本發(fā)明涉及分子印跡技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及從中成藥龍膽瀉肝丸中富集與檢測(cè)微量馬兜鈴酸A的方法。

背景技術(shù)：

馬兜鈴酸A是一類硝基菲類化合物，主要存在于馬兜鈴屬和細(xì)辛屬植物中，可導(dǎo)致嚴(yán)重的腎毒性，含有馬兜鈴酸類物質(zhì)的藥用植物和制劑先后被多國(guó)禁用。目前仍舊有些中藥以及相關(guān)中成藥還在使用中，對(duì)中藥中的馬兜鈴酸的去除，有利于降低中藥的毒性。

目前馬兜鈴酸A常用的富集方法有以下兩種：溶劑法柱分離法；固相萃取法，以上馬兜鈴酸A的富集方法中：溶劑法柱分離法需要多次抽取、萃取、脫色等，還需要用到柱色譜進(jìn)行分離。該類技術(shù)操作繁瑣，富集效率低，耗時(shí)，成本高，同時(shí)提取的量也受到限制；固相萃取法的萃取材料C18、C8，雖然對(duì)馬兜鈴酸A的富集有一定效果，但是對(duì)強(qiáng)保留雜質(zhì)無法有效去除。

目前，固相萃取法的萃取材料常采用分子印跡技術(shù)來合成，分子印跡技術(shù)是一種為獲得在空間結(jié)構(gòu)和結(jié)合位點(diǎn)上與特定目標(biāo)分子相匹配的聚合物的技術(shù)，分子印跡技術(shù)制備的聚合物稱為分子印跡聚合物，其對(duì)目標(biāo)分子具有特異的識(shí)別能力和選擇能力。傳統(tǒng)的分子印跡聚合物的制備方法有本體聚合法和原位聚合法。本體聚合法得到的塊狀印跡聚合物經(jīng)常需要粉碎、研磨、過篩后才能應(yīng)用，其處理過程復(fù)雜費(fèi)時(shí)，且在過篩過程中印跡聚合物損失較大，產(chǎn)品形狀不規(guī)則，分散性較差。原位聚合法是在柱管中直接合成連續(xù)多孔的印跡聚合物，但其柱效仍舊不高，而且存在柱壓較高的問題。另外，合成的印跡聚合物對(duì)模板分子包埋過深過緊，造成洗脫困難，結(jié)合容量有限，模板分子擴(kuò)散阻力大，傳質(zhì)速率慢，不易于識(shí)別位點(diǎn)相結(jié)合，導(dǎo)致實(shí)際應(yīng)用中對(duì)模板分子富集效率低。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供從中成藥龍膽瀉肝丸中富集與檢測(cè)微量馬兜鈴酸A的方法，具有操作簡(jiǎn)單、結(jié)合容量高、傳質(zhì)速率快和實(shí)際應(yīng)用中對(duì)模板分子富集效率高的優(yōu)點(diǎn)。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：

從中成藥龍膽瀉肝丸中富集與檢測(cè)微量馬兜鈴酸A的方法，包括以下步驟：

1)制備分子印跡聚合物：

1.1)硅膠的活化：

稱取硅膠，加入到質(zhì)量濃度10％的稀鹽酸中，其中每40mL稀鹽酸中加入4-6g硅膠，于110℃加熱回流24h；用超純水抽濾洗滌至中性后，55℃烘干24h，得到活化硅膠備用；

1.2)硅膠表面改性：

稱取活化硅膠，加入甲苯、APTES和三乙胺組成的第一混合溶液形成混合體系，第一混合溶液每10mL中含有1g活化硅膠，第一混合溶液中甲苯、APTES和三乙胺體積比為(50-100):(2-4):1；混合體系于110℃加熱回流24h，用甲醇抽濾洗滌至中性，55℃烘干24h，得到改性硅膠備用；

1.3)在硅膠表面合成分子印跡聚合物：

將偽模板分子和功能單體MAA加入錐形瓶中，然后加入改性硅膠，每毫摩爾功能單體MAA含有改性硅膠250mg，再加入氯仿，每克改性硅膠對(duì)應(yīng)60mL氯仿；超聲溶解，加入一枚磁力攪拌轉(zhuǎn)子，密封瓶口，于45℃-65℃下恒溫?cái)嚢?0h后打開瓶塞，加入交聯(lián)劑EDGMA和引發(fā)劑AIBN，其中每毫摩爾功能單體MAA對(duì)應(yīng)1-2mL交聯(lián)劑EGDMA和0.04g AIBN；超聲攪拌，通入氮?dú)?，密封瓶口，恒溫?cái)嚢杈酆戏磻?yīng)24h，取出聚合物，用甲醇洗滌，再用體積比為4:1-9:1甲醇和冰醋酸的第二混合溶液于索氏提取器中抽提48h，分別用甲醇和水洗至中性，置于60℃過夜烘干，得到分子印跡聚合物；

2)制備分子印跡-固相萃取柱：

用步驟1)中制備的分子印跡聚合物100mg-200mg裝柱，以甲醇活化得到分子印跡-固相萃取柱；

3)用分子印跡-固相萃取柱檢測(cè)富集中成藥龍膽瀉肝丸中的馬兜鈴酸A：

對(duì)龍膽瀉肝丸進(jìn)行粗提，得到濃縮物，然后用甲醇溶解，以0.45μm微孔濾膜過濾，得到甲醇提取液；取甲醇提取液加載于步驟2)制備的分子印跡-固相萃取柱中，用無水乙醇:水3:1-1:1淋洗30min，用體積比為4:1-9:1甲醇和冰醋酸的第三混合溶液洗脫30min，收集洗脫液并揮干得到含有馬兜鈴酸A的復(fù)合物，以色譜甲醇復(fù)溶后進(jìn)高效液相色譜對(duì)復(fù)合物檢測(cè)。

所述的偽模板分子為氧氟沙星、萘普生或吲哚美辛。

所述的偽模板分子和功能單體MAA的摩爾比例為1:3-1:5。

本發(fā)明的有益效果為：在硅膠表面合成分子印跡聚合物，將分子印跡聚合物制備成分子印跡-固相萃取柱，用于中成藥龍膽瀉肝丸中馬兜鈴酸A富集，操作過程簡(jiǎn)單，采用偽模板分子代替馬兜鈴酸A可以降低對(duì)實(shí)驗(yàn)者的毒性傷害和對(duì)環(huán)境的污染，故富集過程更為安全，環(huán)保，且能夠快速地達(dá)到富集和檢測(cè)目標(biāo)物馬兜鈴酸A的目的，本發(fā)明具有操作簡(jiǎn)單、結(jié)合容量高、傳質(zhì)速率快和富集效率高的優(yōu)點(diǎn)。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1合成分子印跡聚合物流程示意圖。

圖2為實(shí)施例1所得的分子印跡聚合物掃描電鏡圖。

圖3為實(shí)施例1固相萃取前的龍膽瀉肝丸濃縮物色譜圖。

圖4為馬兜鈴酸A對(duì)照品色譜圖。

圖5為實(shí)施例1含有馬兜鈴酸A的復(fù)合物的色譜圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)地描述。

實(shí)施例1，參照?qǐng)D1，從中成藥龍膽瀉肝丸中富集與檢測(cè)微量馬兜鈴酸A的方法，包括以下步驟：

1)制備分子印跡聚合物：

1.1)硅膠的活化：

稱取硅膠30g，加入到質(zhì)量濃度10％的稀鹽酸250mL中，于110℃加熱回流24h；用超純水抽濾洗滌至中性后，55℃烘干24h，得到活化硅膠備用；

1.2)硅膠表面改性：

稱取活化硅膠30g，加入50mL甲苯、2mL APTES和1mL三乙胺組成的第一混合溶液形成混合體系，混合體系于110℃加熱回流24h，用甲醇抽濾洗滌至中性，55℃烘干24h，得到改性硅膠備用；

1.3)在硅膠表面合成分子印跡聚合物：

稱取0.5mmol的氧氟沙星和量取2mmol功能單體MAA于錐形瓶中，然后加入改性硅膠500mg，再加入氯仿30mL，超聲溶解，加入一枚磁力攪拌轉(zhuǎn)子，密封瓶口，于55℃下恒溫?cái)嚢?0h后打開瓶塞，加入交聯(lián)劑0.672mL EDGMA和引發(fā)劑16.8mg AIBN；超聲攪拌，通入氮?dú)?，密封瓶口，恒溫?cái)嚢杈酆戏磻?yīng)24h，取出聚合物，用甲醇洗滌，用體積比為4:1的甲醇和冰醋酸的第二混合溶液于索氏提取器中抽提48h，分別用甲醇和水洗至中性，置于60℃過夜烘干得到氧氟沙星分子印跡聚合物，如圖2所示，從圖中可以看出，球形硅膠表面粗糙，明顯有附著物，表明氧氟沙星已經(jīng)成功被聚合在改性硅膠上，分子印跡聚合物制備成功；

2)制備分子印跡-固相萃取柱：

用步驟1)中制備的氧氟沙星分子印跡聚合物200mg裝柱，以甲醇活化，得到分子印跡-固相萃取柱；

3)用分子印跡-固相萃取柱檢測(cè)富集中成藥龍膽瀉肝丸中的馬兜鈴酸A:

對(duì)龍膽瀉肝丸進(jìn)行粗提，得到濃縮物，然后用甲醇溶解，以0.45μm微孔濾膜過濾，得到甲醇提取液；取甲醇提取液加載于步驟2)制備的分子印跡-固相萃取柱中，用無水乙醇:水1:1淋洗30min，用體積比為4:1甲醇冰醋酸第三混合液洗脫30min，收集洗脫液并揮干得到含有馬兜鈴酸A的復(fù)合物，以色譜甲醇復(fù)溶后進(jìn)高效液相色譜對(duì)復(fù)合物檢測(cè)。

本實(shí)施例的有益效果：參照?qǐng)D3、圖4和圖5，對(duì)比發(fā)現(xiàn)，圖3中馬兜鈴酸A的含量分為0.014％，圖5中馬兜鈴酸A的含量分別為0.169％，由此可見，采用本實(shí)施例，即以氧氟沙星為偽模板分子在球型硅膠表面合成分子印跡聚合物作為固相萃取填料用于富龍膽瀉肝丸中的微量馬兜鈴酸A，可使龍膽瀉肝丸中的馬兜鈴酸A含量較常規(guī)方法提高11.9倍。由上述分析結(jié)果可見，本實(shí)施例可以有效富集馬兜鈴酸A，并且操作過程簡(jiǎn)單。

實(shí)施例2，從中成藥龍膽瀉肝丸中富集與檢測(cè)微量馬兜鈴酸A的方法，包括以下步驟：

1)制備分子印跡聚合物：

1.1)硅膠的活化：

稱取硅膠25g，加入到質(zhì)量濃度10％的稀鹽酸250mL中，于110℃加熱回流24h；用超純水抽濾洗滌至中性后，55℃烘干24h，得到活化硅膠備用；

1.2)硅膠表面改性：

稱取活化硅膠30g，加入100mL甲苯、4mL APTES和1mL三乙胺組成的第一混合溶液形成混合體系，混合體系于110℃加熱回流24h，用甲醇抽濾洗滌至中性，55℃烘干24h，得到改性硅膠備用；

1.3)在硅膠表面合成分子印跡聚合物：

稱取0.4mmol的氧氟沙星和量取2mmol功能單體MAA于錐形瓶中，然后加入改性硅膠500mg，再加入氯仿30mL，超聲溶解，加入一枚磁力攪拌轉(zhuǎn)子，密封瓶口，于45℃下恒溫?cái)嚢?0h后打開瓶塞，加入交聯(lián)劑0.672mL EDGMA和引發(fā)劑16.8mg AIBN；超聲攪拌，通入氮?dú)?，密封瓶口，恒溫?cái)嚢杈酆戏磻?yīng)24h，取出聚合物，用甲醇洗滌，用體積比為7:1的甲醇和冰醋酸的第二混合溶液于索氏提取器中抽提48h，分別用甲醇和水洗至中性，置于60℃過夜烘干得到氧氟沙星分子印跡聚合物；

2)制備分子印跡-固相萃取柱：

用步驟1)中制備的氧氟沙星分子印跡聚合物100mg裝柱，以甲醇活化，得到分子印跡-固相萃取柱；

3)用分子印跡-固相萃取柱檢測(cè)富集中成藥龍膽瀉肝丸中的馬兜鈴酸A:

對(duì)龍膽瀉肝丸進(jìn)行粗提，得到濃縮物，然后用甲醇溶解，以0.45μm微孔濾膜過濾，得到甲醇提取液；取甲醇提取液加載于步驟2)制備的分子印跡-固相萃取柱中，用無水乙醇:水3:1淋洗30min，用體積比為7:1甲醇冰醋酸第三混合液洗脫30min，收集洗脫液并揮干得到含有馬兜鈴酸A的復(fù)合物，以色譜甲醇復(fù)溶后進(jìn)高效液相色譜對(duì)復(fù)合物檢測(cè)。

本實(shí)施例的有益效果：印跡聚合物電鏡圖與實(shí)施例1中的電鏡圖很類似，但復(fù)合物通過檢測(cè)后，發(fā)現(xiàn)對(duì)馬兜鈴酸A的富集倍數(shù)較實(shí)施例1較低，由此可見，采用本實(shí)施例，即以氧氟沙星為偽模板分子合成分子印跡聚合物作為固相萃取填料可用于富龍膽瀉肝丸中的微量馬兜鈴酸A，但富集效果不及實(shí)施例1。

實(shí)施例3，從中成藥龍膽瀉肝丸中富集與檢測(cè)微量馬兜鈴酸A的方法，包括以下步驟：

1)制備分子印跡聚合物：

1.1)硅膠的活化：

稱取硅膠40g，加入到質(zhì)量濃度10％的稀鹽酸250mL中，于110℃加熱回流24h；用超純水抽濾洗滌至中性后，55℃烘干24h，得到活化硅膠備用；

1.2)硅膠表面改性：

稱取活化硅膠30g，加入50mL甲苯、3mL APTES和1mL三乙胺組成的第一混合溶液形成混合體系，混合體系于110℃加熱回流24h，用甲醇抽濾洗滌至中性，55℃烘干24h，得到改性硅膠備用；

1.3)在硅膠表面合成分子印跡聚合物：

稱取0.6mmol的氧氟沙星和量取2mmol功能單體MAA于錐形瓶中，然后加入改性硅膠500mg，再加入氯仿30mL，超聲溶解，加入一枚磁力攪拌轉(zhuǎn)子，密封瓶口，于65℃下恒溫?cái)嚢?0h后打開瓶塞，加入交聯(lián)劑0.672mL EDGMA和引發(fā)劑16.8mg AIBN；超聲攪拌，通入氮?dú)?，密封瓶口，恒溫?cái)嚢杈酆戏磻?yīng)24h，取出聚合物，用甲醇洗滌，用體積比為9:1的甲醇和冰醋酸的第二混合溶液于索氏提取器中抽提48h，分別用甲醇和水洗至中性，置于60℃過夜烘干得到氧氟沙星分子印跡聚合物；

2)制備分子印跡-固相萃取柱：

用步驟1)中制備的氧氟沙星分子印跡聚合物200mg裝柱，以甲醇活化，得到分子印跡-固相萃取柱；

3)用分子印跡-固相萃取柱檢測(cè)富集中成藥龍膽瀉肝丸中的馬兜鈴酸A:

對(duì)龍膽瀉肝丸進(jìn)行粗提，得到濃縮物，然后用甲醇溶解，以0.45μm微孔濾膜過濾，得到甲醇提取液；取甲醇提取液加載于步驟2)制備的分子印跡-固相萃取柱中，用無水乙醇:水1:3淋洗30min，用體積比為9:1甲醇冰醋酸第三混合液洗脫30min，收集洗脫液并揮干得到含有馬兜鈴酸A的復(fù)合物，以色譜甲醇復(fù)溶后進(jìn)高效液相色譜對(duì)復(fù)合物檢測(cè)。

本實(shí)施例的有益效果：印跡聚合物電鏡圖與實(shí)施例1中的電鏡圖很類似，但復(fù)合物通過檢測(cè)后，發(fā)現(xiàn)對(duì)馬兜鈴酸A的富集倍數(shù)較實(shí)施例1低，由此可見，采用本實(shí)施例，即以氧氟沙星為偽模板分子合成分子印跡聚合物作為固相萃取填料可用于富龍膽瀉肝丸中的微量馬兜鈴酸A，但富集效果不及實(shí)施例1。

實(shí)施例4，從中成藥龍膽瀉肝丸中富集與檢測(cè)微量馬兜鈴酸A的方法，包括以下步驟：

1)制備分子印跡聚合物：

1.1)硅膠的活化：

稱取硅膠30g，加入到質(zhì)量濃度10％的稀鹽酸250mL中，于110℃加熱回流24h；用超純水抽濾洗滌至中性后，55℃烘干24h，得到活化硅膠備用；

1.2)硅膠表面改性：

稱取活化硅膠30g，加入50mL甲苯、2mL APTES和1mL三乙胺組成的第一混合溶液形成混合體系，混合體系于110℃加熱回流24h，用甲醇抽濾洗滌至中性，55℃烘干24h，得到改性硅膠備用；

1.3)在硅膠表面合成分子印跡聚合物：

稱取0.5mmol的吲哚美辛和量取2mmol功能單體MAA于錐形瓶中，然后加入改性硅膠500mg，再加入氯仿30mL，超聲溶解，加入一枚磁力攪拌轉(zhuǎn)子，密封瓶口，于65℃下恒溫?cái)嚢?0h后打開瓶塞，加入交聯(lián)劑0.672mL EDGMA和引發(fā)劑16.8mg AIBN；超聲攪拌，通入氮?dú)?，密封瓶口，恒溫?cái)嚢杈酆戏磻?yīng)24h，取出聚合物，用甲醇洗滌，用體積比為9:1的甲醇和冰醋酸的第二混合溶液于索氏提取器中抽提48h，分別用甲醇和水洗至中性，置于60℃過夜烘干得到吲哚美辛分子印跡聚合物；

2)制備分子印跡-固相萃取柱：

用步驟1)中制備的吲哚美辛分子印跡聚合物100mg裝柱，以甲醇活化，得到分子印跡-固相萃取柱；

3)用分子印跡-固相萃取柱檢測(cè)富集中成藥龍膽瀉肝丸中的馬兜鈴酸A:

對(duì)龍膽瀉肝丸進(jìn)行粗提，得到濃縮物，然后用甲醇溶解，以0.45μm微孔濾膜過濾，得到甲醇提取液；取甲醇提取液加載于步驟2)制備的分子印跡-固相萃取柱中，用無水乙醇:水1:1淋洗30min，用體積比為4:1甲醇冰醋酸第三混合液洗脫30min，收集洗脫液并揮干得到含有馬兜鈴酸A的復(fù)合物，以色譜甲醇復(fù)溶后進(jìn)高效液相色譜對(duì)復(fù)合物檢測(cè)。

本實(shí)施例的有益效果：印跡聚合物電鏡圖與實(shí)施例1中的電鏡圖很類似，但復(fù)合物通過檢測(cè)后，發(fā)現(xiàn)對(duì)馬兜鈴酸A的富集倍數(shù)較實(shí)施例1低，由此可見，采用本實(shí)施例，即以吲哚美辛為偽模板分子合成分子印跡聚合物作為固相萃取填料可用于富龍膽瀉肝丸中的微量馬兜鈴酸A，但富集效果不如實(shí)施例1。

實(shí)施例5，從中成藥龍膽瀉肝丸中富集與檢測(cè)微量馬兜鈴酸A的方法，包括以下步驟：

1)制備分子印跡聚合物：

1.1)硅膠的活化：

稱取硅膠30g，加入到質(zhì)量濃度10％的稀鹽酸250mL中，于110℃加熱回流24h；用超純水抽濾洗滌至中性后，55℃烘干24h，得到活化硅膠備用；

1.2)硅膠表面改性：

稱取活化硅膠30g，加入50mL甲苯、2mL APTES和1mL三乙胺組成的第一混合溶液形成混合體系，混合體系于110℃加熱回流24h，用甲醇抽濾洗滌至中性，55℃烘干24h，得到改性硅膠備用；

1.3)在硅膠表面合成分子印跡聚合物：

稱取0.5mmol的萘普生和量取2mmol功能單體MAA于錐形瓶中，然后加入改性硅膠500mg，再加入氯仿30mL，超聲溶解，加入一枚磁力攪拌轉(zhuǎn)子，密封瓶口，于55℃下恒溫?cái)嚢?0h后打開瓶塞，加入交聯(lián)劑0.672mL EDGMA和引發(fā)劑16.8mg AIBN；超聲攪拌，通入氮?dú)猓芊馄靠?，恒溫?cái)嚢杈酆戏磻?yīng)24h，取出聚合物，用甲醇洗滌，用體積比為9:1的甲醇和冰醋酸的第二混合溶液于索氏提取器中抽提48h，分別用甲醇和水洗至中性，置于60℃過夜烘干得到萘普生分子印跡聚合物；

2)制備分子印跡-固相萃取柱：

用步驟1)中制備的萘普生分子印跡聚合物150mg裝柱，以甲醇活化，得到分子印跡-固相萃取柱；

3)用分子印跡-固相萃取柱檢測(cè)富集中成藥龍膽瀉肝丸中的馬兜鈴酸A:

對(duì)龍膽瀉肝丸進(jìn)行粗提，得到濃縮物，然后用甲醇溶解，以0.45μm微孔濾膜過濾，得到甲醇提取液；取甲醇提取液加載于步驟2)制備的分子印跡-固相萃取柱中，用無水乙醇:水1:1淋洗30min，用體積比為4:1甲醇冰醋酸第三混合液洗脫30min，收集洗脫液并揮干得到含有馬兜鈴酸A的復(fù)合物，以色譜甲醇復(fù)溶后進(jìn)高效液相色譜對(duì)復(fù)合物檢測(cè)。

本實(shí)施例的有益效果：電鏡圖與實(shí)施例1中的電鏡圖類似，但復(fù)合物通過液相檢測(cè)后，發(fā)現(xiàn)對(duì)馬兜鈴酸A的富集倍數(shù)較實(shí)施例1低，由此可見，采用本實(shí)施例，即以萘普生為偽模板分子在球型硅膠表面合成分子印跡聚合物作為固相萃取填料可用于富龍膽瀉肝丸中的微量馬兜鈴酸A，但富集效果不如實(shí)施例1。