相關(guān)申請的交叉引用

本申請要求2016年2月2日提交的u.s.臨時(shí)專利申請no.62/111,073的利益，其公開內(nèi)容通過引用并入本文。

背景技術(shù)：

樣品中存在的酶活性可以指示生物體的毒素、障礙或其它狀況的存在。例如，蛋白酶是人體中發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)廣泛的正常人體生理過程的極其重要的分子，包括傷口愈合、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞凋亡。因?yàn)槠湓谌梭w內(nèi)的重要作用，異常的蛋白酶活性與多種疾病狀態(tài)相關(guān)聯(lián)，包括但不限于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、阿爾茲海默病、心血管疾病和廣泛的惡性腫瘤。前列腺特異性抗原(psa)是有價(jià)值的診斷性蛋白酶的一個(gè)實(shí)例，其在診斷和監(jiān)測男性的前列腺癌方面是金標(biāo)準(zhǔn)。蛋白酶在幾乎所有人體液和組織中發(fā)現(xiàn)，且其活性水平可以給出病癥存在的信號(hào)。

雖然存在測定樣品中酶的存在的多種策略，但通常所討論的酶的活性比酶本身的存在或不存在更重要。確實(shí)存在著評估樣品中存在的酶活性水平的策略，但這些技術(shù)通常是昂貴的，需要大量的時(shí)間投入和設(shè)備基礎(chǔ)設(shè)施和/或難以使用或是非便攜的。因此需要的是測定溶液中的酶活性的方法，其是快速的、區(qū)分活性酶與僅存在而非活性的那些酶、是無標(biāo)記的和/或可以對純化或非純化的樣品進(jìn)行。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本文公開的各個(gè)方面可以滿足一種或多種上述需要。本文所述的系統(tǒng)和方法各自具有幾個(gè)方面，不是其中的一個(gè)單一方面導(dǎo)致其所需的特性。非限制如通過以下的權(quán)利要求表示的本公開的范圍，更突出的特征現(xiàn)在將簡要地討論。在考慮這一討論后且特別地在閱讀標(biāo)題為“詳細(xì)說明”的章節(jié)后，應(yīng)理解本文所述的樣品特征如何提供改善的系統(tǒng)和方法。

在一些實(shí)施方式中，本文提供了通過使用納米孔隙裝置鑒別切割的產(chǎn)物而檢測不穩(wěn)定的接頭(例如，可切割接頭)被目標(biāo)分子或條件的切割來檢測樣品中目標(biāo)分子或條件的存在或不存在的方法。在一些實(shí)施方式中，目標(biāo)分子是酶，且本文所述的方法檢測樣品中活性目標(biāo)酶的存在或不存在。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方式中，聚合物骨架是dsdna。在某些優(yōu)選的實(shí)施方式中，融合體直接和共價(jià)地與dsdna結(jié)合，且有效負(fù)載直接和非共價(jià)地與融合體結(jié)合。

在一些實(shí)施方式中，在通過酶切割可切割接頭之前，骨架/融合體/有效負(fù)載在通過納米孔隙轉(zhuǎn)位時(shí)提供獨(dú)特的和可檢測的電流。在一些實(shí)施方式中，在通過酶切割可切割接頭之后，骨架(或骨架加融合體的其余組分)和有效負(fù)載(或有效負(fù)載加融合體的其余組分)不再結(jié)合，且各自在通過納米孔隙轉(zhuǎn)位時(shí)提供獨(dú)特的和可檢測的電流，其不同于骨架/融合體/有效負(fù)載復(fù)合體。

在某些實(shí)施方式中，融合分子包含與dna骨架結(jié)合的pna和通過連接體共價(jià)地系著(tether)于pna的可切割接頭。

在某些實(shí)施方式中，有效負(fù)載是結(jié)合于可切割接頭的peg。在某些實(shí)施方式中，有效負(fù)載的大小、形狀和/或電荷可以改變以基于特定形狀或大小的孔隙中的電流阻抗提高分辨率，從而提供骨架/融合體/有效負(fù)載復(fù)合體與骨架和有效負(fù)載之間更好的區(qū)分。

在某些實(shí)施方式中，聚合物骨架是具有一個(gè)或多個(gè)包含可切割結(jié)構(gòu)域的序列位點(diǎn)的dsdna，該可切割結(jié)構(gòu)域可通過一種或多種目標(biāo)核酸內(nèi)切酶切割。在某些實(shí)施方式中，聚合物骨架在切割之前是線性dsdna。在某些實(shí)施方式中，聚合物骨架在切割之前是環(huán)狀dsdna。

本文還提供了分析來自納米孔隙裝置的數(shù)據(jù)以定量疑似存在于樣品中的目標(biāo)分子或條件的存在的方法。在某些優(yōu)選的實(shí)施方式中，分配對于檢測的數(shù)值置信度值。在某些優(yōu)選的實(shí)施方式中，目標(biāo)的濃度通過將數(shù)學(xué)工具應(yīng)用于改變?nèi)诤象w、骨架、有效負(fù)載和/或目標(biāo)分子中一種或多種的濃度的重復(fù)實(shí)驗(yàn)來估計(jì)。

在一些實(shí)施方式中，本文提供了檢測疑似存在于樣品中的目標(biāo)分子的存在或不存在的方法，包括：使所述樣品與包含可切割接頭的融合分子接觸，其中可切割接頭在目標(biāo)分子的存在下被特異性地切割；將樣品加載到包含納米孔隙的裝置中，其中納米孔隙將裝置的內(nèi)部空間分成兩個(gè)體積；配置裝置以使聚合物骨架穿過納米孔隙，其中第一部分的融合分子與聚合物骨架結(jié)合，其中第二部分的融合分子與有效負(fù)載分子結(jié)合，且其中所述裝置包含配置為鑒別穿過所述納米孔隙的物體的傳感器；和用所述傳感器確定是否所述可切割接頭已經(jīng)被切割，從而檢測樣品中目標(biāo)分子的存在或不存在。

在一些實(shí)施方式中，使樣品與融合分子接觸在將樣品加載到裝置中之前進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，將樣品加載到裝置中在使樣品與融合分子接觸之前進(jìn)行。

在一些實(shí)施方式中，融合分子包含聚合物骨架結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方式中，檢測目標(biāo)分子的存在或不存在的方法進(jìn)一步包括使所述樣品與聚合物骨架接觸。在一些實(shí)施方式中，檢測目標(biāo)分子的存在或不存在的方法進(jìn)一步包括將聚合物骨架結(jié)合于聚合物骨架結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方式中，聚合物骨架通過共價(jià)鍵、氫鍵、離子鍵、范德華力、疏水相互作用、陽離子-π相互作用、平面堆積相互作用或金屬鍵與聚合物骨架結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，聚合物骨架結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含疊氮基團(tuán)。在一些實(shí)施方式中，聚合物骨架結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含選自下組的分子：dna、rna、pna、多肽、膽固醇/dna雜合體和dna/rna雜合體。在一些實(shí)施方式中，聚合物骨架結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含選自下組的分子：鎖核酸(lna)、橋接的核酸(bna)、轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶(talen)、成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(crispr)、適體、dna結(jié)合蛋白和抗體片段。在一些實(shí)施方式中，dna結(jié)合蛋白包括鋅指蛋白。在一些實(shí)施方式中，抗體片段包括片段抗原結(jié)合(fab)片段。在一些實(shí)施方式中，聚合物骨架結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含化學(xué)修飾。

在一些實(shí)施方式中，融合分子包含有效負(fù)載分子結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方式中，檢測目標(biāo)分子的存在或不存在的方法進(jìn)一步包括使樣品與有效負(fù)載分子接觸。

在一些實(shí)施方式中，檢測目標(biāo)分子的存在或不存在的方法進(jìn)一步包括將有效負(fù)載分子結(jié)合于有效負(fù)載分子結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方式中，有效負(fù)載分子通過共價(jià)鍵、氫鍵、離子鍵、范德華力、疏水相互作用、陽離子-π相互作用、平面堆積相互作用或金屬鍵與有效負(fù)載分子結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，有效負(fù)載分子結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含dbco。

在一些實(shí)施方式中，融合分子包含聚合物骨架結(jié)合結(jié)構(gòu)域和有效負(fù)載分子結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方式中，第一部分的融合分子通過共價(jià)鍵、氫鍵、離子鍵、范德華力、疏水相互作用、陽離子-π相互作用、平面堆積相互作用或金屬鍵直接或間接地與聚合物骨架結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，第二部分的融合分子通過共價(jià)鍵、氫鍵、離子鍵、范德華力、疏水相互作用、陽離子-π相互作用、平面堆積相互作用或金屬鍵直接或間接地與有效負(fù)載分子結(jié)合。

在一些實(shí)施方式中，有效負(fù)載分子或聚合物骨架通過直接共價(jià)聯(lián)接(directcovalenttethering)與融合分子結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，融合分子包含用于聚合物骨架或融合分子與可切割接頭的直接共價(jià)聯(lián)接的連接體。在一些實(shí)施方式中，聚合物骨架包含融合分子。在一些實(shí)施方式中，樣品中目標(biāo)分子的存在或不存在的檢測包括用傳感器確定聚合物骨架是否經(jīng)由融合分子與有效負(fù)載分子結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，傳感器檢測納米孔隙中的電信號(hào)。在一些實(shí)施方式中，電信號(hào)是電流。

在一些實(shí)施方式中，目標(biāo)分子是水解酶或裂解酶。在一些實(shí)施方式中，可切割接頭包含選自下組的分子：脫氧核糖核酸(dna)、核糖核酸(rna)和多肽。在一些實(shí)施方式中，可切割接頭選自下組：偶氮化合物、二硫橋、砜、二琥珀酸乙二醇酯、腙、縮醛、亞胺、乙烯醚、鄰二醇和吡啶甲酸酯。在一些實(shí)施方式中，目標(biāo)分子特異性地切割可切割接頭中選自下組的鍵：碳-氧鍵、碳-硫鍵、碳-氮鍵和碳-碳鍵。

在一些實(shí)施方式中，聚合物骨架包含選自下組的分子：脫氧核糖核酸(dna)、樹狀聚合物、肽核酸(pna)、核糖核酸(rna)、多肽、納米棒、納米管、膽固醇/dna雜合體和dna/rna雜合體。在一些實(shí)施方式中，有效負(fù)載分子包含選自下組的分子：樹狀聚合物、雙鏈dna、單鏈dna、dna適體、熒光團(tuán)、蛋白質(zhì)、多肽、納米珠、納米棒、納米管、富勒烯、peg分子、脂質(zhì)體和膽固醇-dna雜合體。在一些實(shí)施方式中，融合分子包含兩個(gè)或更多個(gè)可切割接頭。

在一些實(shí)施方式中，傳感器包含電極對，其中電極對在兩個(gè)體積之間施加電壓差并檢測通過納米孔隙的電流。在一些實(shí)施方式中，該裝置包含至少兩個(gè)串聯(lián)的納米孔隙，其中聚合物骨架同時(shí)在該至少兩個(gè)納米孔隙中捕獲和檢測。在一些實(shí)施方式中，聚合物骨架的轉(zhuǎn)位通過施加跨各納米孔隙的獨(dú)特電壓進(jìn)行控制。

本文還提供了檢測疑似存在于樣品中的目標(biāo)分子或條件的存在或不存在的方法，該方法包括：使所述樣品與包含可切割接頭的融合分子接觸，其中可切割接頭在目標(biāo)分子或條件的存在下被特異性地切割；將樣品加載到包含納米孔隙的裝置中，其中納米孔隙將裝置的內(nèi)部空間分成兩個(gè)體積；配置裝置以使聚合物骨架穿過納米孔隙，其中第一部分的融合分子與聚合物骨架結(jié)合，其中第二部分的融合分子與有效負(fù)載分子結(jié)合，且其中所述裝置包含配置為鑒別穿過所述納米孔隙的物體的傳感器；和用所述傳感器確定是否所述可切割接頭已經(jīng)被切割，從而檢測樣品中所述目標(biāo)分子或條件的存在或不存在。

在一些實(shí)施方式中，本文提供了用于檢測疑似存在于樣品中的目標(biāo)分子或條件的存在或不存在的方法，該方法包括：使所述樣品與融合分子、聚合物骨架和有效負(fù)載分子接觸，融合分子包含可切割接頭、聚合物骨架結(jié)合結(jié)構(gòu)域和有效負(fù)載分子結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中目標(biāo)分子特異性地切割可切割接頭；將融合分子、聚合物骨架、有效負(fù)載分子和樣品加載到包含納米孔隙的裝置中，其中納米孔隙將裝置的內(nèi)部空間分成兩個(gè)體積；配置裝置以使聚合物骨架穿過納米孔隙，其中所述裝置包含配置為鑒別穿過所述納米孔隙的物體的傳感器；和用所述傳感器確定是否所述可切割接頭與所述有效負(fù)載分子結(jié)合，從而檢測所述目標(biāo)分子或條件的存在或不存在。

在一些實(shí)施方式中，目標(biāo)分子包含水解酶或裂解酶。在一些實(shí)施方式中，目標(biāo)分子或條件通過將可切割接頭暴露于包含10nm-550nm的波長的光來光解切割可切割接頭。在一些實(shí)施方式中，對光解切割敏感的可切割接頭選自下組：鄰-硝基苯甲基衍生物和苯?；パ苌?。在一些實(shí)施方式中，目標(biāo)分子或條件通過將可切割接頭暴露于選自下組的試劑來化學(xué)切割可切割接頭：親核試劑、堿性試劑、親電子試劑、酸性試劑、還原試劑、氧化試劑和有機(jī)金屬化合物。

在一些實(shí)施方式中，裝置的兩個(gè)體積中的至少一個(gè)包括允許融合分子與聚合物骨架結(jié)合和融合分子與有效負(fù)載分子結(jié)合的條件。在一些實(shí)施方式中，融合分子在將樣品與融合分子接觸之前與聚合物骨架和有效負(fù)載分子結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，融合分子在將融合分子加載到裝置中之前與聚合物骨架和有效負(fù)載分子結(jié)合。

在一些實(shí)施方式中，裝置內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)體積包括允許疑似存在于樣品中的目標(biāo)分子或條件切割可切割接頭的條件。在一些實(shí)施方式中，使樣品與融合分子接觸在將樣品加載到裝置中之前進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，將樣品加載到裝置中在使樣品與融合分子接觸之前進(jìn)行。

在一些實(shí)施方式中，聚合物骨架包含選自下組的分子：脫氧核糖核酸(dna)、樹狀聚合物、肽核酸(pna)、核糖核酸(rna)、多肽、納米棒、納米管、膽固醇/dna雜合體和dna/rna雜合體。

在一些實(shí)施方式中，可切割接頭包含選自下組的分子：脫氧核糖核酸(dna)、核糖核酸(rna)和多肽。在一些實(shí)施方式中，可切割接頭選自下組：偶氮化合物、二硫橋、砜、二琥珀酸乙二醇酯、腙、縮醛、亞胺、乙烯醚、鄰二醇和吡啶甲酸酯。

在一些實(shí)施方式中，目標(biāo)分子或條件特異性地切割可切割接頭中選自下組的鍵：碳-氧鍵、碳-硫鍵、碳-氮鍵和碳-碳鍵。

在一些實(shí)施方式中，有效負(fù)載分子包含選自下組的分子：樹狀聚合物、雙鏈dna、單鏈dna、dna適體、熒光團(tuán)、蛋白質(zhì)、多肽、納米珠、納米棒、納米管、富勒烯、peg分子、脂質(zhì)體和膽固醇-dna雜合體。

在一些實(shí)施方式中，聚合物骨架和融合分子通過共價(jià)鍵、氫鍵、離子鍵、范德華力、疏水相互作用、陽離子-π相互作用、平面堆積相互作用或金屬鍵結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，骨架和融合分子通過直接共價(jià)聯(lián)接結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，融合分子包含用于與聚合物骨架的直接共價(jià)聯(lián)接的連接體，其中連接體與可切割接頭結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，連接體包含聚乙二醇。在一些實(shí)施方式中，融合分子包含含有選自下組的分子的聚合物骨架結(jié)合結(jié)構(gòu)域：dna、rna、pna、多肽、膽固醇/dna雜合體和dna/rna雜合體。

在一些實(shí)施方式中，融合分子包含選自下組的分子：鎖核酸(lna)、橋接的核酸(bna)、轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶(talen)、成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(crispr)、適體、dna結(jié)合蛋白和抗體片段。在一些實(shí)施方式中，dna結(jié)合蛋白包括鋅指蛋白。在一些實(shí)施方式中，抗體片段包括片段抗原結(jié)合(fab)片段。在一些實(shí)施方式中，融合分子包含化學(xué)修飾。

在一些實(shí)施方式中，可切割接頭和有效負(fù)載分子通過共價(jià)鍵、氫鍵、離子鍵、范德華力、疏水相互作用、陽離子-π相互作用、平面堆積相互作用或金屬鍵直接或間接地結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，融合分子包含兩個(gè)或更多個(gè)可切割接頭。

在一些實(shí)施方式中，傳感器包含電極對，其中電極對在兩個(gè)體積之間施加電壓差并檢測通過納米孔隙的電流。

本文還提供了用于檢測疑似存在于樣品中的目標(biāo)分子或條件的方法，該方法包括：使所述樣品與聚合物骨架接觸，其中所述骨架包含可切割結(jié)構(gòu)域，其中可切割結(jié)構(gòu)域在目標(biāo)分子的存在下被特異性地切割；將聚合物骨架和樣品加載到包含納米孔隙的裝置中，其中納米孔隙將裝置的內(nèi)部空間分成兩個(gè)體積；配置裝置以使聚合物骨架穿過納米孔隙，其中所述裝置包含配置為鑒別穿過所述納米孔隙的物體的傳感器；和用傳感器確定可切割結(jié)構(gòu)域是否被切割，從而檢測樣品中所述目標(biāo)分子或條件的存在或不存在。

在一些實(shí)施方式中，聚合物骨架包含選自下組的分子：脫氧核糖核酸(dna)、樹狀聚合物、肽核酸(pna)、核糖核酸(rna)、多肽、納米棒、納米管、膽固醇/dna雜合體和dna/rna雜合體。

在一些實(shí)施方式中，可切割結(jié)構(gòu)域包含選自下組的分子：脫氧核糖核酸(dna)、核糖核酸(rna)和多肽。在一些實(shí)施方式中，目標(biāo)分子或條件特異性地切割可切割結(jié)構(gòu)域的選自下組的鍵：碳-氧鍵、碳-硫鍵、碳-氮鍵和碳-碳鍵。

在一些實(shí)施方式中，可切割結(jié)構(gòu)域在目標(biāo)分子或條件的存在下光解切割，且其中可切割結(jié)構(gòu)域包含選自下組的分子：鄰-硝基苯甲基衍生物和苯?；パ苌?。在一些實(shí)施方式中，可切割結(jié)構(gòu)域在目標(biāo)分子或條件的存在下被化學(xué)切割，且其中可切割結(jié)構(gòu)域包含選自下組的分子：偶氮化合物、二硫橋、砜、二琥珀酸乙二醇酯、腙、縮醛、亞胺、乙烯醚、鄰二醇或吡啶甲酸酯。

在一些實(shí)施方式中，裝置包含至少兩個(gè)串聯(lián)的納米孔隙，且其中聚合物骨架在轉(zhuǎn)位過程中同時(shí)處于該至少兩個(gè)納米孔隙中。

在一些實(shí)施方式中，本文提供了定量目標(biāo)疑似存在于樣品中的分子或條件的方法，該方法包括：使所述樣品與融合分子、聚合物骨架和有效負(fù)載分子接觸，融合分子包含可切割接頭、聚合物骨架結(jié)合結(jié)構(gòu)域和有效負(fù)載分子結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中可切割接頭在目標(biāo)分子或條件的存在下特異性地切割；將融合分子、聚合物骨架、有效負(fù)載分子和樣品加載到包含納米孔隙的裝置中，其中納米孔隙將裝置的內(nèi)部空間分成兩個(gè)體積；配置裝置以使聚合物骨架穿過納米孔隙，其中所述裝置包含配置為鑒別穿過所述納米孔隙的物體的傳感器；用傳感器確定聚合物骨架是否與有效負(fù)載分子結(jié)合，從而檢測目標(biāo)分子的存在或不存在；和使用來自傳感器的測量值估計(jì)疑似存在于樣品中的目標(biāo)分子或條件的濃度或活性。

在一些實(shí)施方式中，濃度或活性的測定包括對于疑似存在于樣品中的目標(biāo)分子或條件的檢測分配數(shù)值置信度值。在一些實(shí)施方式中，使樣品與融合分子接觸的步驟，將融合分子、聚合物骨架、有效負(fù)載分子和樣品加載到裝置中的步驟，配置裝置的步驟和確定聚合物骨架是否與有效負(fù)載分子結(jié)合的步驟對于所述聚合物骨架、所述融合分子、所述有效負(fù)載分子或所述樣品中的所述目標(biāo)分子或條件中一種或多種的變化的濃度或活性而被重復(fù)。

本文還提供了定量疑似存在于樣品中的目標(biāo)分子的方法，該方法包括：使所述樣品與包含可切割接頭的融合分子接觸，其中可切割接頭在目標(biāo)分子的存在下被特異性地切割；將樣品加載到包含納米孔隙的裝置中，其中納米孔隙將裝置的內(nèi)部空間分成兩個(gè)體積；配置裝置以使聚合物骨架穿過納米孔隙，其中第一部分的融合分子與聚合物骨架結(jié)合，其中第二部分的融合分子與有效負(fù)載分子結(jié)合，且其中所述裝置包含配置為鑒別穿過所述納米孔隙的物體的傳感器；用所述傳感器確定是否所述可切割接頭已經(jīng)被切割，從而檢測樣品中目標(biāo)分子的存在或不存在；和使用來自傳感器的測量值估計(jì)疑似存在于樣品中的目標(biāo)分子或條件的濃度。

在一些實(shí)施方式中，濃度的測定包括對于疑似存在于所述樣品中的目標(biāo)分子或條件的檢測分配數(shù)值置信度值。在一些實(shí)施方式中，使樣品與融合分子接觸的步驟，將樣品加載到裝置中的步驟，配置裝置的步驟和確定可切割接頭是否被切割的步驟對于聚合物骨架、融合分子、有效負(fù)載分子或樣品中的目標(biāo)分子或條件中一種或多種的變化的濃度而被重復(fù)。

本文還提供了試劑盒，其包含：包含納米孔隙的裝置，其中納米孔隙將裝置的內(nèi)部空間分成兩個(gè)體積，和配置裝置以使核酸穿過一個(gè)或多個(gè)孔隙，其中裝置包括用于各孔隙的傳感器，其配置為鑒別穿過所述納米孔隙的物體；包含可切割接頭的融合分子，其中可切割接頭在目標(biāo)分子的存在下被特異性地切割；有效負(fù)載分子；聚合物骨架；和用于檢測樣品中目標(biāo)分子的存在或不存在的說明。

在一些實(shí)施方式中，融合分子與有效負(fù)載分子結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，融合分子與聚合物骨架結(jié)合。

附圖說明

前述和其它目的、特征和優(yōu)勢從以下本發(fā)明的特定實(shí)施方式的描述是清楚的，如附圖中所闡明的。附圖中，相似的引用符號(hào)在不同的視圖中是指相同的部分。圖形不必是按比例繪制的，重點(diǎn)在于闡明本發(fā)明的各種實(shí)施方式的原理。作為本公開的實(shí)施方式還提供了僅通過示例而非限制來闡明特征的數(shù)據(jù)圖表。

圖1描繪了具有可切割接頭的融合分子的實(shí)施方式，融合體與有效負(fù)載結(jié)合，和融合體與納米孔隙中捕獲的骨架結(jié)合。

圖2描繪了一種使用納米孔隙系統(tǒng)利用骨架/融合體/有效負(fù)載分子檢測酶活性的方法。

圖3描繪了利用納米孔隙使用線性骨架分子檢測核酸內(nèi)切酶活性的方法。

圖4描繪了利用納米孔隙使用環(huán)狀骨架分子檢測核酸內(nèi)切酶活性的方法。

圖5描繪了利用納米孔隙使用具有多個(gè)目標(biāo)位點(diǎn)的目標(biāo)分子進(jìn)行核酸內(nèi)切酶活性的多重檢測的檢測方法。

圖6a、6b和6c描繪了包括在融合分子內(nèi)的易被基質(zhì)金屬蛋白酶9(mmp9)蛋白水解降解的可切割接頭的具體實(shí)例。融合分子的接頭組分連接于peg-生物素有效負(fù)載(圖6a)或尺寸較大的peg-生物素-單鏈霉親和素有效負(fù)載(圖6b)。融合分子包含能夠通過“點(diǎn)擊”化學(xué)作用與dna骨架分子化學(xué)偶聯(lián)的疊氮化學(xué)基團(tuán)(n3)(圖6c)。

圖7闡明了可切割接頭被mmp9蛋白水解降解的實(shí)例。在用含mmp9的樣品孵育時(shí)，蛋白酶敏感的構(gòu)建體被切割成兩個(gè)單獨(dú)的片段。

圖8描繪了三種示例分子穿過納米孔隙時(shí)的理想化電流特征，其阻抗值指示是否可切割接頭已經(jīng)被蛋白水解消化。圖a中所示的完整dna骨架/融合體/有效負(fù)載的較深和較長的持續(xù)電流阻抗特征表示可切割接頭未被mmp9降解。較短和/或較淺的電流阻抗特征對于在可切割接頭被mmp9切割后的兩個(gè)片段顯示在圖b和c中，其中該片段小于完全骨架/融合體/有效負(fù)載復(fù)合體且因此在各自穿過納米孔隙時(shí)阻礙較少的電流。

圖9a描繪了包含骨架分子的雙鏈dna和包含易被感興趣的核酸內(nèi)切酶切割的特定dna序列的一部分融合分子的具體實(shí)例。融合分子也包含用于通過無銅“點(diǎn)擊”化學(xué)作用與有效負(fù)載分子的下游偶聯(lián)的二苯并環(huán)辛炔(dbco)化學(xué)操作(chemicalhandle)。在圖9b中，dbco操作與peg-生物素有效負(fù)載偶聯(lián)。

圖10闡明了包括在dna的接頭區(qū)域中的可切割結(jié)構(gòu)域序列被核酸內(nèi)切酶eco81i降解的具體實(shí)例。在完整骨架/融合分子/有效負(fù)載構(gòu)建體用包含eco81i的樣品孵育時(shí)，可切割結(jié)構(gòu)域中被核酸內(nèi)切酶識(shí)別的特定序列被切割，產(chǎn)生兩個(gè)單獨(dú)的片段。

圖11描繪了三種示例分子的理想化電流特征，其阻抗值指示是否dna的融合體組分編碼的序列(即，可切割結(jié)構(gòu)域)已經(jīng)被核酸內(nèi)切酶消化。圖a描繪了完整骨架/融合體/有效負(fù)載穿過納米孔隙時(shí)的理想化電流特征，其中完全分子構(gòu)建體的大阻抗指示核酸內(nèi)切酶未切割可切割結(jié)構(gòu)域序列。圖b描繪了孵育和通過eco81i切割后dna的剩余骨架部分的理想化電流特征，從而在穿過納米孔隙時(shí)產(chǎn)生較淺和/或較快的事件特征。圖c描繪了與穿過納米孔隙且不與骨架結(jié)合的剩余片段一致的理想化電流特征。

圖12a描繪了示例構(gòu)建體，其中單一融合體包含用于檢測酶活性的兩個(gè)不同的酶可切割接頭：易受mmp9的蛋白水解降解的可切割接頭；和被核酸內(nèi)切酶eco81i識(shí)別和切割的特定序列。圖12b描繪了dna序列接頭通過活性核酸內(nèi)切酶eco81i的存在切割的過程，而可切割接頭在不存在活性mmp9的情況下保持完整。在完全骨架/融合體/有效負(fù)載構(gòu)建體用包含eco81i但不存在mmp9的樣品孵育時(shí)，核酸內(nèi)切酶識(shí)別的特定序列被切割，得到兩個(gè)單獨(dú)的片段。圖12c描繪了理想化納米孔隙事件特征，其將(i)完全分子構(gòu)建體與(ii,iii)可切割接頭的eco81i切割后的片段相比較。

圖13通過電泳遷移率變動(dòng)分析(emsa)證明了蛋白酶敏感的分子構(gòu)建體的偶聯(lián)。500bp雙鏈dna骨架(道1)系著于包含mmp9敏感可切割接頭的融合體，該mmp9敏感可切割接頭也系著于有效負(fù)載分子(道2，上條帶)。對于另外的有效負(fù)載體部，蛋白質(zhì)單鏈霉親和素與復(fù)合體的有效負(fù)載部分結(jié)合(道3，上條帶)。

圖14顯示了比較與蛋白酶mmp9孵育之前和之后蛋白酶-敏感的構(gòu)建體的電流遷移率的凝膠。500bpdna骨架與包含mmp9可切割接頭的融合體偶聯(lián)，該mmp9可切割接頭系著于有效負(fù)載(道1和3)。在用mmp9孵育后，構(gòu)建體顯示出通過dna條帶的下移表明的電泳遷移率的增加，指示可切割接頭的完全消化(道2)。

圖15顯示了在通過saui同裂酶eco81i降解之前或之后核酸內(nèi)切酶敏感構(gòu)建體的所得片段。與有效負(fù)載共價(jià)連接的500bpdna骨架內(nèi)的位點(diǎn)通過eco81i的降解導(dǎo)致編碼序列cc/t(n)agg(包含在500bpdna的融合體部分內(nèi))處的完全水解。水解產(chǎn)生兩個(gè)片段，306bp骨架和包含系著于有效負(fù)載的194bpdna的融合體:有效負(fù)載(道3)。

圖16顯示了人尿液的滴定中mmp9敏感構(gòu)建體的切割。系著于包含與有效負(fù)載結(jié)合的mmp9敏感構(gòu)建體的融合體的300bp骨架(道5)在0-30％范圍的提高濃度的尿存在下用mmp9孵育。高效的切割在高達(dá)5％的尿中發(fā)生(道2)，而酶的完全抑制在溶液中>15％的尿下是明顯的(道3和4)，如通過指示完整dna骨架:融合體:有效負(fù)載的上部條帶無變化所表明的。

圖17顯示了納米孔隙裝置的單分子探測。(a)由3.2kbdsdna在電壓v＝100mv下穿過27nm納米孔隙(1mlicl)導(dǎo)致的代表性電流偏移事件。事件通過電導(dǎo)偏移深度(δg＝δi/v)和持續(xù)時(shí)間定量。(b)在10分鐘內(nèi)記錄的744個(gè)事件的δg對持續(xù)時(shí)間的散點(diǎn)圖。

圖18比較了單獨(dú)dna(500bp)、dna-有效負(fù)載和dna-有效負(fù)載-單鏈霉親和素(dna-有效負(fù)載-ms)的納米孔隙事件特性。dna-有效負(fù)載與單獨(dú)dna相比產(chǎn)生δg>1ns的事件的數(shù)目的增加。添加ms到dna-有效負(fù)載將進(jìn)一步提高事件特征的深度的持續(xù)時(shí)間，如在(a)δg對持續(xù)時(shí)間的散點(diǎn)圖和(b)δg>1ns的事件的百分比中所觀察到的。

圖19比較了單獨(dú)dna骨架(300bp)、dna:融合體:有效負(fù)載和mmp9蛋白酶的活性后的dna:融合體:有效負(fù)載的納米孔隙事件，其中mmp9可切割接頭包括在融合分子中。長于0.1ms的事件的百分比提供了用于以99％置信度檢測mmp9酶的活性的特征。

圖20比較了單獨(dú)dna(500bp)、骨架:融合體:有效負(fù)載和與eco81i核酸內(nèi)切酶孵育后的骨架:融合體:有效負(fù)載的納米孔隙事件，其中eco81i的dna可切割接頭包括在dna的融合體部分中。長于0.06ms的事件的百分比提供了用于以99％置信度檢測eco81i酶的活性的特征。

具體實(shí)施方式

在整個(gè)本申請中，文本涉及本裝置、組合物、系統(tǒng)和方法的各種實(shí)施方式。所描述的各種實(shí)施方式旨在提供各種說明性例子，而不應(yīng)該被解釋為可選種類的描述。相反，應(yīng)該注意的是，此處提供的各種實(shí)施方式的描述在范圍上可能有重疊。此處討論的實(shí)施方式僅僅是說明性的，并不是要限制本發(fā)明的范圍。

也在本公開的全文中，各種出版物、專利和公開的專利說明書均通過明確的引文被引用。這些出版物、專利和公開專利說明書的公開內(nèi)容通過引用由此作為整體并入本公開中。

如本文中使用的，術(shù)語“包含”意指所述系統(tǒng)、裝置和方法包含所列舉的成分或步驟，但不排除其它的成分或步驟?！盎旧嫌伞M成”在用于定義系統(tǒng)、裝置和方法時(shí)意指排除對于組合有任何實(shí)質(zhì)意義的其它成分或步驟?！坝伞M成”意指排除其它成分或步驟。通過這些過渡術(shù)語中各自限定的實(shí)施方式在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

所有包括范圍的數(shù)值表達(dá)，例如距離、大小、溫度、時(shí)間、電壓和濃度，是近似值，其按照0.1的增量變化((+)或(-))。需要明白的是，雖然并不總是所有數(shù)值表達(dá)前明確加有術(shù)語“大約”。也需要明白，盡管并不總是明確地表述，此處所描述的成分只是示例性的，并且此類成分的等價(jià)物是本領(lǐng)域中已知的。

如本文中使用的，“包含分隔內(nèi)部空間的納米孔隙的裝置”應(yīng)當(dāng)指具有在結(jié)構(gòu)內(nèi)包含開口的孔隙的裝置，該結(jié)構(gòu)將內(nèi)部空間分隔成兩個(gè)體積或腔室。該裝置也可以具有多于一個(gè)納米孔隙，且在每對孔隙之間具有一個(gè)共同腔室。

如本文中所用的，術(shù)語“融合分子”是指包含對通過疑似存在于樣品中的目標(biāo)分子或目標(biāo)條件的酶促、光解或化學(xué)切割敏感的可切割接頭的分子或化合物。融合體也與聚合物骨架和有效負(fù)載分子結(jié)合。在通過納米孔隙轉(zhuǎn)位時(shí)，電流特征確定有效負(fù)載分子是否與聚合物骨架結(jié)合。以這種方式，融合分子內(nèi)可切割接頭的切割可以被檢測和/或定量。

如本文中所用的，術(shù)語“切割”或指的是破壞化學(xué)鍵以將分子或化合物分割成更簡單的結(jié)構(gòu)的過程或條件。分子(例如，酶)或條件集(例如，光解)，在如本文中所述與可切割接頭接觸時(shí)，可以導(dǎo)致接頭的切割以產(chǎn)生切割的接頭。如本文中所用的，特異性切割指的是接頭與目標(biāo)酶或條件之間的已知關(guān)系，其中目標(biāo)分子或條件已知切割可切割接頭。因此，分子或目標(biāo)特異性地切割接頭，此時(shí)接頭的切割可以用于推斷目標(biāo)分子或條件的存在。

如本文中所用的，術(shù)語“可切割接頭”或“不穩(wěn)定的接頭”指的是對通過目標(biāo)分子或條件的酶促、光解或化學(xué)切割敏感的底物接頭。在一些實(shí)施方式中，可切割接頭可以是脫氧核糖核酸(dna)、多肽、碳-氧鍵、碳-硫鍵、碳-氮鍵或碳-碳鍵。在一些實(shí)施方式中，對光解切割敏感的可切割接頭可以是鄰-硝基苯甲基衍生物或苯?；パ苌?。在一些實(shí)施方式中，對化學(xué)切割敏感的可切割接頭可以是偶氮化合物、二硫橋、砜、二琥珀酸二乙二醇酯、腙、縮醛、亞胺、乙烯醚、鄰二醇或吡啶甲酸酯。

在一些實(shí)施方式中，如本文中所用的術(shù)語“可切割結(jié)構(gòu)域”指的是對通過目標(biāo)分子或條件的酶促、光解或化學(xué)切割敏感的分子的結(jié)構(gòu)域。當(dāng)可切割結(jié)構(gòu)域是與聚合物骨架或有效負(fù)載分子相同分子類型的組分時(shí)，可切割結(jié)構(gòu)域可以與可切割接頭互換地使用。例如，在其中可切割結(jié)構(gòu)域在聚合物骨架上的實(shí)施方式中，也可以設(shè)想聚合物骨架為包含聚合物骨架和包含可切割接頭(即，可切割結(jié)構(gòu)域)的融合分子，其中融合分子與聚合物骨架結(jié)合，即使融合分子和聚合物骨架兩者是相同的分子類型(例如，dsdna)。

如本文中所用的，術(shù)語“目標(biāo)分子”是樣品中待檢測的感興趣的分子，且是指能夠切割(例如，通過酶促切割)可切割接頭區(qū)域或結(jié)構(gòu)域的分子(例如，水解酶或裂解酶)。目標(biāo)分子可以通過本文中描述的方法經(jīng)由轉(zhuǎn)位通過納米孔隙的與聚合物骨架結(jié)合的融合分子內(nèi)可切割接頭的切割來檢測，從而提供限定的電流阻抗或電流特征。

如本文中所用的，術(shù)語“目標(biāo)條件”指的是能夠通過暴露于10nm-550nm波長范圍內(nèi)的光而光解修飾可切割接頭的條件?；蛘?，目標(biāo)條件可能能夠通過暴露于親核或堿性試劑、親電子或酸性試劑、還原試劑、氧化試劑或有機(jī)金屬化合物而化學(xué)修飾可切割接頭。

如本文中所用的，術(shù)語“骨架”或“聚合物骨架”指的是在施加電壓時(shí)轉(zhuǎn)位通過納米孔隙的帶負(fù)電或正電的聚合物。在一些實(shí)施方式中，聚合物骨架包含可切割結(jié)構(gòu)域或可切割接頭。在一些實(shí)施方式中，能夠結(jié)合包含可切割接頭的融合分子或被包含可切割接頭的融合分子結(jié)合并在施加電壓時(shí)轉(zhuǎn)位通過孔隙的聚合物骨架。在一些方面中，聚合物骨架包含脫氧核糖核酸(dna)、核糖核酸(rna)、肽核酸(pna)、dna/rna雜合體或多肽。骨架也可以是化學(xué)合成的聚合物，而非天然存在的或生物的分子。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，聚合物骨架是dsdna以允許在轉(zhuǎn)位通過納米孔隙時(shí)更可預(yù)測的信號(hào)并減少ssdna或rna中存在的二級(jí)結(jié)構(gòu)。在一些實(shí)施方式中，聚合物骨架包含可能存在于骨架末端上或在骨架的兩個(gè)末端處的融合分子結(jié)合位點(diǎn)。骨架和融合分子可以通過共價(jià)鍵、氫鍵、離子鍵、范德華力、疏水相互作用、陽離子-π相互作用、平面堆積相互作用或金屬鍵連接。或者，可切割接頭組分與骨架的直接共價(jià)聯(lián)接可以連接骨架和融合分子。或者，融合體的連接體組分可以通過直接共價(jià)聯(lián)接將可切割接頭結(jié)合于骨架。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，融合分子包含骨架-結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其可以是dna、rna、pna、多肽、膽固醇/dna雜合體或dna/rna雜合體。

如本文中所用的，術(shù)語“有效負(fù)載”指的是與融合分子結(jié)合以增強(qiáng)納米孔隙中的檢測的選擇性和/或靈敏度的分子或化合物。在一些實(shí)施方式中，有效負(fù)載分子可以是樹狀聚合物、雙鏈dna、單鏈dna、dna適體、熒光團(tuán)、蛋白質(zhì)、多肽、納米棒、納米管、富勒烯、peg分子、脂質(zhì)體或膽固醇-dna雜合體。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，可切割接頭和有效負(fù)載通過共價(jià)鍵、氫鍵、離子鍵、范德華力、疏水相互作用、陽離子-π相互作用、平面堆積相互作用或金屬鍵直接或間接地連接。有效負(fù)載增大骨架:融合分子的尺寸，并利于可切割接頭的切割的檢測，其中骨架:融合體:有效負(fù)載在穿過納米孔隙時(shí)具有與可切割接頭的切割(例如，可切割接頭通過水解酶的切割)后剩余的骨架:融合體和融合體:有效負(fù)載組分明顯不同的電流特征。

如本文中所用的，術(shù)語“結(jié)合結(jié)構(gòu)域”指的是在另一分子的存在下特異性地與該分子結(jié)合的分子的結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方式中，本文公開的是與聚合物骨架特異性結(jié)合的聚合物骨架結(jié)合結(jié)構(gòu)域和與有效負(fù)載分子特異性結(jié)合的有效負(fù)載分子結(jié)合結(jié)構(gòu)域。

如本文中所用的，術(shù)語“連接體”指的是起到橋接彼此空間分開的兩個(gè)分子的作用的分子，從而允許它們通過連接體結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，聚乙二醇(peg)可以用作連接體,例如，在融合分子和聚合物骨架或有效負(fù)載分子之間。

如本文中所用的，術(shù)語“納米孔隙”指的是具有足夠尺寸以允許特別調(diào)整大小的聚合物通過的開口(孔洞或通道)。利用放大器，施加電壓以驅(qū)動(dòng)帶負(fù)電的聚合物通過納米孔隙，且通過孔隙的電流檢測是否分子穿過它。

如本文中所用的，術(shù)語“傳感器”指的是從納米孔隙裝置收集信號(hào)的裝置。在許多實(shí)施方式中，傳感器包括布置在孔隙的兩側(cè)的一對電極以測量當(dāng)分子或其它實(shí)體(特別是聚合物骨架)移動(dòng)通過孔隙時(shí)跨孔隙的離子電流。除電極外，另外的傳感器,例如，光學(xué)傳感器，可以用于檢測納米孔隙裝置中的光信號(hào)。其它傳感器可以用于檢測這類特性，如電流阻滯、電子隧穿電流、電荷誘導(dǎo)的場效應(yīng)、納米孔隙通過時(shí)間、光學(xué)信號(hào)、光散射和等離子體共振。

如本文中所用的，術(shù)語“電流測量”指的是在施加的電壓下隨時(shí)間通過納米孔隙的電流的一系列測量值。電流表示為定量事件的測量，且按照電壓(電導(dǎo))標(biāo)準(zhǔn)化的電流也用于定量事件。

如本文中所用的，術(shù)語“開放通道”指的是在噪音范圍內(nèi)的通過納米孔隙通道的電流的基線水平，其中電流不偏離通過分析軟件確定的值的閾值。

如本文中所用的，術(shù)語“事件”指的是在電流測量偏離開放通道值達(dá)到確定的閾值時(shí)開始，且在電流返回到開放通道值的閾值內(nèi)時(shí)結(jié)束的一組電流阻抗測量。

如本文中所用的，術(shù)語“電流阻抗特征”指的是在檢測的事件內(nèi)確定的電流測量值和/或譜的集合。在事件內(nèi)也可以存在多個(gè)特征以增強(qiáng)分子類型之間的區(qū)分。

檢測酶活性

本文提供了使用修飾的可切割接頭檢測酶活性的方法和組合物。如圖1中所示，設(shè)計(jì)用于檢測酶活性的存在的分子，骨架、有效負(fù)載和包含易發(fā)生降解的接頭的融合體。這種骨架:融合體(接頭):有效負(fù)載分子可以在納米孔隙系統(tǒng)中用于檢測樣品中酶活性的存在。特別地，圖2提供了顯示使用分子(圖1)與納米孔隙檢測酶活性的存在的概念性實(shí)例。在圖2中，可切割接頭是作為蛋白酶的底物的多肽序列。如果蛋白酶在樣品中不存在，則骨架/融合體(接頭)/有效負(fù)載分子將保持完整并在施加的電壓下轉(zhuǎn)位通過納米孔隙時(shí)產(chǎn)生更長和更深的信號(hào)。但是，如果感興趣的蛋白酶存在于樣品中且是活性的，其將消化可切割接頭多肽序列，從而生成單獨(dú)的有效負(fù)載和骨架分子，在這些分子在施加的電壓下穿過納米孔隙時(shí)，其各自將產(chǎn)生獨(dú)特的電流阻滯特征。電流阻滯和解析可以通過改變施加的電壓及其它的條件(鹽濃度、ph、溫度、納米孔隙幾何形狀、納米孔隙材料等)進(jìn)行調(diào)節(jié)。酶活性的解析也可以通過調(diào)節(jié)與納米孔隙接觸的溶液中目標(biāo)分子的濃度來調(diào)節(jié)。

可切割接頭可以以多種形式出現(xiàn)。正是目標(biāo)酶對于其底物的特異性賦予我們的納米孔隙活性分析以特異性。也就是說，來自樣品的背景分子不太可能明顯地改變或切割可切割接頭，而目標(biāo)分子或條件對于切割和/或修飾底物達(dá)到納米孔隙測量可以解析和檢測該切割和/或修飾的程度具有高親和力。

如本文所述的有效負(fù)載分子可以是有助于納米孔隙中可切割接頭分子的修飾(例如，切割)的檢測的任何分子。這可以包括，例如，樹狀聚合物、dna適體、熒光團(tuán)、蛋白質(zhì)或聚乙二醇(peg)聚合物。

骨架:融合體:有效負(fù)載構(gòu)建體的融合體組分內(nèi)的可切割接頭可以包括作為感興趣的目標(biāo)酶的活性的底物的任何底物。這可以包括，例如，多肽序列、核苷酸序列或任何其它酶底物。這一接頭也可能易被環(huán)境條件(例如，ph、uv和/或光)切割。

在另一實(shí)施方式中，骨架:融合體:有效負(fù)載可以縮減到僅骨架構(gòu)建體，特別地當(dāng)可切割接頭包含多核苷酸序列時(shí)。在這樣的實(shí)施方式中，骨架包含雙鏈dna。如圖3和4中所示，這與，例如，通過核酸內(nèi)切酶活性的檢測來檢測細(xì)菌污染相關(guān)。dna骨架內(nèi)包含dna序列的核酸內(nèi)切酶目標(biāo)提供在與納米孔隙接觸的溶液中。在不存在核酸內(nèi)切酶的情況中，較長電流特征在各目標(biāo)分子的轉(zhuǎn)位過程中出現(xiàn)。在添加包含感興趣的核酸內(nèi)切酶的樣品時(shí)，目標(biāo)分子被消化，產(chǎn)生隨著消化的dna片段利用施加的電壓轉(zhuǎn)位通過納米孔隙的較短電流特征，和來自全長目標(biāo)序列的電流特征持續(xù)時(shí)間的減小。線性(圖3)或環(huán)狀(圖4)骨架分子可以用于核酸內(nèi)切酶活性的檢測。

在另一實(shí)施方式中，骨架構(gòu)建體可以用于進(jìn)行通過核酸內(nèi)切酶活性的細(xì)菌污染的多重檢測。這種方法的一個(gè)實(shí)例顯示于圖5中。在這一實(shí)例中，含可切割結(jié)構(gòu)域的骨架包含用于通過一種或多種感興趣的目標(biāo)核酸內(nèi)切酶消化的多個(gè)獨(dú)特的可切割結(jié)構(gòu)域。所得的片段然后通過納米孔隙系統(tǒng)在溶液中檢測。消化的片段在施加的電壓下的轉(zhuǎn)位提供了通過適宜調(diào)整大小的孔隙的獨(dú)特電流特征，從而允許檢測哪些位點(diǎn)被消化，且因此哪些核酸內(nèi)切酶存在于感興趣的樣品中。

在其它實(shí)施方式中，如圖1-2中所示的骨架:融合體:有效負(fù)載構(gòu)建體也可以用于檢測核酸內(nèi)切酶活性。在該情況中，融合分子包含目標(biāo)dna序列，并附接于有利于消化的納米孔隙檢測的有效負(fù)載。

多重分析可以以變化的方式實(shí)現(xiàn)，例如，通過將超過一個(gè)融合體:有效負(fù)載附接于各骨架分子。利用這一構(gòu)建體，單孔隙裝置可能能夠檢測對于適當(dāng)設(shè)計(jì)的骨架和融合體:有效負(fù)載的多種目標(biāo)分子(例如，酶)或目標(biāo)條件的活性?；蛘?，將骨架加載到雙孔隙裝置(pct公開no.wo/2013/012881，通過引用全文并入本文中)中可以用于測定多種目標(biāo)分子(例如，酶)或目標(biāo)條件的活性。

如本文中使用的目標(biāo)分子或目標(biāo)條件的“活性狀態(tài)”是指融合分子內(nèi)的可切割接頭是完整的(導(dǎo)致完全骨架:融合體:有效負(fù)載復(fù)合體)還是不完整的(導(dǎo)致未與有效負(fù)載分子結(jié)合的骨架分子)。基本上，活性狀態(tài)可以是這兩種可能狀態(tài)之一。

目標(biāo)分子或目標(biāo)條件的活性狀態(tài)的檢測可以通過各種方法實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)方面，借助于在各種狀態(tài)下分子的不同大小，當(dāng)骨架:融合體:有效負(fù)載復(fù)合體穿過孔隙時(shí)，電流特征與單獨(dú)的骨架或單獨(dú)的有效負(fù)載穿過孔隙充分不同。在一個(gè)方面，利用施加的正電壓和實(shí)驗(yàn)緩沖液中大于0.4m的kci濃度或大于0.2m的licl濃度，所測得的電流信號(hào)(圖2)向下且因此是衰減。圖2中的三個(gè)信號(hào)可以通過電流偏移的量(深度)和/或電流偏移的持續(xù)時(shí)間(寬度)來彼此區(qū)分，或通過信號(hào)中區(qū)分這三種事件類型的任何其他特征來彼此區(qū)分。

在另一個(gè)方面，利用施加的正電壓和實(shí)驗(yàn)緩沖液中小于0.4m的kcl濃度，測得的電流信號(hào)對于骨架或由dna構(gòu)成的復(fù)合體的任何成分可以具有電流增強(qiáng)。這在smeets,ralphmm等人發(fā)表的研究“saltdependenceofiontransportanddnatranslocationthroughsolid-statenanopores.”nanoletters6.1(2006):89-95中對于單獨(dú)的dna進(jìn)行證明。在這種情況下，三種信號(hào)類型可以通過相對于開放通道基線電流水平(408)的事件振幅方向(極性)(除了通常具有不同的電流偏移量(高度)和/或電流偏移持續(xù)時(shí)間(寬度的這三個(gè)信號(hào))外)，或通過信號(hào)中區(qū)分這三種事件類型的任何其他特征來區(qū)分。

在圖2實(shí)施方式的方面中，傳感器包含連接到電源并可以檢測電流的電極。因此，任一或兩個(gè)電極用作“傳感器”。在這個(gè)實(shí)施方式中，電壓鉗或膜片鉗用于同時(shí)提供跨孔隙的電壓和測量通過孔隙的電流。

在一些方面中，有效負(fù)載被添加復(fù)合體以輔助檢測。在一個(gè)方面，有效負(fù)載包括電荷(或正或負(fù))以利于檢測。在另一個(gè)方面，有效負(fù)載增大尺寸以利于檢測。在另一方面，有效負(fù)載包括可檢測標(biāo)記，如熒光團(tuán)，其可以例如用聚焦在納米孔隙轉(zhuǎn)位的位點(diǎn)處的光學(xué)傳感器檢測。

聚合物骨架

適用于本公開的技術(shù)中的聚合物骨架是可以加載到納米孔隙裝置中并且從一端到另一端穿過孔隙的骨架。

聚合物骨架的非限制性的例子包括核酸，如脫氧核糖核酸(dna)、核糖核酸(rna)或肽核酸(pna)、樹狀聚合物和線性化的蛋白質(zhì)或肽。在一些方面中，dna或rna可以是單鏈的或雙鏈的，或者可以是dna/rna雜合分子。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，雙鏈dna用作聚合物骨架。dsdna作為聚合物骨架具有優(yōu)于ssdna的幾種優(yōu)勢。一般地，非特異性的相互作用和不可預(yù)測的二級(jí)結(jié)構(gòu)形成在ssdna中更普遍，使得dsdna更適合用于在納米孔隙裝置產(chǎn)生可再現(xiàn)的電流特征。而且，ssdna彈性反應(yīng)比dsdna更復(fù)雜，且對ssdna的性質(zhì)比dsdna知道得少得多。因此，本發(fā)明的許多實(shí)施方式經(jīng)工程設(shè)計(jì)以涵蓋作為聚合物骨架的dsdna，包括本文中使用一種或多種有效負(fù)載和/或融合分子。

在一個(gè)方面中，聚合物骨架是合成的或化學(xué)修飾的?；瘜W(xué)修飾可以幫助穩(wěn)定聚合物骨架、將電荷添加到聚合物骨架以提高遷移率、保持線性度或者提高或改變結(jié)合特異性，或者化學(xué)添加融合體和/或有效負(fù)載可以與其聯(lián)接的反應(yīng)性位點(diǎn)。在一些方面，化學(xué)修飾是乙?；?、甲基化、小泛素樣修飾蛋白化、氧化、磷酸化、糖基化、硫醇化、添加疊氮化物或者炔烴或活化炔烴(dbco-炔)、或添加生物素。

在一些方面，聚合物骨架是帶電的。dna、rna、pna和蛋白質(zhì)在生理?xiàng)l件下通常是帶電的。此類聚合物骨架可以進(jìn)一步修飾以增加或減少所帶電荷。其他聚合物骨架可以進(jìn)行修飾以引入電荷。聚合物骨架上的電荷可用于驅(qū)動(dòng)聚合物骨架以穿過納米孔隙裝置的孔隙。例如，帶電的聚合物骨架可以通過施加跨孔隙的電壓而跨孔隙移動(dòng)。

在一些方面，當(dāng)電荷引入聚合物骨架時(shí)，電荷可以添加在聚合物骨架的末端。在一些方面，電荷均勻地分布在整個(gè)聚合物骨架上。

骨架:融合體:有效負(fù)載構(gòu)建

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，融合分子包含：1)可切割接頭、2)骨架連接位點(diǎn)和3)有效負(fù)載連接位點(diǎn)。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，融合體:有效負(fù)載的代表性實(shí)例顯示于圖6中。具體地，圖6a顯示從左到右具有以下組分的融合體：用于與骨架連接的疊氮化物化學(xué)操作；連接體peg4；柔性gly-ser基序；mmp9-敏感肽序列sgkgprqita；和用于與有效負(fù)載連接的柔性gly-ser基序。圖6a顯示從左到右具有以下組分的有效負(fù)載：cys-5kdapeg和生物素。增大有效負(fù)載體積以利于活性檢測的選項(xiàng)是通過將單鏈霉親和素與生物素位點(diǎn)結(jié)合而使得成為可能(圖6b)。增大的體積可以在酶活性之前的骨架:融合體:有效負(fù)載和酶活性之后的單獨(dú)骨架和單獨(dú)有效負(fù)載之間產(chǎn)生更明顯不同的特征差異。

在這一實(shí)施方式中，這一實(shí)例中的可切割接頭肽序列是sgkgprqita。這種肽之前被確認(rèn)為對于mmp9活性是高度敏感的(kridel,stevenj.等"substratehydrolysisbymatrixmetalloproteinase-9.journalofbiologicalchemistry276.23(2001):20572-20578)。

在這一實(shí)施方式中，與dna骨架的連接可以以多種方式實(shí)現(xiàn)。在這一實(shí)例(圖6)中，dna可以使用二苯并環(huán)辛炔(dbco)修飾的引物產(chǎn)生，從而有效地用dbco化學(xué)基團(tuán)標(biāo)記所有dna骨架分子以用于通過無銅“點(diǎn)擊”化學(xué)作用與疊氮化物標(biāo)記的融合分子偶聯(lián)的目的，產(chǎn)生完全骨架:融合體:有效負(fù)載復(fù)合體(圖6c)。

對于代表性實(shí)例(圖6)，mmp9活性可以通過將包含mmp9的樣品與骨架:融合體:有效負(fù)載試劑組合來測定，且在足以使活性完成的時(shí)間后并在允許活性的條件下(圖7)，組合的試劑可以用納米孔隙測量(圖8)?；钚酝ㄟ^由納米孔隙提供的單分子測量測定，其中完全復(fù)合體產(chǎn)生較深和較長的事件特征，而產(chǎn)物產(chǎn)生較快和/或較淺的事件特征，如圖8中所描繪的。

在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，骨架:融合體:有效負(fù)載的代表性實(shí)例顯示于圖9中。具體地，圖9a顯示從左到右具有以下組分的骨架:融合體：(1)包含dna的骨架；包含(3)易被核酸內(nèi)切酶水解降解的dna序列的融合體，及(2)可用于與作為有效負(fù)載(未顯示)的疊氮攜帶分子偶聯(lián)的二苯并環(huán)辛炔(dbco)操作。易發(fā)生水解降解的dna序列是saui識(shí)別序列。圖9b顯示與來自圖9a的分子結(jié)合的有效負(fù)載，包含cys-5kdapeg和生物素。

對于代表性實(shí)例(圖9)，mmp9活性可以通過將包含eco81i的樣品與骨架:融合體:有效負(fù)載試劑組合來測定，且在足以使活性完成的時(shí)間后并在允許活性的條件下(圖10)，組合的試劑可以用納米孔隙測量(圖11)。在暴露于saui同裂酶eco81i時(shí)，分子構(gòu)建體在dna序列cct(n)agg處水解，從而將構(gòu)建體切割成兩部分。活性通過由納米孔隙提供的單分子測量測定，其中完全復(fù)合體產(chǎn)生較深和較長的事件特征，而產(chǎn)物產(chǎn)生較快和/或較淺的事件特征，如圖11中所描繪的。

在另一實(shí)施方式中，骨架:融合體:有效負(fù)載構(gòu)建體的融合分子包含兩個(gè)或更多個(gè)用于檢測和定量酶活性的可切割接頭。在代表性實(shí)例(圖12)中，融合體包含：i)易被核酸內(nèi)切酶eco81i水解降解且與dna骨架相鄰的dna序列cct(n)agg，和ii)mmp9-敏感肽序列sgkgprqita。以這種方式，單一試劑可以用于檢測mmp-9或eco81i的存在。

在另一實(shí)施方式中，融合分子的骨架-連接位點(diǎn)可以是本身為骨架-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核酸或多肽。在一些實(shí)施方式中，融合體的骨架-結(jié)合結(jié)構(gòu)域是形成蛋白質(zhì)的功能部分的肽序列，雖然結(jié)合結(jié)構(gòu)域不必須是蛋白質(zhì)。對于核酸，例如，存在特異性地識(shí)別并結(jié)合序列(基序)(如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、胸腺嘧啶-胸腺嘧啶二聚體)和某些二級(jí)結(jié)構(gòu)(如彎曲的核苷酸和具有單鏈斷裂的序列)的蛋白質(zhì)。

在一些方面，融合體的骨架-結(jié)構(gòu)域包括引起或有助于識(shí)別和結(jié)合的化學(xué)修飾。例如，甲基化的dna序列可以被轉(zhuǎn)錄因子、dna甲基轉(zhuǎn)移酶或者甲基化修復(fù)酶識(shí)別。在其它實(shí)施方式中，生物素可以被結(jié)合到抗生物素蛋白家族成員中，并被其識(shí)別。在此類實(shí)施方式中，生物素形成融合體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，且抗生物素蛋白或抗生物素蛋白家族成員是融合體上的聚合物骨架-結(jié)合結(jié)構(gòu)域。由于其結(jié)合互補(bǔ)性，融合體結(jié)合結(jié)構(gòu)域和聚合物骨架結(jié)構(gòu)域可以顛倒，使得融合體結(jié)合結(jié)構(gòu)域變?yōu)榫酆衔锕羌芙Y(jié)合結(jié)構(gòu)域，反之亦然。

能夠特異性地識(shí)別核苷酸結(jié)合基序的分子，尤其是蛋白質(zhì)，是本領(lǐng)域中已知的。例如，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域如螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋、鋅指、亮氨酸拉鏈、翼狀螺旋、翼狀螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋、螺旋-環(huán)-螺旋和hmg盒已知能夠結(jié)合核苷酸序列。

在一些方面中，融合體結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以是鎖核酸(lna)、橋接的核酸(bna)、所有類型的蛋白質(zhì)核酸(例如bispnas、γ-pna)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(talen)、成簇的規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列(crispr)或適體(如dna、rna、蛋白質(zhì)或其組合)。

在一些方面中，融合體結(jié)合結(jié)構(gòu)域是dna結(jié)合蛋白(例如鋅指蛋白)、抗體片段(fab)、化學(xué)合成的粘合劑(例如pna、lna、talens或crispr)或合成聚合物支架中的化學(xué)修飾(即反應(yīng)性部分)中的一個(gè)或多個(gè)(例如，硫醇鹽、生物素、胺、羧酸酯)。

在一些實(shí)施方式中，聚合物骨架包括用于酶活性多重分析的融合體-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的序列，其中各結(jié)構(gòu)域具有包含用于感興趣的目標(biāo)酶的獨(dú)特可切割接頭的獨(dú)特的融合體:有效負(fù)載。

目標(biāo)分子和條件

樣品中存在的酶活性可以指示生物體的毒素、障礙或其它條件。例如，蛋白酶是人體中發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)廣泛的正常人體生理過程的極其重要的分子，包括傷口愈合、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞凋亡。因?yàn)槠湓谌梭w內(nèi)的重要作用，異常的蛋白酶活性與多種疾病狀態(tài)相關(guān)聯(lián)，包括但不限于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、阿爾茲海默病、心血管疾病和廣泛的惡性腫瘤。蛋白酶在幾乎所有人體液和組織中發(fā)現(xiàn)，且其活性水平可以給出病癥存在的信號(hào)。

我們的分析的價(jià)值在于其提供檢測通過破壞化學(xué)鍵(例如，通過水解或一些其它方式)切割其相關(guān)的特定可切割接頭的任何活性酶(包括蛋白酶)的單分子方法。

能夠酶促修飾其可切割接頭區(qū)域的目標(biāo)分子可以是水解酶。在一些實(shí)施方式中，水解酶可以是來自蛋白酶、核酸內(nèi)切酶、糖基化酶、酯酶、核酸酶、磷酸二酯酶、脂肪酶、磷酸酶的亞類或水解酶的任何其它亞類。

在其它實(shí)施方式中，能夠酶促修飾其可切割接頭區(qū)域的目標(biāo)分子可以是裂解酶。在一些實(shí)施方式中，裂解酶可以是來自七個(gè)亞類中的任何一個(gè)：切割碳-碳鍵的裂解酶，如脫羧酶(酶學(xué)委員會(huì)(ec)4.1.1)、醛裂解酶(ec4.1.2)、含氧酸裂解酶(ec4.1.3)及其它(ec4.1.99)；切割碳-氧鍵的裂解酶，如脫水酶(ec4.2)；切割碳-氮鍵的裂解酶(ec4.3)；切割碳-硫鍵的裂解酶(ec4.4)；切割碳-鹵鍵的裂解酶(ec4.5)；切割磷-氧鍵的裂解酶，如腺苷酸環(huán)化酶和鳥苷酸環(huán)化酶(ec4.6)；和其它裂解酶，如亞鐵螯合酶(ec4.99)。

在其它實(shí)施方式中，骨架:融合體:有效負(fù)載構(gòu)建體內(nèi)的融合分子的可切割接頭區(qū)域暴露于待檢測的目標(biāo)條件。在一個(gè)實(shí)施方式中，目標(biāo)條件能夠通過暴露于10nm-550nm波長范圍內(nèi)的光而光解修飾可切割接頭。

促進(jìn)可切割接頭內(nèi)的鍵斷裂的光暴露條件可以與多種不同的健康危害、條件或者引起疾病或促進(jìn)疾病的狀態(tài)相關(guān)。

來自太陽的紫外(uv)光已知與多種人體狀況強(qiáng)相關(guān)，且同溫層中臭氧隨時(shí)間的消耗被認(rèn)為導(dǎo)致到達(dá)地球表面的紫外輻射的水平提高。

uv輻射在一個(gè)人的一生中是累積的，且已經(jīng)證明是黑素瘤(一種致死形式的皮膚癌)的主要影響因素。另外，uv光對于人眼具有深遠(yuǎn)的影響，且已經(jīng)證明增加視網(wǎng)膜退化以及是重要的白內(nèi)障風(fēng)險(xiǎn)因子。

在其它實(shí)施方式中，能夠化學(xué)修飾可切割接頭的目標(biāo)條件是通過暴露于親核或堿性試劑、親電子或酸性試劑、還原試劑、氧化試劑或有機(jī)金屬化合物。

能夠化學(xué)修飾可切割接頭的目標(biāo)條件的檢測具有許多用途，包括檢測指示毒理學(xué)的變化的過程、地表水污染或用于生物有害或生物毒素檢測。

在一個(gè)實(shí)施方式中，能夠化學(xué)修飾可切割接頭的目標(biāo)條件是酸性ph。公知的是局部酸性條件與各種疾病狀態(tài)如腫瘤、局部缺血和炎癥相關(guān)。更特別地，在腫瘤組織中，酸性的細(xì)胞外ph是快速分裂的腫瘤細(xì)胞的無氧糖酵解的結(jié)果，且是腫瘤微環(huán)境的主要標(biāo)志。

納米孔隙裝置

如所提供的納米孔隙裝置包括至少在將其內(nèi)部空間分為兩個(gè)體積的結(jié)構(gòu)中形成通孔的孔隙，以及至少配置為識(shí)別穿過孔隙的物體(例如通過檢測指示物體的參數(shù)的變化)的傳感器。用于本文所述的方法的納米孔隙裝置也公開于通過引用全文并入的pct公開wo/2013/012881中。

納米孔隙裝置中的孔隙是納米級(jí)或微米級(jí)的。在一個(gè)方面，每個(gè)孔隙的大小允許小或大分子或者微生物通過。在一個(gè)方面，每個(gè)孔隙直徑至少約1納米?？蛇x地，每個(gè)孔隙直徑至少約2納米、3納米、4納米、5納米、6納米、7納米、8納米、9納米、10納米、11納米、12納米、13納米、14納米、15納米、16納米、17納米、18納米、19納米、20納米、25納米、30納米、35納米、40納米、45納米、50納米、60納米、70納米、80納米、90納米或100納米。

在一個(gè)方面，孔隙直徑不超過約100納米?？蛇x地，孔隙直徑不超過約95納米、90納米、85納米、80納米、75納米、70納米、65納米、60納米、55納米、50納米、45納米、40納米、35納米、30納米、25納米、20納米、15納米或10納米。

在一個(gè)方面，孔隙直徑在約1納米和約100納米之間，或者可選地，在約2納米和約80納米，或在約3納米和約70納米，或在約4納米和約60納米，或在約5納米和約50納米，或在約10納米和約40納米，或在約15納米和約30納米之間。

在一些方面中，納米孔隙裝置進(jìn)一步包括用于將聚合物骨架跨孔隙移動(dòng)的手段和/或用來識(shí)別穿過孔隙的物體的手段。進(jìn)一步的細(xì)節(jié)在下面提供，以雙孔隙裝置為背景描述。

與單孔隙納米孔隙裝置相比，雙孔隙裝置可以更容易配置從而提供聚合物骨架跨孔隙運(yùn)動(dòng)的速度和方向的良好控制。

在一個(gè)實(shí)施方式中，納米孔隙裝置包括多個(gè)腔室，各腔室通過至少一個(gè)孔隙與相鄰的腔室連通。在這些孔隙中，兩個(gè)孔隙(即第一孔隙和第二孔隙)被布置為使得允許至少一部分聚合物骨架移出第一孔隙并進(jìn)入第二孔隙。此外，所述裝置包括能夠在運(yùn)動(dòng)過程中鑒別聚合物骨架的各孔隙處的傳感器。在一個(gè)方面中，該鑒別需要確定聚合物骨架的單個(gè)成分。在另一個(gè)方面中，該鑒別需要確定與聚合物骨架結(jié)合的融合體:有效負(fù)載分子。當(dāng)采用單一傳感器時(shí)，該單一傳感器可包含兩個(gè)布置在孔隙兩端的用于測量跨孔隙離子電流的電極。在另一個(gè)實(shí)施方式中，單一傳感器包含電極以外的部件。

在一個(gè)方面中，所述裝置包括通過兩個(gè)孔隙連接的三個(gè)腔室。具有三個(gè)以上腔室的裝置可以很容易地設(shè)計(jì)以在三腔室裝置任一側(cè)或在三個(gè)腔室中任何兩個(gè)腔室之間包括一個(gè)或多個(gè)額外的腔室。同樣地，裝置中可以包括超過兩個(gè)連接腔室的孔隙。

在一個(gè)方面中，兩個(gè)相鄰腔室之間可以有兩個(gè)或更多個(gè)孔隙，以允許多個(gè)聚合物骨架同時(shí)從一個(gè)腔室移動(dòng)到下一個(gè)腔室。這樣的多孔隙設(shè)計(jì)可以提高裝置中酶活性分析的通量。對于多重分析，一個(gè)腔室可以具有用于一個(gè)目標(biāo)類型的可切割接頭，且另一腔室可以具有用于另一目標(biāo)類型的不同可切割接頭，其中樣品在納米孔隙探測之前暴露于所有腔室。

在一些方面中，所述裝置進(jìn)一步包括用于將聚合物骨架從一個(gè)腔室移動(dòng)到另一個(gè)腔室的手段。在一個(gè)方面中，該移動(dòng)導(dǎo)致同時(shí)跨第一孔隙和第二孔隙兩者加載聚合物骨架。在另一個(gè)方面中，所述手段進(jìn)一步使聚合物骨架能夠在同一方向上通過兩個(gè)孔隙移動(dòng)。

例如，在三腔室兩孔隙裝置(“兩孔隙”裝置)中，每個(gè)腔室可以包含用于連接到電源的電極，從而可以在腔室之間跨各個(gè)孔隙施加單獨(dú)的電壓。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，提供了包括上腔室、中腔室和下腔室的裝置，其中上腔室通過第一孔隙與中腔室連通，且中腔室通過第二孔隙與下腔室連通。這種裝置可以具有此前在名稱為雙重孔隙裝置(dual-poredevice)的美國公開no.2013-0233709中披露的任何尺寸或其他特征，該文獻(xiàn)在此通過引用整體并入本文。

在一個(gè)方面中，每個(gè)孔隙直徑為至少約1納米?？蛇x地，每個(gè)孔隙直徑為至少約2納米、3納米、4納米、5納米、6納米、5納米、7納米、8納米、9納米、10納米、11納米、12納米、13納米、14納米、15納米、16納米、17納米、18納米、19納米、20納米、25納米、30納米、35納米、40納米、45納米、50納米、60納米、70納米、80納米、90納米或100納米。

在一個(gè)方面中，各孔隙直徑不超過約100納米?？蛇x地，孔隙直徑不超過約95納米、90納米、85納米、80納米、75納米、70納米、65納米、60納米、55納米、50納米、45納米、40納米、35納米、30納米、25納米、20納米、15納米或10納米。

在一個(gè)方面中，孔隙直徑在約1納米和約100納米之間，或者可選地在約2納米和約80納米之間，或在約3納米和約70納米之間，或在約4納米和約60納米之間，或在約5納米和約50納米之間，或在約10納米和約40納米之間，或在約15納米和約30納米之間。

在一些方面中，孔隙基本上呈圓形。本文所用的“基本上圓形”是指至少約80或90％為圓柱體形式的形狀。在一些實(shí)施方式中，孔隙形狀為方形、矩形、三角形、橢圓形或六角形。

在一個(gè)方面中，孔隙具有約1nm至約10,000nm之間，或者可選地，約2nm至約9,000nm之間或約3nm至約8,000nm之間等的深度。

在一些方面中，納米孔隙穿過膜延伸。例如，孔隙可以是插入脂質(zhì)雙層膜中的蛋白質(zhì)通道，或者其也可以通過鉆孔、刻蝕或以其他方式通過固態(tài)基質(zhì)(如二氧化硅、氮化硅、石墨烯或由這些或其他材料的組合形成的層)形成孔隙來工程化。納米孔隙調(diào)整大小以允許骨架:融合體:有效負(fù)載或者這一分子在酶活性后的產(chǎn)物穿過孔隙。在其它實(shí)施方式中，孔隙的臨時(shí)阻斷對于分子類型的區(qū)分可能是所需的。

在一些方面中，納米孔隙的長度或深度足夠大，從而形成連接兩個(gè)在其它方面分隔的體積的通道。在一些此類方面中，每個(gè)孔隙的深度大于100納米、200納米、300納米、400納米、500納米、600納米、700納米、800納米或900納米。在一些方面中，每個(gè)孔隙的深度不超過2000納米或1000納米。

在一個(gè)方面中，孔隙以約10納米和約1000納米之間的距離間隔開。在一些方面中，孔隙之間的距離大于1000納米、2000納米、3000納米、4000納米、5000納米、6000納米、7000納米、8000納米或9000納米。在一些方面中，孔隙間距不超過30000納米、20000納米或10000納米。在一個(gè)方面中，孔隙間距為至少約10納米，或者可選地為至少約20納米、30納米、40納米、50納米、60納米、70納米、80納米、90納米、100納米、150納米、200納米、250納米或300納米。在另一個(gè)方面中，孔隙間距不超過約1000納米、900納米、800納米、700納米、600納米、500納米、400納米、300納米、250納米、200納米、150納米或100納米。

在又一個(gè)方面中，孔隙之間的距離在約20納米和約800納米之間，在約30納米和約700納米之間，在約40納米和約500納米之間，或在約50納米和約300納米之間。

兩個(gè)孔隙可以以任何位置排列，只要它們允許腔室之間的流體連通并具有規(guī)定的大小和間距。在一個(gè)方面中，孔隙的布置使得它們之間沒有直接堵塞。仍然在一個(gè)方面中，孔隙基本上是同軸的。

在一個(gè)方面中，裝置在腔室中具有連接到一個(gè)或多個(gè)電源的電極。在一些方面中，電源包含電壓鉗或膜片鉗，其可以提供跨各孔隙的電壓并獨(dú)立地測量通過各孔隙的電流。在這個(gè)方面中，電源和電極配置可以將中腔室設(shè)置成兩個(gè)電源的共同地線。在一個(gè)方面中，一個(gè)或多個(gè)電源配置為在上腔室(腔室a)和中腔室(腔室b)之間施加第一電壓v1，和在中腔室和下腔室(腔室c)之間施加第二電壓v2。

在一些方面中，第一電壓v1和第二電壓v2是獨(dú)立可調(diào)的。在一個(gè)方面中，中腔室被調(diào)節(jié)為相對于兩個(gè)電壓的地電壓。在一個(gè)方面中，中腔室包含用于在各個(gè)孔隙和中腔室中的電極之間提供電導(dǎo)的介質(zhì)。在一個(gè)方面中，中腔室包含用于在各個(gè)孔隙和中腔室中的電極之間提供電阻的介質(zhì)。保持相對于納米孔隙電阻足夠小的這種電阻可用于跨孔隙的兩個(gè)電壓和電流解耦聯(lián)，這有助于電壓的獨(dú)立調(diào)節(jié)。

電壓的調(diào)節(jié)可用于控制腔室內(nèi)帶電顆粒的運(yùn)動(dòng)。例如，當(dāng)兩個(gè)電壓設(shè)置為極性相同時(shí)，適當(dāng)帶電的顆?？梢詮纳锨皇翼樞虻匾苿?dòng)到中腔室和到下腔室，或者反過來。在一些方面，當(dāng)兩個(gè)電壓被設(shè)置成相反極性時(shí)，帶電顆粒可以從上腔室或下腔室移動(dòng)到中腔室并保持在那里。

裝置中電壓的調(diào)節(jié)可以特別地用于大分子如帶電聚合物骨架的運(yùn)動(dòng)的控制，該帶電聚合物骨架足夠長以同時(shí)跨兩個(gè)孔隙。在這個(gè)方面，分子移動(dòng)的方向和速度可以通過電壓的相對幅度和極性來控制，如下所述。

所述裝置可以包含適合容納液體樣品(特別是生物樣品)的材料和/或適合于納米加工的材料。在一個(gè)方面中，此類材料包括介電材料，例如但不限于硅、氮化硅、二氧化硅、石墨烯、碳納米管、tio2、hfo2、al2o3或其它金屬層，或這些材料的任何組合。在一些方面中，例如，約0.3納米厚的單片石墨烯膜可用作孔隙承載膜。

作為微流體裝置且容納雙孔隙微流體芯片設(shè)施的裝置可以通過多種手段和方法來制造。對于由兩個(gè)平行的膜構(gòu)成的微流體芯片，兩個(gè)膜可以同時(shí)通過單波束鉆孔以形成兩個(gè)同心孔隙，盡管與任何適合的校準(zhǔn)技術(shù)協(xié)同在膜的各側(cè)使用不同的波束也是可能的。一般說來，外殼確保腔室a-c的密封分離。

在一個(gè)方面中，所述裝置包含微流體芯片(標(biāo)記為“雙核心芯片”)，其由通過間隔體連接的兩個(gè)平行的膜構(gòu)成。每個(gè)膜包含通過膜中心用單波束鉆孔形成的孔隙。進(jìn)一步地，所述裝置優(yōu)選具有用于芯片的外殼或聚碳酸酯外殼。外殼確保腔室a-c的密封分離，并為電極提供最小接入電阻以確保每個(gè)電壓主要跨各孔隙施加。

更具體地說，孔隙-承載膜可以用具有5-100納米厚的硅、氮化硅或二氧化硅窗口的透射電子顯微(tem)格柵制造。間隔體可采用絕緣體(如su-8、光刻膠、pecvd氧化物、ald氧化物、ald氧化鋁)或蒸鍍的金屬材料(如銀、金或鉑)，且占據(jù)在膜之間的腔室b的否則為水性部分中的小空間而用于分隔膜。支持器置于由腔室b的最大體積部分構(gòu)成的水性浴中。腔室a和c可以通過更大直徑的通道(對于低接入電阻)達(dá)到，這導(dǎo)致膜密封。

聚焦的電子或離子束可以用來通過膜鉆出孔隙，從而自然對準(zhǔn)?？紫兑部梢酝ㄟ^對每層施加適當(dāng)束聚焦來雕刻(收縮)至更小尺寸。任何單一納米孔隙鉆孔方法也可以用來在兩個(gè)膜中鉆出孔隙對，考慮對于給定方法和膜的厚度可能的鉆孔深度。預(yù)鉆微孔隙到規(guī)定的深度和然后通過膜的剩余部分鉆出納米孔隙對于進(jìn)一步優(yōu)化膜厚度也是可能的。

通過在裝置的孔隙處存在的電壓，帶電分子可以通過腔室之間的孔隙移動(dòng)。移動(dòng)的速度和方向可以通過電壓的大小和極性進(jìn)行控制。此外，由于兩個(gè)電壓可以各自獨(dú)立地調(diào)節(jié)，所以帶電分子的移動(dòng)方向和速度可以在各腔室中精細(xì)地控制。

一個(gè)例子涉及帶電聚合物骨架，例如dna，其長度大于包括兩個(gè)孔隙的深度加兩個(gè)孔隙之間的距離的綜合距離。例如1000bp的dsdna長度約為340納米，且顯著大于間隔20納米的兩個(gè)10納米深孔隙跨越的40納米距離。第一步驟中，將多核苷酸加載到上腔室或下腔室中。由于其在ph約7.4的生理?xiàng)l件下的負(fù)電荷，多核苷酸可以跨在其上施加電壓的孔隙移動(dòng)。因此，第二步驟中，相同極性且大小相同或相近的兩個(gè)電壓施加于孔隙以順序地跨兩個(gè)孔隙移動(dòng)多核苷酸。

大致在多核苷酸到達(dá)第二孔隙的時(shí)候，可以改變一個(gè)或兩個(gè)電壓。由于兩個(gè)孔隙之間的距離選擇為比多核苷酸的長度短，當(dāng)多聚核苷酸到達(dá)第二孔隙時(shí)，它也在第一孔隙中。因此，在第一孔隙處的電壓極性的迅速改變將產(chǎn)生將多核苷酸拉離第二孔隙的力。

假設(shè)兩個(gè)孔隙具有相同的電壓-力影響，且|v1|＝|v2|+δv，則值δv＞0(或＜0)可以在v1(或v2)方向上進(jìn)行調(diào)節(jié)以獲得可調(diào)的運(yùn)動(dòng)。在實(shí)踐中，雖然各個(gè)孔隙處電壓誘導(dǎo)的力不會(huì)由于v1＝v2而相同，校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)可以確定對于給定的雙孔隙芯片產(chǎn)生相等的拉力的適當(dāng)偏置電壓；且圍繞該偏置電壓的變化然后可以用于定向控制。

如果，在此時(shí)，第一孔隙處電壓誘導(dǎo)的力的大小小于第二孔隙處電壓誘導(dǎo)的力的大小，則多核苷酸繼續(xù)穿越兩個(gè)孔隙移向第二孔隙，但速度較低。在這個(gè)方面，很容易理解，多核苷酸運(yùn)動(dòng)的速度和方向可以通過兩個(gè)電壓的極性和大小來控制。正如下面將進(jìn)一步描述的，運(yùn)動(dòng)的這種精細(xì)控制有著廣泛的應(yīng)用。為定量酶活性，雙孔隙裝置實(shí)施方式的功用是在受控的遞送和探測過程中，可切割接頭的修飾或切割可以重復(fù)地測量，以對檢測結(jié)果增加置信度。另外，超過一個(gè)融合體:有效負(fù)載可以沿骨架在不同位點(diǎn)處添加，以同時(shí)檢測超過一種酶的活性(多重分析)。

因此，在一個(gè)方面中，提供了用于控制帶電聚合物骨架通過納米孔隙裝置的運(yùn)動(dòng)的方法。所述方法包括將包含帶電聚合物骨架的樣品加載到上述任一實(shí)施方式的裝置的上腔室、中腔室或下腔室之一中，其中該裝置被連接到用于在上腔室與中腔室之間提供第一電壓和在中腔室與下腔室之間提供第二電壓的一個(gè)或多個(gè)電源；設(shè)置初始第一電壓和初始第二電壓以使聚合物骨架在腔室之間移動(dòng)，從而使聚合物骨架跨第一和第二孔隙定位；且調(diào)節(jié)第一電壓和第二電壓以使兩個(gè)電壓都產(chǎn)生將帶電聚合物骨架拉離中腔室的力(電壓競爭模式)，其中兩個(gè)電壓在受控條件下大小不同，以使得帶電聚合物骨架沿任一方向且以受控的方式跨兩個(gè)孔隙移動(dòng)。

在一個(gè)方面中，含帶電聚合物骨架的樣品加載到上腔室中，且初始第一電壓設(shè)置為將帶電聚合物骨架從上腔室拉到中腔室，且初始第二電壓設(shè)置為將聚合物骨架從中腔室拉到下腔室。類似地，樣品可以初始加載到下腔室中，且?guī)щ娋酆衔锕羌芸梢岳街星皇液蜕锨皇摇?/p>

在另一個(gè)方面中，含帶電聚合物骨架的樣品加載到中腔室中；初始第一電壓設(shè)置成將帶電聚合物骨架從中腔室拉到上腔室；且初始第二電壓設(shè)置成將帶電聚合物骨架從中腔室拉到下腔室。

在一個(gè)方面中，在步驟(c)中對第一電壓和第二電壓的實(shí)時(shí)或在線調(diào)節(jié)采用專用的硬件和軟件以高達(dá)數(shù)百兆赫的時(shí)鐘頻率通過主動(dòng)控制或反饋控制進(jìn)行。第一電壓或第二電壓或兩者的自動(dòng)控制是基于第一或第二或兩個(gè)離子電流測量的反饋。

傳感器

如上所述，在各個(gè)方面中，納米孔隙裝置還包括一個(gè)或多個(gè)傳感器用于完成目標(biāo)分子(例如，酶)的活性狀態(tài)的檢測。

該裝置中使用的傳感器可以是任何適合用于確認(rèn)目標(biāo)分子或目標(biāo)條件對可切割接頭的切割的傳感器。例如，傳感器可以配置為通過測量與聚合物相關(guān)的電流、電壓、ph值、光學(xué)特征或停留時(shí)間來鑒別聚合物(例如，聚合物骨架)。在其他方面，傳感器可以被配置為鑒別聚合物的一種或多種單個(gè)組分或者與靶多核苷酸結(jié)合或連接的一種或多種組分。傳感器可以由配置為檢測可測量參數(shù)的變化的任何部件形成，其中此變化指示聚合物、聚合物的組分或優(yōu)選地與聚合物結(jié)合或連接的組分。在一個(gè)方面中，傳感器包括布置在孔隙兩側(cè)的一對電極以測量在分子或其他實(shí)體(特別是聚合物骨架)移動(dòng)通過孔隙時(shí)的跨孔隙離子電流。在某些方面，在通過孔隙的聚合物骨架片段結(jié)合于融合體:有效負(fù)載分子時(shí)，跨孔隙離子電流發(fā)生可測量的變化。電流的此類變化對應(yīng)于，例如，存在的融合體:有效負(fù)載分子的存在、不存在和/或大小以可預(yù)測的、可測量的方式發(fā)生改變。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，傳感器包括施加電壓并用于測量跨納米孔隙的電流的電極。分子通過納米孔隙的轉(zhuǎn)位提供了電阻抗(z)，其根據(jù)歐姆定律，v＝iz，影響通過納米孔隙的電流，其中v是施加的電壓，i是通過納米孔隙的電流，和z是阻抗。相反地，監(jiān)測電導(dǎo)g＝1/z以指示和定量納米孔隙事件。當(dāng)分子在電場中(例如，在施加的電壓下)轉(zhuǎn)位通過納米孔隙時(shí)的結(jié)果是，當(dāng)進(jìn)一步分析電流信號(hào)時(shí)，可能與穿過納米孔隙的分子相關(guān)的電流特征。

當(dāng)使用來自電流特征的停留時(shí)間量度時(shí)，可以基于穿過探測設(shè)備所需的時(shí)間長度將組分的大小與特定組分相關(guān)聯(lián)。

在一個(gè)實(shí)施方式中，在納米孔隙裝置中提供的傳感器測量聚合物、聚合物的組分(或單元)或者結(jié)合或連接到聚合物的組分的光學(xué)特征。這種測量的一個(gè)實(shí)例包括通過紅外(或紫外)光譜鑒定特定單元特有的吸收帶。

在一些實(shí)施方式中，傳感器是電傳感器。在一些實(shí)施方式中，傳感器檢測熒光特征?？紫冻隹谔幍妮椛湓纯捎糜跈z測該特征。

與背景區(qū)分

在一些方面中，存在于樣品中的目標(biāo)分子可以是來自具有大的背景分子群體的原始的(甚至過濾的)天然液體(血液、唾液、尿液等)。這類背景分子，當(dāng)在施加的正電壓下充分帶負(fù)電時(shí)，穿過納米孔隙。在一些情況中，這樣的納米孔隙事件可能看起來像骨架:融合體:有效負(fù)載構(gòu)建體或者在可切割接頭的切割后的產(chǎn)物(骨架、有效負(fù)載)。因此，這些背景分子可以產(chǎn)生假陽性，從而產(chǎn)生高檢測錯(cuò)誤率。添加足夠的樣品制備以除去較大的分子將有助于這一點(diǎn)，但是產(chǎn)生假陽性事件的背景分子仍然存在。

為了提供背景分子和骨架分子(具有或不具有融合體:有效負(fù)載的附接)之間的區(qū)分，可以使用骨架標(biāo)記方案。骨架標(biāo)記方案也公開于u.s.臨時(shí)申請no.61/993,985中，其通過引用全文并入。

具體地，將標(biāo)記或標(biāo)記的序列與聚合物骨架結(jié)合以提供可用于鑒別已經(jīng)轉(zhuǎn)位通過納米孔隙的聚合物骨架的存在和/或身份的獨(dú)特電流特征。在相同的事件特征內(nèi)，融合體:有效負(fù)載的存在或不存在指示可切割接頭是否在該分子上被修飾。

在另一實(shí)施方式中，單獨(dú)的骨架的長度提供了足以區(qū)別于背景的區(qū)別性特征，同時(shí)也保持骨架:融合體:有效負(fù)載和單獨(dú)的骨架(在可切割接頭的切割后)之間的區(qū)分能力。

對檢測分配統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性

在一些實(shí)施方式中，對隨時(shí)間記錄的傳感器測量值的集進(jìn)行匯總并應(yīng)用數(shù)學(xué)工具以對疑似存在于樣本中的目標(biāo)分子或條件的檢測分配數(shù)字置信度值，如前面章節(jié)中所詳細(xì)描述的。

最近開發(fā)出基于納米孔隙事件群體特征的差異將分子類型與背景(即其他分子類型)區(qū)分的定量方法(morin,t.j.等,“nanopore-basedtargetsequencedetection”2015年12月31日提交到ploson)。這種區(qū)分方法意味著可以在變化類型的其他背景分子的存在下檢測特定分子類型，并且可以賦予檢測的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(例如，以99％置信度的試劑x的檢測)。為將該方法應(yīng)用到下面提供的實(shí)施例，我們這里首先概述該方法。

一般來說，在孔隙上方的腔室中有兩類分子：類型1全部是背景分子，而類型2是感興趣的分子。例如，在下面的實(shí)施例3中，dna-有效負(fù)載可以被認(rèn)為是類型2分子，其中單獨(dú)的dna被認(rèn)為是背景(類型1)?；趤碜詫?shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)，我們確定存在于類型2事件的顯著部分中的和存在于類型1事件的相對較小部分中的事件特征標(biāo)準(zhǔn)。如果對于某事件滿足特征標(biāo)準(zhǔn)，則該事件被“標(biāo)記”為是類型2。特征可以取決于δg、持續(xù)時(shí)間、每個(gè)事件內(nèi)的級(jí)別的數(shù)量和特征和/或從事件信號(hào)計(jì)算的任何其它數(shù)值或值的組合。我們將p定義為捕獲事件是類型2的概率。在沒有類型2分子的對照實(shí)驗(yàn)中p＝0，和在具有類型2分子的實(shí)驗(yàn)中p>0，但其值是未知的。我們定義假陽性概率q1＝pr(標(biāo)記的事件|類型1事件)。在不具有類型2分子的對照實(shí)驗(yàn)或?qū)嶒?yàn)組中，從大量的捕獲事件以良好準(zhǔn)確性確定q1。在確定本體溶液中是否存在類型2分子的檢測實(shí)驗(yàn)中，捕獲事件被標(biāo)記的概率是p的函數(shù)，且可以近似計(jì)算為：

q(p)＝(標(biāo)記事件數(shù))/n

在該公式中，n是事件的總數(shù)。可以用qsd(p)＝2.57*sqrt{q(p)*(1-q(p))/n}計(jì)算99％置信區(qū)間q(p)±qsd(p)，其中sqrt{}為平方根函數(shù)。在實(shí)驗(yàn)的過程中，隨著事件數(shù)n的增加，q(p)的值收斂和不確定性界限減弱。作為記錄時(shí)間的函數(shù)的q(p)±qsd(p)的曲線圖示出了對于每種試劑類型它是如何演化的(對于實(shí)施例3的圖19b)。在沒有類型2分子的對照實(shí)驗(yàn)中，觀察到q(0)＝q1。在類型2分子已知以某種概率p*>0存在的對照實(shí)驗(yàn)中，可以在檢測實(shí)驗(yàn)中使用計(jì)算的值q(p*)來確定是否不存在類型2分子，如以下所定義的。

在檢測實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)以下標(biāo)準(zhǔn)為真時(shí)，類型2分子以99％的置信度存在：

q(p)-qsd(p)>q1(1)

如果上述標(biāo)準(zhǔn)為真，我們得出結(jié)論p>0；如果其是非真的，我們不能說p>0。在檢測實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)以下標(biāo)準(zhǔn)為真時(shí)，類型2分子以99％的置信度不存在：

q(p)+qsd(p)<q(p*)(2)

如果上述標(biāo)準(zhǔn)為真，我們得出結(jié)論p＝0；否則，我們不能作出結(jié)論。框架用于以下提供的實(shí)施例中。

估算目標(biāo)分子濃度

在一些實(shí)施方式中，對隨時(shí)間記錄的傳感器測量值的集進(jìn)行匯總并應(yīng)用數(shù)學(xué)工具以估計(jì)疑似存在于樣品中的目標(biāo)分子或條件的濃度。

在一些實(shí)施方式中，該過程(將樣品與骨架:融合體:有效負(fù)載試劑一起孵育并進(jìn)行納米孔隙試驗(yàn))可以在改變骨架、融合體、有效負(fù)載和/或疑似存在于樣品中的目標(biāo)分子或條件中的一個(gè)或多個(gè)的濃度的同時(shí)重復(fù)。數(shù)據(jù)集然后可以合并以收集更多的信息。在一個(gè)實(shí)施方式中，活性酶的總濃度通過對匯總的數(shù)據(jù)集應(yīng)用數(shù)學(xué)工具而估計(jì)。

按照文獻(xiàn)中的方法(wang,hongyun等,“measuringandmodelingthekineticsofindividualdna-dnapolymerasecomplexesonananopore.”acsnano7,no.5(may28,2013):3876–86.doi:10.1021/nn401180j；benner,seico等,“sequence-specificdetectionofindividualdnapolymerasecomplexesinrealtimeusingananoipore.”naturenanotechnology2,no.11(october28,2007):718–24(doi:10.1038/nnano.2007.344)，可以對納米孔隙數(shù)據(jù)應(yīng)用生物物理模型以量化目標(biāo)酶與其底物(例如，可切割接頭或可切割結(jié)構(gòu)域)之間的結(jié)合、鍵斷裂和隨后的解離動(dòng)力學(xué)。

在我們的分析中，納米孔隙采樣并測量來自本體相的單個(gè)分子。在目標(biāo)分子的存在下，骨架:融合體:有效負(fù)載內(nèi)的可切割接頭以與目標(biāo)的濃度成比例的某種比率被修飾(例如，切割)。在相對于骨架:融合體:有效負(fù)載濃度的高目標(biāo)濃度下，切割將快速地進(jìn)行，且所有可切割接頭被切割，導(dǎo)致僅骨架和有效負(fù)載分子以及任何其它背景分子的檢測。在相對于骨架:融合體:有效負(fù)載濃度的較低濃度下，切割將更緩慢地進(jìn)行，且在10分鐘記錄期內(nèi)，大多數(shù)骨架事件給出骨架:融合體:有效負(fù)載完整地穿過孔隙的信號(hào)。在相對于骨架:融合體:有效負(fù)載濃度的中等濃度下，非零百分比的骨架事件被標(biāo)示為完整骨架:融合體:有效負(fù)載，且這一百分比隨著反應(yīng)進(jìn)程完成而隨時(shí)間降低。

為估計(jì)總活性酶濃度，重復(fù)的實(shí)驗(yàn)可以用納米孔隙且每次使用從低(1pm)到高(100nm)的不同濃度的骨架:融合體:有效負(fù)載試劑進(jìn)行，其中目標(biāo)分子濃度通過使用共同樣品的一部分被保持。通過測量標(biāo)示為完整骨架:融合體:有效負(fù)載的骨架事件的百分比的時(shí)間演化，與引用的文獻(xiàn)中的那些相似的建?？蚣芸捎糜诙靠偯笣舛?。具體地，時(shí)間依賴性的測量用于wang,hongyun等,“measuringandmodelingthekineticsofindividualdna-dnapolymerasecomplexesonananopore.”acsnano7,no.5(may28,2013):3876–86.doi:10.1021/nn401180j中，具有明示地允許估算總酶濃度的模型。

為估計(jì)總活性酶濃度，可以實(shí)施多納米孔隙陣列。各納米孔隙將測量從低(1pm)到高(100nm)的不同濃度的骨架:融合體:有效負(fù)載試劑。通過平行地在各納米孔隙處測量標(biāo)示為完整骨架:融合體:有效負(fù)載的骨架事件的百分比的時(shí)間演化，與引用的文獻(xiàn)中的那些相似的建?？蚣芸捎糜诙靠偯笣舛?。

實(shí)施例

本技術(shù)進(jìn)一步參考以下實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)進(jìn)行定義。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的是許多改變可以在不背離本發(fā)明的范圍的情況下實(shí)行。

實(shí)施例1：dna骨架的納米孔隙檢測

固態(tài)納米孔隙是在分隔兩個(gè)水性體積的薄的固體膜中形成的納米級(jí)開口。電壓鉗放大器在測量通過開放孔隙的離子電流的同時(shí)施加跨膜的電壓v。與任何其他單分子傳感器不同，納米孔隙裝置可以以非常低的成本封裝成手持形式因子。當(dāng)單一帶電分子如雙鏈dna(dsdna)通過電泳被捕獲并被驅(qū)動(dòng)通過孔隙時(shí)，測量的電流偏移及電導(dǎo)偏移深度(δg＝δi/v)和持續(xù)時(shí)間被用于表征事件(圖17a)。

在實(shí)驗(yàn)期間記錄許多事件之后，分析事件的分布以表征相應(yīng)的分子。圖17b顯示在電壓v＝100mv(1mlicl)下通過27nm納米孔隙的3.2kbdsdna的事件特性。這兩個(gè)畫圓圈的代表性事件顯示：更寬的和更淺的事件對應(yīng)于展開地穿過的dna；以及更快的但更深的事件對應(yīng)于折疊地穿過的dna。對于～1kb和更短的dsdna，dna僅在展開的狀態(tài)下穿過孔隙。

實(shí)施例2：用于蛋白酶的包含可切割接頭的骨架:融合體:有效負(fù)載和用于核酸內(nèi)切酶的可切割接頭

為了通過試驗(yàn)證明我們的分析方法的目的，我們設(shè)計(jì)并建立了在單一融合分子內(nèi)包含兩個(gè)不同可切割接頭的單一構(gòu)建體，如圖12中所示的。利用這一單一構(gòu)建體，我們試圖證明核酸內(nèi)切酶活性的檢測，并獨(dú)立地證明蛋白酶活性的檢測。

dna骨架使用二苯并環(huán)辛炔(dbco)修飾的引物生成，從而有效地用dbco化學(xué)基團(tuán)標(biāo)記分子，該dbco化學(xué)基團(tuán)用于通過無銅“點(diǎn)擊”化學(xué)作用的偶聯(lián)目的(圖6)。pcr模板包括核酸內(nèi)切酶敏感序列，cc/t(n)agg(/代表切割位點(diǎn)，n代表任何dna核堿基c、g、t或a)。在核酸內(nèi)切酶活性分析中，一部分融合分子然后包含目標(biāo)dna序列(圖12a)。這一修飾的dna骨架隨后允許在37℃下與1000-倍過量的疊氮化物標(biāo)記的分子孵育過夜，該分子包含肽序列sgkgprqita(0.01m磷酸鈉+300mmnacl，ph7.4)。這一肽預(yù)先從噬菌體展示文庫分離并確定為對mmp9活性高度敏感(kridel,stevenj.等"substratehydrolysisbymatrixmetalloproteinase-9.journalofbiologicalchemistry276.23(2001):20572-20578)。在蛋白酶mmp9活性分析中，一部分融合分子然后包含目標(biāo)肽序列(圖12a)。骨架:融合體:有效負(fù)載分子由以下(從n-末端到c-末端)組成：dna骨架、dna融合體(包含在dna末端的核酸內(nèi)切酶序列可切割接頭)、疊氮化物化學(xué)操作、peg4、柔性gly-ser基序、mmp9-敏感肽序列sgkgprqita、柔性gly-ser基序、cys-5kdapeg和生物素(圖12a，由bio-synthesis,inc.,lewisville,tx合成)。

如所示圖12a的有效負(fù)載分子的成功連接通過用dna-特異性染料sybrgreen染色的emsa凝膠證實(shí)(圖13，道2，上條帶)。dna骨架與包括敏感可切割接頭的融合體:有效負(fù)載分子的偶聯(lián)產(chǎn)生～50％的所需產(chǎn)物(圖13,道2，上條帶)。為從單獨(dú)的未偶聯(lián)dna純化出純的偶聯(lián)構(gòu)建體，產(chǎn)物從聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行凝膠提取并按照制造商的說明重懸在酶活性緩沖液中(這一過程的結(jié)果，純dna-有效負(fù)載顯示于圖14，道1和3中)。

實(shí)施例3：納米孔隙檢測及dna、dna-有效負(fù)載和dna-有效負(fù)載-單鏈霉親和素的區(qū)分

單獨(dú)的500bpdna骨架用15nm納米孔隙(0.2nm,100mv,1mlicl,10mmtris,1mmedta,ph8.0)測量，從而在30分鐘中產(chǎn)生97個(gè)事件(圖18a)。很少的事件(8.3％)滿足至少1ns的深度(圖18b)。在從與納米孔隙相鄰的腔室除去dna后，添加0.2nmdna-有效負(fù)載試劑，其中dna-有效負(fù)載在此是指實(shí)施例2和圖12中所稱的復(fù)合體。dna-有效負(fù)載試劑在30分鐘內(nèi)產(chǎn)生190個(gè)事件，其中滿足至少1ns的深度的事件增加到21.1％(圖18b)。在除去dna-有效負(fù)載試劑后，已經(jīng)與單鏈霉親和素孵育的0.2nmdna-有效負(fù)載(圖13，道3，上條帶)添加到腔室用于納米孔隙測量，其中單鏈霉親和素在有效負(fù)載的末端結(jié)合于游離生物素(如圖6b中所示)。通過添加單鏈霉親和素，對于在18分鐘內(nèi)記錄的414個(gè)事件中的大多數(shù)，各dna-有效負(fù)載-單鏈霉親和素分子的增大的尺寸導(dǎo)致事件深度和持續(xù)時(shí)間的增加(圖18a)。該群體增加到43.5％的事件滿足至少1ns的深度(圖18b)。

從dna到dna-有效負(fù)載和然后到dna-有效負(fù)載-單鏈霉親和素，事件群體的視覺偏移(圖18a)與分子大小的增加一致。我們的用于在不同類型的其它背景分子的存在中檢測特定分子類型的定量方法可以應(yīng)用于這些數(shù)據(jù)，使得檢測的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性可以被分配。

如果dna被認(rèn)為是類型1和dna-有效負(fù)載被認(rèn)為是類型2，示例標(biāo)準(zhǔn)是如果δg>1ns，則標(biāo)記事件為類型2。單獨(dú)dna的群體可以用于計(jì)算q1＝0.082(8.2％)。dna-有效負(fù)載實(shí)驗(yàn)可以用作模擬檢測實(shí)驗(yàn)以通過應(yīng)用數(shù)學(xué)框架的公式(1)確定是否類型2分子存在。結(jié)果是0.211–0.076＝0.134>0.082，這意味著我們可以說類型2(dna-有效負(fù)載)分子以99％置信度存在。

接著，dna和dna-有效負(fù)載被認(rèn)為是類型1和dna-有效負(fù)載-單鏈霉親和素被認(rèn)為是類型2，且我們可以使用相同的標(biāo)準(zhǔn)(δg>1ns)以標(biāo)記事件為類型2。單獨(dú)dna和dna-有效負(fù)載群體可以用于確立q1＝0.211(使用兩個(gè)值0.082和0.211中的較大者，作為可行的假陽性概率)。如前所述，dna-有效負(fù)載-單鏈霉親和素群體可以用作模擬檢測實(shí)驗(yàn)，且我們通過應(yīng)用公式(1)測試是否類型2分子。結(jié)果是0.435–0.063＝0.372>0.211，這意味著我們可以說類型2(dna-有效負(fù)載-單鏈霉親和素)分子以99％置信度存在。

保持dna-有效負(fù)載-單鏈霉親和素為感興趣的類型2分子，我們也可以檢驗(yàn)其中我們應(yīng)用數(shù)學(xué)框架的公式(2)的模擬互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)。具體地，我們可以將dna-有效負(fù)載數(shù)據(jù)視為我們想要從其中知道是否較大體積的dna-有效負(fù)載-單鏈霉親和素不存在的“未知”試劑，我們再次使用標(biāo)準(zhǔn)(δg>1ns)以標(biāo)記事件為類型2。從dna-有效負(fù)載-單鏈霉親和素對照實(shí)驗(yàn)，我們得到q(p*)＝0.435。從“未知”(dna-有效負(fù)載)數(shù)據(jù)并應(yīng)用公式(2)，結(jié)果是0.211+0.076＝0.287<0.435，這意味著我們可以以99％置信度聲稱類型2(dna-有效負(fù)載-單鏈霉親和素)分子不存在于模擬“未知”試劑(dna-有效負(fù)載，無單鏈霉親和素)中。

實(shí)施例4：mmp9敏感分子構(gòu)建體的消化接著納米孔隙檢測

基質(zhì)金屬蛋白酶9(mmp9)是92kda細(xì)胞外基質(zhì)降解酶(ecm)，其已被發(fā)現(xiàn)參與廣泛的正常人體生理過程。ecm的及時(shí)降解是組織修復(fù)、形態(tài)發(fā)生和發(fā)育的重要特征。由于其在正常人體生理學(xué)中的重要作用，mmp9的異常表達(dá)和/或活性與多種嚴(yán)重的人體醫(yī)學(xué)狀況相關(guān)，包括但不限于，心血管疾病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和多種惡性腫瘤(nagase,hideaki,robertvisse和gillianmurphy."structureandfunctionofmatrixmetalloproteinasesandtimps."cardiovascularresearch69.3(2006):562-573)?？紤]到這一點(diǎn)，mmp9表達(dá)和蛋白水解活性已經(jīng)在醫(yī)學(xué)界被視為有價(jià)值的臨床診斷生物標(biāo)志物。

mmp9切割300bp或500bpdna骨架:融合分子:有效負(fù)載構(gòu)建體內(nèi)的其目標(biāo)底物sgkgprqita的能力首先通過emsa凝膠驗(yàn)證。允許mmp9的活性催化亞基(39kda,enzolifesciences)在mmp9活性緩沖液(50mmtris,10mmcacl2,150mmnacl,0.05％brij35,ph7.5)中在37℃下以1:10的蛋白酶:底物比率與偶聯(lián)于有效負(fù)載分子的dna骨架孵育過夜以確保完全酶促降解(圖14,道2)。與mmp9的這種孵育產(chǎn)生與完全構(gòu)建體相比在丙烯酰胺凝膠中具有更高活動(dòng)性的分子(圖14,道1和3)，推測是由于在報(bào)告為目標(biāo)底物的切割位點(diǎn)的谷氨酰胺和異亮氨酸之間構(gòu)建體的完全酶促降解(kridel,stevenj.等"substratehydrolysisbymatrixmetalloproteinase-9.journalofbiologicalchemistry276.23(2001):20572-20578)。無活性mmp9與相同構(gòu)建體的孵育不在凝膠中導(dǎo)致樣品之間的任何移位(數(shù)據(jù)未顯示)，表明道2中看到的電泳遷移率的變化唯獨(dú)是由于感興趣的蛋白酶，mmp9，的蛋白水解活性。

接著，我們測試了mmp9切割300bpdna:融合體:有效負(fù)載構(gòu)建體(此處稱為dna-有效負(fù)載)內(nèi)的其目標(biāo)底物sgkgprqita的納米孔隙檢測的方法。首先，單獨(dú)300bpdna骨架在0.4nm下使用15nm直徑孔隙(100mv,1mlicl)測試，在30分鐘內(nèi)產(chǎn)生146個(gè)事件，其中僅5.5％超過0.1ms的持續(xù)時(shí)間(圖19a,b)。隨后，測試了未暴露于mmp9活性的dna-有效負(fù)載。這一樣品在30分鐘內(nèi)產(chǎn)生49個(gè)事件，其中16.3％超過0.1ms的持續(xù)時(shí)間(圖19a,b)。接著，在如前所述的dna-有效負(fù)載和mmp9之間的孵育期后，反應(yīng)混合物以1.2nm的等同dna-有效負(fù)載深度在孔隙上測試，在30分鐘內(nèi)產(chǎn)生327個(gè)事件。如果mmp9降解絕大多數(shù)的底物(即，可切割接頭)，反應(yīng)混合物將包含單獨(dú)的dna和單獨(dú)的有效負(fù)載，且結(jié)果與未降解的dna-有效負(fù)載相比將具有持續(xù)時(shí)間超過0.1ms的事件的百分比的降低。實(shí)際情況是，對于mmp9降解后的dna-有效負(fù)載7.6％的超過0.1ms的事件，從沒有降解的情況下dna-有效負(fù)載的16.3％降低(圖19a,b)。作為記錄時(shí)間的函數(shù)的q(p)±qsd(p)的曲線圖對于各試劑類型顯示(圖19b)。

我們接著實(shí)施之前對于對納米孔隙檢測分析分配統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性描述的方法。具體地，利用公式(2)，我們可以通過使用由dna-有效負(fù)載和mmp9之間的反應(yīng)混合物產(chǎn)生的數(shù)據(jù)測試dna-有效負(fù)載分子構(gòu)建體的不存在而隱含地檢測mmp9活性。在這一情況中，dna-有效負(fù)載是待檢測的類型2分子，且最小0.1ms的事件持續(xù)時(shí)間選擇為類型2標(biāo)示標(biāo)準(zhǔn)。在已知dna-有效負(fù)載存在的對照實(shí)驗(yàn)(無mmp9)中，我們確立值q(p*)＝0.163。接著，將mmp9活性后的dna-有效負(fù)載作為“未知”數(shù)據(jù)處理，我們應(yīng)用公式(2)。結(jié)果是0.0765+0.038＝0.117<0.163，這意味著我們可以說類型2(dna-有效負(fù)載)分子以99％置信度不存在。如所述的，dna-有效負(fù)載的不存在隱含地表明mmp9降解足夠百分比的包含其底物的分子。應(yīng)用公式(2)的mmp9蛋白酶活性結(jié)果顯示于圖19c中。

實(shí)施例5：mmp9敏感分子構(gòu)建體在提高濃度的尿存在下的消化

mmp9已發(fā)現(xiàn)在多種人類惡性腫瘤的尿中過表達(dá)且是過度活躍的，包括卵巢癌患者的尿液(coticchia,christinem.等"urinarymmp-2andmmp-9predictthepresenceofovariancancerinwomenwithnormalca125levels."gynecologiconcology123.2(2011):295-300)。出于這一原因，產(chǎn)生了幾種可商購試劑盒(gehealthcare,r&dsystems,abcam)以分析人尿液中存在的mmp9的濃度和/或活性。在這一實(shí)施例中，mmp9在增加濃度的尿存在下降解骨架:融合體:有效負(fù)載構(gòu)建體的能力通過emsa凝膠進(jìn)行分析。

如實(shí)施例2中所述的可切割接頭:有效負(fù)載與dbco-修飾的dna骨架的偶聯(lián)得到>75％的最終產(chǎn)物(圖16,道5，上條帶)。這一純化的樣品然后允許在增加量的人尿液存在下與mmp9一起孵育。在正常酶活性緩沖液中，構(gòu)建體的完全切割通過上部偶聯(lián)條帶(道1)的消失觀察到。隨著尿液濃度提高，發(fā)現(xiàn)完全的酶抑制在溶液中>15％尿液下發(fā)生(圖16,道3和4)，和中等酶活性在5％尿液的溶液中檢測到(圖16,道2)。蛋白酶抑制的機(jī)制未被研究，但可能是由于幾種因素，包括但不限于ph變化、尿液中天然拮抗劑的存在或尿介導(dǎo)的蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的展開。

實(shí)施例6：核酸內(nèi)切酶敏感構(gòu)建體水解后納米孔隙檢測

在細(xì)菌細(xì)胞中，限制性核酸內(nèi)切酶充當(dāng)對抗外源dna攝取的關(guān)鍵抗御機(jī)制。核酸內(nèi)切酶識(shí)別和降解特定dna序列，從而保護(hù)“自身”而同時(shí)破壞潛在有害的外源dna，如在病毒感染的情況中。金黃色葡萄球菌是已發(fā)現(xiàn)引起廣泛的人體感染的病原細(xì)菌，其范圍從淺表皮膚病變到嚴(yán)重的全身性疾病。在本實(shí)施例中，首先生成dbco-修飾的500bpdna(包含骨架和融合體的一部分)，其包括限制性酶saui的識(shí)別序列，cc/t(n)agg(n代表c、g、t或a)。saui是已發(fā)現(xiàn)存在于所有金黃色葡萄球菌分離株中的核酸內(nèi)切酶(veiga,helena和marianag.pinho."inactivationofthesauitypeirestriction-modificationsystemisnotsufficienttogeneratestaphylococcusaureusstrainscapableofefficientlyacceptingforeigndna."appliedandenvironmentalmicrobiology75.10(2009):3034-3038)。融合體的這一dna部分然后與有效負(fù)載分子偶聯(lián)。由于從商業(yè)供應(yīng)商獲得saui的限制，使用能夠在相同識(shí)別序列處水解切割的核酸內(nèi)切酶，eco81i。

為評估eco81i降解工程化dna骨架:融合體:有效負(fù)載構(gòu)建體的能力，這兩者允許在37℃下一起孵育過夜以確保完全的dna序列-特異性水解(1xtangobuffer中的20ueco81i,thermoscientific)。在核酸內(nèi)切酶與骨架:融合體:有效負(fù)載孵育后，運(yùn)行emsa凝膠以分析酶反應(yīng)的所得產(chǎn)物。未與eco81i孵育的偶聯(lián)dna骨架的樣品(圖15,道1)顯示完整構(gòu)建體典型的上條帶和未與有效負(fù)載分子偶聯(lián)的dna的下條帶。但是，當(dāng)?shù)?中的樣品允許與eco81i孵育時(shí)，觀察到dna的完全降解(圖15,道3)。因?yàn)閑co81i的識(shí)別序列位于距dna骨架的3’末端的194bp且獨(dú)立于有效負(fù)載分子中編碼的蛋白酶可切割接頭，偶聯(lián)和未偶聯(lián)的材料兩者(圖15,道1，上和下條帶)通過eco81i水解。在eco81i對dna的水解反應(yīng)后預(yù)期的304和196bp的產(chǎn)物在道3中是明顯的。

在凝膠確認(rèn)核酸內(nèi)切酶敏感構(gòu)建體的eco81i-介導(dǎo)的降解后，進(jìn)行納米孔隙分析以評估所得片段的電流阻抗。由于有效負(fù)載分子的存在，當(dāng)與所得產(chǎn)物相比時(shí)，理想的電流阻抗預(yù)測對于完全構(gòu)建體的較大信號(hào)。為了測試這一假設(shè)，使用500bpdna，骨架:融合體:有效負(fù)載構(gòu)建體(以下稱為dna-有效負(fù)載)加載到具有1mlicl的納米孔隙中，并在eco81i-介導(dǎo)的降解之前和之后進(jìn)行比較(圖20)。

在納米孔隙分析中，我們首先使用18nm直徑孔隙(100mv,1mlicl)測試1nm的單獨(dú)的未偶聯(lián)500bpdna。這一樣品在32分鐘內(nèi)產(chǎn)生530個(gè)事件，其中僅7.5％超過0.06ms的持續(xù)時(shí)間(圖20a,b)。隨后，dna-有效負(fù)載以0.2nm測試，在31分鐘內(nèi)產(chǎn)生117個(gè)事件，其中22.2％超過0.06ms的持續(xù)時(shí)間(圖20a,b)。接著，在如前所述dna-有效負(fù)載和eco81i之間的孵育期后，反應(yīng)混合物以0.2nm的當(dāng)量dna-有效負(fù)載濃度在孔隙上測試，在40分鐘內(nèi)產(chǎn)生52個(gè)事件。如果eco81i切割足夠多數(shù)的可切割接頭，反應(yīng)混合物將包含單獨(dú)的dna和單獨(dú)的有效負(fù)載，且結(jié)果與未降解的dna-有效負(fù)載相比具有持續(xù)時(shí)間超過0.06ms的事件的百分比的降低。這實(shí)際上是，其中對于eco81i降解后的dna-有效負(fù)載具有7.7％的超過0.06ms的事件，從對于沒有降解的情況下dna-有效負(fù)載的22.2％下降(圖20a,b)。q(p)±qsd(p)作為記錄時(shí)間的函數(shù)的曲線圖對于各試劑類型顯示(圖20b)。

我們再次執(zhí)行之前描述的方法以將統(tǒng)計(jì)顯著性賦予納米孔隙檢測分析。具體地，利用公式(2)，我們可以通過使用由dna-有效負(fù)載和eco81i之間的反應(yīng)混合物生成的數(shù)據(jù)測試dna-有效負(fù)載分子構(gòu)建體的不存在而隱含地檢測eco81i活性。在這種情況中，dna-有效負(fù)載是待檢測的類型2分子，且最小0.06ms的事件持續(xù)時(shí)間選擇作為類型2標(biāo)示標(biāo)準(zhǔn)。在已知存在dna-有效負(fù)載(沒有eco81i)的對照實(shí)驗(yàn)中，我們確立q(p*)＝0.222。接著，處理作為“未知”數(shù)據(jù)的eco81i活性后dna-有效負(fù)載，我們應(yīng)用公式(2)。結(jié)果是0.0769+0.0951＝0.172<0.222，其意味著我們可以說類型2(dna-有效負(fù)載)分子以99％置信度是不存在的。如所述的，dna-有效負(fù)載的不存在隱含地表明eco81i切割足夠百分比的可切割接頭。應(yīng)用公式(2)的eco81i核酸內(nèi)切酶活性結(jié)果顯示于圖20c中。