方法，步驟（1）和步驟（2）所述標(biāo)準(zhǔn)溶液、混合溶液和待測(cè)樣品溶液注入液相色譜儀之前通過(guò)孔僅為0.2~0.4μm的過(guò)濾膜過(guò)濾。

根據(jù)上述的HPLC檢測(cè)醋酸去氨加壓素有關(guān)物質(zhì)的方法，步驟（5）中所使用的色譜柱型號(hào)為Diamonsil，柱長(zhǎng)250mm，直徑4.6mm，粒度5μm，填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠，粒徑100A。

根據(jù)上述的HPLC檢測(cè)醋酸去氨加壓素有關(guān)物質(zhì)的方法，步驟（1）所述的醋酸去氨加壓素雜質(zhì)包括已知雜質(zhì)和未知雜質(zhì)，未知雜質(zhì)即合成過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物、中間體和降解產(chǎn)物。

本發(fā)明HPLC檢測(cè)醋酸去氨加壓素有關(guān)物質(zhì)的方法，具有如下優(yōu)點(diǎn)：

1、在同一色譜條件下，可滿足醋酸去氨加壓素與相鄰雜峰的分離度要求，可準(zhǔn)確判定醋酸去氨加壓素樣品中的有關(guān)物質(zhì)水平；

2、以乙酸水溶液和乙酸乙腈溶液為流動(dòng)相，配置過(guò)程簡(jiǎn)單，方便快捷。流動(dòng)相中不含鹽，降低對(duì)色譜柱造成損害，延長(zhǎng)色譜柱使用壽命；

3、采用等梯度洗脫，無(wú)需梯度洗脫，對(duì)檢測(cè)設(shè)備要求低，檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、易操作，檢測(cè)結(jié)果真實(shí)可靠，有利于普遍推廣。

附圖說(shuō)明

圖1本發(fā)明實(shí)施例1條件下系統(tǒng)適用性溶液的高效液相圖譜

圖2本發(fā)明實(shí)施例1條件下醋酸去氨加壓素的高效液相圖譜。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1

醋酸去氨加壓素有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)。

一、試劑和溶液

1、醋酸去氨加壓素對(duì)照品：以去氨加壓素（C46H64N14O12S2）計(jì)為87.0％

2、去氨加壓素EY對(duì)照品：100.0%（HPLC法，面積歸一法）

3、去氨加壓素F對(duì)照品：91.0%（HPLC法，面積歸一法）

4、去氨加壓素D對(duì)照品：88.3%（HPLC法，面積歸一法）

5、去氨加壓素Y對(duì)照品：96.4%（HPLC法，面積歸一法）

6、待測(cè)樣品溶液的制備

稱取醋酸去氨加壓素10.02mg，置于10mL容量瓶中，加蒸餾水溶解并定容至刻度，搖勻備用

7、系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：取醋酸去氨加壓素適量，精密稱定，加水溶解并稀釋制成每1mL中含醋酸去氨加壓素0.5mg的溶液作為供試品溶液；分別取各雜質(zhì)對(duì)照品適量，配制成0.5mg/mL的供試品溶液，精密量取供試品溶液0.1mL置10mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，配制成系統(tǒng)適用性溶液。

二、儀器與設(shè)備

1、分析天平：感量為0.0001g

2、微孔濾膜：孔徑0.45μm

3、高效液相色譜儀（配有紫外檢測(cè)器）。

三、分析步驟

1、液相色譜條件

色譜柱：Diamonsil，柱長(zhǎng)250mm，直徑4.6mm，粒度5μm，填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠；

流動(dòng)相：A相為乙酸-水；B相：乙酸-乙腈；所述的A相中乙酸與水的體積比為0.1:100；B相中的乙酸與乙腈的體積比為0.1~100；A相與B相的體積比為78:22；

流速：0.8mL/min；

檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm

進(jìn)樣量：20μL

2、液相色譜測(cè)定

取系統(tǒng)適用性溶液進(jìn)樣20μL，醋酸去氨加壓素及各已知雜質(zhì)與相鄰雜質(zhì)之間的分離度>1.5。取待測(cè)樣品溶液，過(guò)0.45μm濾膜，精密量取10μL注入液相色譜儀，記錄圖譜。

實(shí)施例2

檢測(cè)限試驗(yàn)。

一、試劑和溶液

1、去氨加壓素EY溶液： 0.116ng/μL

2、去氨加壓素F溶液： 0.112 ng/μL

3、去氨加壓素D溶液： 0.12 ng/μL

4、去氨加壓素Y溶液： 0.108 ng/μL。

二、儀器與設(shè)備

1、分析天平：感量為0.0001g

2、微孔濾膜：孔徑0.45μm

3、高效液相色譜儀（配有紫外檢測(cè)器）。

三、分析步驟

1、液相色譜條件

色譜柱：Diamonsil，柱長(zhǎng)250mm，直徑4.6mm，粒度5μm，填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠；

流動(dòng)相：A相為乙酸-水；B相：乙酸-乙腈；所述的A相中乙酸與水的體積比為0.1:100；B相中的乙酸與乙腈的體積比為0.1~100；A相與B相的體積比為78:22；

流速：0.8mL/min；

檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm

進(jìn)樣量：20μL~5μL

2、檢測(cè)結(jié)果

結(jié)果表明：去氨加壓素EY檢測(cè)限為0.58ng（S/N≈3）。去氨加壓素F檢測(cè)限為0.56ng（S/N≈3）。去氨加壓素D檢測(cè)限為0.6ng（S/N≈3）。去氨加壓素Y檢測(cè)限為0.54ng（S/N≈3）。