相關(guān)申請的交叉引用本申請要求2014年10月28提交的美國臨時(shí)專利申請第62/069,601號的優(yōu)先權(quán)，過引用將該申請全文納入本文。領(lǐng)域本發(fā)明涉及用于檢測樣本中目標(biāo)細(xì)胞的代謝活性的方法和系統(tǒng)。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及抗生素敏感性的電化學(xué)檢測。
背景技術(shù)：
：：抗生素的過度使用和對病原體不敏感的一線抗生素處方導(dǎo)致抗生素耐藥率升高，這是日益增長的對全球公共健康的威脅。1尿路感染是其中最普遍的細(xì)菌感染。2用于尿路感染的金標(biāo)抗生素敏感性實(shí)驗(yàn)依賴于培養(yǎng)，并且通常需要1～3天，以使得細(xì)菌繁殖至可檢測水準(zhǔn)。3在細(xì)菌預(yù)培養(yǎng)之后，通常需要額外的18小時(shí)以進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)敏感實(shí)驗(yàn)。減少確定尿路感染的敏感曲線(susceptibilityprofile)所需時(shí)間能夠改善臨床結(jié)果，特別是在大多數(shù)導(dǎo)致尿膿病癥的重度感染的情況下。4快速實(shí)驗(yàn)還可以有利于減少使用不必要的抗生素，5并且提高集中診斷實(shí)驗(yàn)室的效率。其它感染的治療也可以類似地從改善敏感實(shí)驗(yàn)中獲益。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與培養(yǎng)相比，將取決于抗生素耐藥基因的酶擴(kuò)增的用于抗生素耐藥性的試驗(yàn)?zāi)芸s短周轉(zhuǎn)時(shí)間。6、7、8、9不幸的是，這些化驗(yàn)經(jīng)常需要預(yù)孵育(pre-incubation)步驟，以使得細(xì)菌繁殖，并且進(jìn)一步還需要數(shù)小時(shí)以放大所針對的基因?；诨虻幕?yàn)通常還受到知道哪些基因賦予耐藥性的先驗(yàn)要求限制。許多不斷演化的基因可能涉及對于給定抗生素的耐藥性，并且可能不能實(shí)現(xiàn)對于所有可能的突變的試驗(yàn)。10監(jiān)測對抗生素進(jìn)行響應(yīng)的細(xì)菌活力的化驗(yàn)可以克服基因試驗(yàn)的至少部分限制。這些實(shí)驗(yàn)直接報(bào)告了臨床上最重要的問題：給定抗生素是否降低了細(xì)菌的殘存率(bacterialsurvival)。新的用于抗生素耐藥性的化驗(yàn)包括：使用afm懸臂檢測細(xì)菌運(yùn)動11、細(xì)菌生長的電化學(xué)檢測12、13、14、15、16、細(xì)菌生長的光學(xué)檢測17、18、以及細(xì)菌代謝的氧化還原報(bào)告物的光學(xué)檢測19、20、21、22。在檢測代謝活性病原體的化驗(yàn)中，細(xì)菌通常用抗生素和代謝的氧化還原報(bào)告物例如刃天青或亞甲基藍(lán)進(jìn)行孵育。代謝活躍細(xì)菌產(chǎn)生了還原環(huán)境并且直接或間接對化合物進(jìn)行還原，并且氧化還原狀態(tài)讀取為顏色或熒光的變化。耐藥性細(xì)菌持續(xù)繁殖并且代謝化合物，而敏感性細(xì)菌則不會。使用該類型方法的成功檢測通常取決于足夠量的還原形式的報(bào)告物累積超過檢測閾值，可能需要至少12小時(shí)延遲(在毫升規(guī)模的培養(yǎng)中)。19已經(jīng)提出了旨在將細(xì)菌限制在微升和納升體積的策略，目的是通過增加細(xì)菌的局部濃度來減少檢測時(shí)間。20、21、23、24、25在這些光學(xué)技術(shù)中最敏感的是，樣本被分成數(shù)百萬的納升液滴，并且用大功率熒光顯微鏡從每個(gè)液滴順序地讀出信號。20、21、25盡管通過該方法提供了局部有效濃度的增加，通常還需要幾個(gè)小時(shí)進(jìn)行分析。此外，這些裝置中的許多只檢測病原體的存在與否，而不是其抗生素敏感曲線。25、26、27技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：在一些示例中，本發(fā)明描述了適用于檢測樣本中目標(biāo)細(xì)胞的代謝活性的裝置。該裝置包括：納升孔(nanoliterwell)，其包括：用于接收樣本的入口；用于抑制目標(biāo)細(xì)胞通過孔的出口離開孔的微過濾器；以及用于感測孔內(nèi)內(nèi)含物的電化學(xué)狀態(tài)的孔內(nèi)電極。在一些示例中，所述裝置可以進(jìn)一步包括：多個(gè)孔。在一些示例中，本發(fā)明描述了適用于檢測樣本中目標(biāo)細(xì)胞的代謝活性的方法。所述方法包括：將目標(biāo)細(xì)胞集中在納升孔內(nèi)；向孔內(nèi)引入響應(yīng)目標(biāo)細(xì)胞代謝活性而呈現(xiàn)電化學(xué)狀態(tài)變化的報(bào)告化合物；確定一段時(shí)間內(nèi)孔內(nèi)內(nèi)容物電化學(xué)狀態(tài)的變化；并且基于所述孔內(nèi)的內(nèi)容物的電化學(xué)狀態(tài)的確定變化來檢測目標(biāo)細(xì)胞的代謝活性或活力。附圖的簡要說明以示例的方式參考顯示本發(fā)明示例性實(shí)施方式的附圖，附圖中：圖1a顯示了刃天青被還原為試鹵靈的過程；圖1b和1c是所公開的裝置的示例的示意圖；圖1d顯示所公開裝置的示例性操作；圖1e顯示了顯示用于檢測抗生素敏感性的電化學(xué)表型的原理的差示脈沖伏安圖；圖2a顯示從大腸桿菌(e.coli)的連續(xù)稀釋培養(yǎng)5小時(shí)后得到的代表性差示脈沖伏安圖；圖2b顯示在用刃天青培養(yǎng)大腸桿菌(e.coli)5小時(shí)后得到的平均信號下降；圖2c顯示當(dāng)大腸桿菌(e.coli)的代謝活性通過加熱死亡停止時(shí)得到的平均信號下降；圖3a是使用所公開的裝置的示例的孔內(nèi)細(xì)菌捕獲的另一示意圖；圖3b是包括微珠的孔的微過濾器的示例性光學(xué)圖像；圖3c是顯示通過微珠過濾器捕獲在孔內(nèi)的大腸桿菌(e.coli)的熒光圖像；圖3d顯示作為所引入的細(xì)菌濃度函數(shù)的所公開裝置的示例的捕獲效率；圖4是說明使用所公開的裝置的示例的細(xì)菌活力的電化學(xué)測定圖；圖5a-5e是說明大腸桿菌(e.coli)和肺炎克雷伯菌(k.pneumoniae)對氨芐青霉素和環(huán)丙沙星的敏感性的圖；圖6a和6b顯示了不同緩沖劑中的循環(huán)伏安圖和差示脈沖伏安圖；圖7a和7b是顯示由于通過細(xì)菌還原在刃天青中的電化學(xué)變化圖；圖8a和8b顯示溶解氧對刃天青的電化學(xué)影響的圖表。圖9顯示了代謝活性大腸桿的菌熒光檢測的示例性結(jié)果；圖10a和10b顯示所公開裝置示例的光學(xué)圖像；圖11示意性地說明了所公開裝置示例的示例性制造方法；圖12a和12c是在所公開裝置的示例中形成微過濾器的微珠的示例性光學(xué)圖像；圖12b是表示球體的六方密堆積的示意圖；圖12d顯示了比較使用微珠和不使用微珠的情況下大腸桿菌(e.coli)的捕獲率的圖；圖12e是說明大腸桿菌(e.coli)的捕獲效率是流速的函數(shù)的圖；圖13是在所公開裝置示例中顯示微珠穩(wěn)定性的一系列光學(xué)圖像；圖14顯示在應(yīng)用回流之前和之后在所公開裝置示例中捕獲的大腸桿菌(e.coli)的示例性熒光圖像；圖15a顯示在所公開裝置示例中電沉積電極之前和之后的刃天青的電化學(xué)測定結(jié)果；圖15b說明了在所公開裝置示例中表面結(jié)垢對電極的影響；圖16顯示了表明抗生素阻礙細(xì)菌的代謝活性所需時(shí)間的示例性結(jié)果；圖17顯示使用所公開裝置和常規(guī)化驗(yàn)進(jìn)行的敏感性化驗(yàn)之間的相關(guān)性；圖18說明預(yù)過濾器尺寸對回收摻入未稀釋尿中的細(xì)菌的影響；圖19a-19d是顯示在引入摻入尿液中的大腸桿菌(e.coli)以及刃天青和抗生素后使用示例性裝置獲得的代表性電化學(xué)掃描圖；圖20是所公開裝置的另一示例的示意圖；以及圖21是可以在所公開裝置示例中使用的電極層。類似的附圖編號可以在不同的附圖中使用以表示類似的部件。示例性實(shí)施方式的描述除了近來在細(xì)菌的超敏電化學(xué)檢測方面取得了一些進(jìn)展28、29、30，還報(bào)道了一些用于抗生素耐藥性的直接電化學(xué)檢測的裝置。電化學(xué)讀數(shù)通常僅需要簡單的電子器件，這可以使得對受限納升液滴的抗生素敏感性進(jìn)行直接電子檢測，而不需要用于讀取的龐大光學(xué)儀器。本發(fā)明描述了用于生物試劑(例如細(xì)菌)代謝活性電子檢測的方法和裝置。本發(fā)明的例子可以用于幫助鑒定細(xì)菌的抗生素敏感曲線。本發(fā)明描述了可以使用電化學(xué)讀取以檢測代謝活性細(xì)菌的示例性化驗(yàn)的研究。在本文所述示例中，監(jiān)控報(bào)告化合物(例如刃天青)的電化學(xué)還原以確立存活細(xì)菌的存在，并且進(jìn)一步可以在抗生素存在下進(jìn)行分析以確定耐藥性曲線。在本文中所討論的各種例子中，刃天青可以用作報(bào)告化合物。通常，報(bào)告化合物可以是存在對目標(biāo)細(xì)胞(例如細(xì)菌)的代謝活性進(jìn)行響應(yīng)的電化學(xué)變化(例如，氧化態(tài)變化)的任何化合物。對于給定濃度或量的報(bào)告化合物，報(bào)告化合物的電化學(xué)狀態(tài)在給定時(shí)間段內(nèi)改變的程度可以是目標(biāo)細(xì)胞的代謝活性的指示。報(bào)告化合物可以是刃天青、亞甲基藍(lán)、甲或四唑鎓鹽，或具有對目標(biāo)細(xì)胞的代謝活性的氧化還原響應(yīng)的任何其它化合物。通過代謝活性細(xì)菌還原的氧化還原染料已被用作在抗生素存在下細(xì)菌活力的光學(xué)指示劑19，但在快速概況結(jié)果的傳遞中并未提供顯著改善。在本發(fā)明中，刃天青是一種用于光學(xué)化驗(yàn)細(xì)胞活性的廣泛采用的報(bào)告物，其可以用于細(xì)菌抗生素敏感性的電化學(xué)檢測。圖1顯示刃天青(rz)通過代謝活性細(xì)菌還原為試鹵靈(rr)的過程。當(dāng)使用所公開的裝置實(shí)施時(shí)，該讀取方法的靈敏度可以產(chǎn)生化驗(yàn)速度上的改進(jìn)。雖然，本文中所述的示例使用刃天青作為報(bào)告化合物，但是也可以使用具有對目標(biāo)細(xì)菌(或其它目標(biāo)細(xì)胞)的代謝活性進(jìn)行響應(yīng)的電化學(xué)變化(例如，氧化態(tài)變化)的其它化合物。在無效抗生素的存在下，耐藥性細(xì)菌將會持續(xù)繁殖并且產(chǎn)生將刃天青轉(zhuǎn)化為試鹵靈的還原環(huán)境。另一方面，因?yàn)橛行Э股刈璧K細(xì)菌代謝，它們將防止或抑制通過敏感性細(xì)菌對染料進(jìn)行還原。由于刃天青和試鹵靈具有不同的電化學(xué)信號(如下文中所述)31、32，可以使用差式脈沖伏安法在染料的兩種電化學(xué)狀態(tài)之間進(jìn)行區(qū)分并由此確定細(xì)菌是否是敏感的。圖6a和6b是顯示刃天青的電化學(xué)表征的圖。圖6a和圖6b所示的示例性數(shù)據(jù)使用au大電極(macroelectrode)和ag/agcl參比電極獲取。圖6a顯示在pbs+20％acn中10mm刃天青的循環(huán)伏安圖(i)和差示脈沖伏安圖(ii)。圖6b顯示在lb介質(zhì)中10mm刃天青的循環(huán)伏安圖(i)和差示脈沖伏安圖(ii)。當(dāng)刃天青存在于水性緩沖劑中時(shí)，染料與試鹵靈的初始不可逆二電子還原在相對于ag/agcl的-0.35v的電勢處發(fā)生。在-0.6v處觀察到額外的可逆過程，其表示了試鹵靈向二氫試鹵靈的二電子還原。31、32圖6a和6b表明，將刃天青還原至試鹵靈可以檢測作為電特性的變化。圖7a和7b是顯示由于通過細(xì)菌還原在刃天青中的電化學(xué)變化圖。圖7a和圖7b所示的示例性數(shù)據(jù)使用au大電極(macroelectrode)和ag/agcl參比電極獲取。圖7a顯示在lb介質(zhì)中在37℃用1m刃天青培養(yǎng)6小時(shí)之前(黑色箭頭)之后和之后(白色箭頭)的1x106cfu/ml大腸桿菌(e.coli)的循環(huán)伏安圖(cv)。圖7b顯示相應(yīng)的差示脈沖伏安圖(dpv)。在37℃的細(xì)菌培養(yǎng)基中，當(dāng)使用差示脈沖伏安圖(dpv)來監(jiān)測氧化還原報(bào)告物時(shí)，二氫試鹵靈的形成發(fā)生在絕對值較小的負(fù)電勢，并且可視化為刃天青還原峰上的肩峰。但是，在活性細(xì)菌的存在下觀察到電化學(xué)信號的顯著降低。圖8a和8b顯示溶解氧對刃天青的電化學(xué)影響的曲線圖。顯示了在用n2吹掃20分鐘之前和之后，在lb介質(zhì)中使用金大電極用1mm刃天青的獲得的cv(圖8a)和dpv(圖8b)。在用n2吹掃后觀察到dpv峰值電流降低13％。這些結(jié)果指出溶解氧的任何氧化還原反應(yīng)并未顯著影響電化學(xué)測定。刃天青的上述表征說明該化合物作為細(xì)菌代謝活性指示劑的合適性。在本文所述示例中，刃天青的該特征可以用作用于檢測細(xì)菌對抗生素敏感性的方法和裝置的基礎(chǔ)。圖1b是用于檢測目標(biāo)細(xì)胞(例如細(xì)菌)的代謝活性的示例性裝置100。裝置100包括具有小容積的孔105(例如，納升孔)，其中可以接收待測試的樣本?？?058包括用于獲得電化學(xué)測定的電極。如圖所示，孔105可以包括工作電極(we)和對電極(ce)。在一些示例中，孔105可以額外包括參比電極(re)，其可以用于獲得更一致和/或可靠的測定。電極可以能夠讀取細(xì)菌代謝?？?05可以設(shè)有孔入口120和孔出口125?？?05還包括位于孔出口125附近的用于細(xì)菌捕獲的集成微型過濾器130。如下文進(jìn)一步描述，過濾器130可以通過在小出口的開口(例如，格柵或小間隙)上堆疊的微珠而形成。細(xì)菌可以在各孔105中培養(yǎng)。在一些示例中，過濾器130可以由具有微孔的材料(例如，半透膜)、或其它合適的設(shè)置進(jìn)行替代。盡管圖1b顯示了位于孔出口125處的過濾器130，但過濾器130也可以位于任何其它位置，只要過濾器130能夠?qū)⒛繕?biāo)細(xì)胞捕獲到單元105內(nèi)即可。例如，可以將過濾器130設(shè)置成靠近孔入口120，并且代替地將目標(biāo)細(xì)胞捕獲到孔入口120附近。圖1c是用于檢測代謝活性的另一示例性裝置100的示意圖。圖1c的示例性裝置100可以包括數(shù)個(gè)傳感器孔105。在示例中顯示，裝置100包括內(nèi)通道135和外通道140。內(nèi)通道135具有用于接收試驗(yàn)樣本的入口110a、以及用于去除廢料的出口115a；類似地，外通道140具有入口110b和出口115b。內(nèi)入口和外入口110a、110b可以統(tǒng)稱為入口110，并且內(nèi)出口和外出口115a、115b可統(tǒng)稱為出口115。在圖1c所示的示例中，內(nèi)通道和外通道135、140能夠使得引入的流通過孔入口120和孔出口125。圖20顯示另一示例性裝置100，類似于圖1c的示例性裝置100。圖21顯示可以圖案化以用于圖20的多孔設(shè)計(jì)的電極陣列的示例。圖21顯示用于孔105的電極陣列，除了工作電極(we)和對電極(ce)之外，其還包括參比電極(re)。圖20和21提供了裝置100的示例性尺寸，然而該尺寸并不意在進(jìn)行限制。圖1d顯示可以如何使用具有多個(gè)孔105的示例性裝置100的示例?？梢酝ㄟ^內(nèi)入口110a將可能含有目標(biāo)細(xì)胞(例如細(xì)菌)的試驗(yàn)樣本(例如，尿樣)引入裝置100。樣本通過孔105，并且由孔105的過濾器130防止任何細(xì)菌離開孔105，從而在溶液能夠通過過濾器130離開裝置100的同時(shí)將細(xì)菌捕獲在孔105內(nèi)(參見圖1di)。然后，可以以類似的方式將報(bào)告化合物(例如，刃天青)和培養(yǎng)基引入孔105(參見圖1dii)。如果裝置100用于檢測抗生素敏感性，則此時(shí)也可引入抗生素。通過穿過孔入口120和孔出口125在內(nèi)通道和外通道135、140中引入不混溶的油(例如氟化油，例如fc-40)在孔內(nèi)形成塞子(參見圖1diii)。油置換主要通道中的水溶液。由于表面張力，每個(gè)孔內(nèi)都保留了一個(gè)密封的培養(yǎng)基的納升塞子?？梢允褂萌】?05的其它方法。例如，引入氣泡可以用于塞住孔105。在一些示例中，各孔105可以在孔入口120和孔出口125處設(shè)置可控閥(例如機(jī)械閥或基于壓力的閥)，并且當(dāng)引入樣本、報(bào)告化合物和培養(yǎng)基時(shí)可以控制閥打開，然后密封各孔105，而不是使用塞子。如果使用閥而不是油塞，則可能不需要具有用于內(nèi)通道和外通道135、140的入口110a、110b和出口115a、115b，這可有助于簡化裝置100的設(shè)計(jì)。在一些示例中，可以使用塞子和閥的組合(例如，使用油塞密封孔出口125并使用閥密封孔入口120)。通常，通過密封孔入口120和孔出口125(例如，使用油塞、閥或其組合)，隔離每個(gè)孔的內(nèi)容物。通過將溶液體積限制為孔體積，在捕獲目標(biāo)細(xì)胞后，目標(biāo)細(xì)胞的有效濃度增加。然后，該裝置可以在37℃下孵育以使得所捕獲的細(xì)菌繁殖。如果孔內(nèi)存在代謝活性的目標(biāo)細(xì)胞，則報(bào)告化合物將表現(xiàn)出電化學(xué)狀態(tài)的變化。例如，如果試驗(yàn)用于細(xì)菌的抗生素敏感性并使用刃天青作為報(bào)告化合物，則由于引入的抗生素的存在，捕獲在孔105內(nèi)的抗生素敏感細(xì)菌將呈現(xiàn)出降低的代謝活性或沒有代謝活性(例如，抑制再生)，而耐藥性細(xì)菌將呈現(xiàn)出比抗生素敏感的細(xì)菌大的代謝活性(例如，不受阻礙地繼續(xù)繁殖)。因此，抗生素耐藥性細(xì)菌將比抗生素敏感細(xì)菌更大程度地還原刃天青(例如，抗生素敏感細(xì)菌完全不會還原刃天青，而抗生素耐藥性細(xì)菌則會還原刃天青)?？梢酝ㄟ^使用每個(gè)孔105中的電極測定電流來區(qū)分發(fā)生還原的程度。圖1e顯示了說明上述電化學(xué)表型原理的差示脈沖伏安圖(dpv)。圖10a和10b顯示示例性設(shè)備的光學(xué)圖像。圖10a是部分孔陣列的光學(xué)圖像。圖10b是單個(gè)孔的光學(xué)圖像，顯示了關(guān)于上述圖1描述的過程。在圖10bi處，孔不含有細(xì)菌。在圖10bii處，將微珠引入孔內(nèi)，并通過屏障捕捉，所述屏障限定為在每個(gè)孔的出口處的小開口。微珠可與屏障一起起到作為捕獲細(xì)菌的過濾器的作用。在一些示例中，可以不需要引入微珠，例如在孔內(nèi)制造屏障足以將目標(biāo)細(xì)胞捕獲到孔內(nèi)的情況。在圖10biii處，來自所引入測試樣本的細(xì)菌被捕獲在孔內(nèi)。然后，通過引入不混溶的有機(jī)相形成納升塞。如下文進(jìn)一步討論的，在一些示例中，所公開的裝置可用于以相對短(例如30分鐘)的孵育來檢測臨床相關(guān)細(xì)菌濃度。在下文討論的示例中可以顯示：尿液中臨床相關(guān)細(xì)菌濃度的抗生素敏感曲線可以使用1小時(shí)孵育而不使用預(yù)孵育步驟進(jìn)行測定。因此，本公開的示例可以使得抗生素耐藥性在相對較短的時(shí)間尺度上表型。在一些示例中，所公開的裝置可以使檢測時(shí)間減少，以改善報(bào)告化合物如刃天青作為代謝活性指示劑的臨床實(shí)用性。在所公開的裝置的示例中，目標(biāo)細(xì)胞(例如細(xì)菌)可以濃縮在納升孔內(nèi)。通過在該小體積內(nèi)進(jìn)行刃天青化驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)檢測存活細(xì)菌的存在需要的時(shí)間減少到少于1小時(shí)。將電化學(xué)傳感器(例如，電極)直接整合到每個(gè)孔內(nèi)可以使得在相對較小的體積中相對快速且直接地讀取抗生素敏感曲線，而不需要龐大的光學(xué)儀器來順序讀取數(shù)千個(gè)納升液滴。本發(fā)明可以提供優(yōu)于常規(guī)方法的優(yōu)點(diǎn)。通過將細(xì)菌濃縮在小型化的孔內(nèi)，可以增加細(xì)菌的局部有效濃度。例如，捕獲在1nl孔內(nèi)的10個(gè)細(xì)菌相當(dāng)于10000cfu/μl，而捕獲在1μl孔內(nèi)的10個(gè)細(xì)菌的濃度僅為10cfu/μl。每孔的細(xì)菌濃度越大，刃天青的轉(zhuǎn)換越快，目標(biāo)氧化還原分子的積累越快。由于來自dpv的信號與氧化還原分子的濃度成正比，所以細(xì)菌的局部濃度提高增加了所獲得的信號變化的幅度，因此更容易和/或更快檢測。限制在納升體積內(nèi)化驗(yàn)可提供另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)。隨著刃天青被還原，本發(fā)明防止其擴(kuò)散到本體溶液中，從而使得還原形式快速累積至可檢測的水平。在本文討論的示例中，該裝置可以配置有尺寸約100μm×50μm×550μm的孔，其相當(dāng)于約2.75nl體積。通過在單個(gè)示例性設(shè)備中提供多個(gè)這樣的孔，可以在每個(gè)單獨(dú)樣本上獲得多次測定(例如，每個(gè)孔內(nèi)一次)，這有助于提高設(shè)備的精度。例如，每個(gè)樣本可以進(jìn)行15次測定。來自給定孔的單次測定可能會相對于平均測定值變化多達(dá)40％。然而，15次測定之后的標(biāo)準(zhǔn)誤差可以降低至5％。在一些示例中，另外，每個(gè)孔可以包括多個(gè)工作電極，以從每個(gè)孔獲得多個(gè)測定值，這可以對每個(gè)孔進(jìn)行平均。示例性制造現(xiàn)在討論用于制造所公開裝置實(shí)施例的示例性方法?？梢酝ㄟ^在玻璃基材上的圖案化金電極(以用作工作電極、對電極和參比電極)進(jìn)行制造。圖11示意性地說明了用于所公開設(shè)備示例的示例性制造方法中的步驟。圖11顯示在多孔裝置的橫截面上觀察的示例性制造方法，并且說明了兩個(gè)相對孔的制造。在1處，形成電極層。在該示例中，使用標(biāo)準(zhǔn)光刻法對金層(例如，厚度為100nm)進(jìn)行圖案化。cr可以用作粘附層。接著，在2處，圖案化的電極進(jìn)行鈍化，例如使用光刻法用2μm的su-82002進(jìn)行鈍化。然后，在3處，可以對孔層(例如，50μm厚)進(jìn)行圖案化，例如使用su-83050進(jìn)行圖案化，以限定示例性裝置的孔。然后，在4處，su-82002的第二層可以進(jìn)行圖案化作為薄(例如，2μm)間隔，在孔層和稍后施加的裝置頂部之間產(chǎn)生薄的間隙。該間隙可以作為孔出口處的小開口。經(jīng)實(shí)驗(yàn)確定，2μm的間隙可能太大而不能有效地捕捉細(xì)菌。然而，該間隙可以設(shè)計(jì)為足夠小以捕捉用于微過濾器的微珠(例如，直徑為5μm)。在一些示例中，在目標(biāo)細(xì)胞通過所制造的間隙充分捕捉、或者間隙(或其它結(jié)構(gòu)特征，例如格柵)制造得足夠小的情況下，可以不需要引入微珠。在一些示例中，可以使用其它材料(例如微孔膜)代替微型過濾器的微珠。然后，為了增加電極的表面積，在5處，可以將金電沉積在工作電極上，例如通過在50mmhaucl4和0.5mhcl的溶液中相對于ag/agcl參比電極施加30s的-300mv的電壓。最后，在6處，該裝置可以用聚二甲基硅氧烷(pdms)蓋子加蓋。pdms蓋子可以包括用于入口和出口的洞。在氧等離子體(oxygenplasma)處理30秒后，pdms蓋子可以結(jié)合到裝置的頂部。所制造裝置可以進(jìn)行進(jìn)一步處理，例如去除氣泡。例如，在使用之前，裝置可以用etoh填充并用磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)沖洗。在該實(shí)施例中，以10μl/min的速率引入100μl在pbs中以1:100稀釋的直徑5μm的微珠(希格瑪-艾爾德里奇公司，美國密蘇里州圣路易斯市(sigmaaldrich，st.louis，mo))以形成孔內(nèi)過濾器。示例性研究進(jìn)行各種示例性研究以表征和調(diào)查上述示例性裝置的性能。在使用微珠的這些實(shí)施例中，可以表征孔內(nèi)過濾器的孔徑。由于微珠基本上是球形的，可以使用關(guān)于球形物體的堆疊的方程。球體可能的最密集堆積是六方密堆積，如圖12b所示。在該設(shè)置中，堆積分?jǐn)?shù)為0.74，孔徑由如下給定1：dp＝0.154d3其中dp是孔的直徑，ds是球的直徑。對于直徑5μm的珠，假定六方密堆積，孔徑為0.77μm(由圖12b中的小黑圓圈表示)，其預(yù)期足夠小以捕捉細(xì)菌(其直徑通常為～1μm)。在非理想的堆疊中，球體預(yù)期以聚集堆疊的方式進(jìn)行堆疊以隨機(jī)密堆疊，其具有堆疊分?jǐn)?shù)為0.637的略微松散的堆疊，這引起孔徑分布，但不改最小孔的直徑。1此計(jì)算與圖12a和圖12c所示的高分辨率圖像一致。圖12a是使用光學(xué)顯微鏡獲得的微珠床的示例性圖像。圖12c是顯示珠閉合的示例性光學(xué)顯微鏡圖像。發(fā)現(xiàn)這些圖像中的孔徑約為0.8μm，與上述討論的計(jì)算結(jié)果一致。可以酌情使用其它微珠尺寸用于捕獲更大或更小的目標(biāo)細(xì)胞。為了驗(yàn)證微珠用于將細(xì)菌捕獲在孔內(nèi)實(shí)用性，測定具有微珠過濾器和不具有微珠過濾器的孔的細(xì)菌捕獲效率。圖12d顯示了比較曲線圖，當(dāng)不使用微珠時(shí)，以低效率(小于20％)捕獲細(xì)菌(在該情況下為大腸桿菌(e.coli))，相比之下，當(dāng)使用微珠時(shí)，效率約為60％。因此，在形成孔內(nèi)過濾器中使用微珠可有助于將細(xì)菌濃縮和捕獲在孔內(nèi)。隨著微珠隨機(jī)聚集，可以預(yù)期會產(chǎn)生孔徑分布，這可能使得一些細(xì)菌逃出過濾器。因此，還研究了大腸桿菌(e.coli)的捕獲效率作為流速的函數(shù)。示例性結(jié)果如圖12e所示。發(fā)現(xiàn)捕獲效率作為流速的函數(shù)而降低。在100cfu/μl樣本的情況下，假定在示例性裝置中有72個(gè)孔，每個(gè)孔平均捕獲120個(gè)細(xì)菌?？紤]到每個(gè)孔的體積為2.5nl，這表示約50,000cfu/μl的有效濃度。這表示超過100cfu/μl的初始引入濃度500倍的濃度增加。為了測定微珠過濾器的穩(wěn)定性，以20μl/min將100μl微珠注入到?jīng)]有孔內(nèi)電極的測試版裝置中。堵住外通道入口和內(nèi)通道出口，迫使流體通過孔。在停止流動后，歷時(shí)1小時(shí)獲取顯微鏡圖像。這些圖像的示例顯示在圖13中。發(fā)現(xiàn)微珠在1小時(shí)的時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定。盡管一些珠確實(shí)從過濾器中脫落，但是由于電極距離過濾器偏移了200μm，所以預(yù)期不影響電化學(xué)測定。在一些示例中，過濾器可以包括不同尺寸的微珠，其可用于減小過濾器的孔徑。例如，可以以遞減的尺寸引入微珠(例如，首先引入5μm微珠，然后引入2微米的微珠)，以實(shí)現(xiàn)小于使用單種微珠尺寸的孔徑，同時(shí)確保較小尺寸的微珠不會無意地洗滌出孔。為了計(jì)算孔內(nèi)過濾器的捕獲效率，將所捕獲的細(xì)菌洗脫并在瓊脂板上片外孵育。為了洗脫細(xì)菌，注入緩沖液，同時(shí)將流體向后流過過濾器。這通過阻隔外通道入口和內(nèi)通道出口實(shí)現(xiàn)，導(dǎo)致緩沖器從外通道出口的回流，通過孔出口進(jìn)入孔、并通過孔入口離開，并且最后從內(nèi)通道入口離開示例性裝置。緩沖液的回流迫使細(xì)菌離開過濾器回到入口。將洗脫液在37℃下徹夜培養(yǎng)，對菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。圖14顯示了在施加回流之前和之后在孔內(nèi)過濾器中捕獲的表達(dá)綠色熒光蛋白(gfp)的大腸桿菌(e.coli)的示例性熒光圖。對于示例性裝置，還研究了電沉積和表面結(jié)垢對片上電極的影響。如上參考圖11所示，每個(gè)孔內(nèi)的工作電極用haucl4電鍍以增加電極表面積。發(fā)現(xiàn)這增加了獲取的信號的幅度，從而增加檢測靈敏度。圖15a和15b顯示電沉積和表面結(jié)垢對片上電極影響的圖。圖15a顯示了在au電沉積30秒之前和之后，1mm刃天青的片上電化學(xué)掃描結(jié)果。發(fā)現(xiàn)電沉積增加了電極表面積，從而增加了電流的大小。圖15b說明了表面結(jié)垢對電極的影響。在孵育1小時(shí)后，當(dāng)用1mm刃天青進(jìn)行片上掃描時(shí)，觀察到輕微的信號下降。電流標(biāo)準(zhǔn)化為最大電流。進(jìn)行示例性研究以確定細(xì)菌捕獲效率。在本研究中，將100μl體積的連續(xù)稀釋的大腸桿菌(e.coli)以10μl/min引入捕獲裝置。捕獲后，用100μl的pbs緩沖液洗滌該裝置。最后，在無菌pbs緩沖液中洗脫細(xì)菌。將洗脫體積(elutedvolume)在37℃下在lb瓊脂板上徹夜鋪展，并對菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。進(jìn)行另一個(gè)示例性研究以調(diào)查使用示例性裝置的細(xì)菌電化學(xué)檢測。將大腸桿菌(e.coli)的連續(xù)稀釋液摻入緩沖液中，以20μl/min引入芯片，然后在lb肉湯中加入200μl的1mm的刃天青。將空氣穿過該裝置進(jìn)行沖洗以形成孔，隨后用fc-40(氟化油)沖洗。將裝置在37℃的水浴中孵育。還使用示例性裝置進(jìn)行抗生素敏感性微稀釋化驗(yàn)。將培養(yǎng)的大腸桿菌(e.coli)稀釋至100cfu/μl，并在用環(huán)丙沙星和氨芐青霉素連續(xù)稀釋的營養(yǎng)肉湯中，在96孔板中于37℃下孵育。24小時(shí)后，測定600nm處的吸光度。調(diào)查用于尿液中電化學(xué)檢測的示例性裝置的性能。將人尿液(bioreclamationivt)5000g離心5分鐘以除去大顆粒。將大腸桿菌(e.coli)和肺炎克雷伯菌(k.pneumoniae)稀釋至100cfu/μl，并摻入尿中。樣本(200μl)以20μl/min引入。接著，以20μl/min引入200μl的1mm刃天青和lb培養(yǎng)基中的氨芐青霉素或環(huán)丙沙星。將空氣穿過該裝置沖洗以形成孔，隨后加入fc-40(200μl)(希格瑪-艾爾德里奇公司，美國密蘇里州圣路易斯市(sigmaaldrich，st.louis，mo))。因此，引入的所有溶液的總體積為600μl，其需要30分鐘以20μl/min進(jìn)行處理。將裝置在37℃的水浴中孵育1小時(shí)。需要10分鐘掃描線索(lead)。因此，用于從樣本引入到讀數(shù)的化驗(yàn)總時(shí)間為1小時(shí)40分鐘。還調(diào)查了示例性裝置的性能，用于未純化尿液中的電化學(xué)檢測。將大腸桿菌(e.coli)稀釋至100cfu/μl，并摻入未純化的人尿液(bioreclamationivt)。將經(jīng)過摻入的尿液(200μl)通過10μm的過濾器以除去大顆粒，并以20μl/min直接引入芯片。接著，以20μl/min引入200μl的1mm刃天青和lb培養(yǎng)基中的氨芐青霉素或環(huán)丙沙星。將空氣穿過該裝置沖洗以形成孔，隨后加入fc-40(希格瑪-艾爾德里奇公司，美國密蘇里州圣路易斯市(sigmaaldrich，st.louis，mo))。將裝置在37℃的水浴中進(jìn)行孵育。一個(gè)測試檢測極限的示例性研究通過監(jiān)測刃天青的電化學(xué)信號來實(shí)現(xiàn)，其中在37℃下在lb培養(yǎng)基中用1mm刃天青對連續(xù)稀釋的大腸桿菌(e.coli)孵育5小時(shí)。圖2a顯示通過對用刃天青連續(xù)稀釋的大腸桿菌(e.coli)進(jìn)行5小時(shí)培養(yǎng)獲得的代表性dpv。發(fā)現(xiàn)在lb培養(yǎng)基中的刃天青的dpv表現(xiàn)出兩個(gè)峰。峰i對應(yīng)于通過不可逆的2-電子過程將刃天青轉(zhuǎn)化為試鹵靈，而峰ii對應(yīng)于試鹵靈向二氫試鹵靈的可逆還原。由于代謝活性細(xì)菌代謝刃天青，發(fā)現(xiàn)峰i系統(tǒng)地減少。相對于片上au參比電極獲得電化學(xué)掃描，當(dāng)與ag/agcl參比電極相比時(shí)，其導(dǎo)致峰值電流偏移到更低的負(fù)電勢。作為細(xì)菌濃度的函數(shù)的-0.35v處的平均峰值電流繪制在圖2b中。圖2b顯示通過用刃天青對大腸桿菌(e.coli)進(jìn)行5小時(shí)培養(yǎng)獲得的平均信號降低。顯示的數(shù)據(jù)代表至少8次重復(fù)的平均值。誤差欄表示標(biāo)準(zhǔn)誤差。圖2c顯示當(dāng)通過熱死亡停止大腸桿菌(e.coli)代謝活性時(shí)獲得的平均信號降低，表明無代謝活性的細(xì)菌不會還原刃天青。在示例性研究中，發(fā)現(xiàn)檢出限為100cfu/μl，這可能是臨床相關(guān)的，并且已被用作細(xì)菌尿存在的閾值水平。33、2發(fā)現(xiàn)峰值信號隨著細(xì)菌濃度增加而降低，如預(yù)期地因?yàn)榇婊罴?xì)菌將刃天青轉(zhuǎn)化為試鹵靈。由于峰i和ii之間存在顯著重疊，所以峰i的高度降低導(dǎo)致峰ii的高度也降低。還比較了使用刃天青的細(xì)菌活力的電化學(xué)檢測和熒光檢測的檢測極限。該比較發(fā)現(xiàn)100cfu/μl的相似檢測極限，表明刃天青的電化學(xué)檢測可能與熒光讀數(shù)一樣敏感。圖9顯示了代謝活性大腸桿菌(e.coli)熒光檢測的示例性結(jié)果。將大腸桿菌(e.coli)的連續(xù)稀釋液在37℃下用lb培養(yǎng)基中的1mm刃天青孵育5小時(shí)。使用585nm的微板讀數(shù)器，以570nm的激發(fā)波長測定熒光信號。代謝活性細(xì)菌將刃天青轉(zhuǎn)化成試鹵靈，這增加了熒光信號。使用熒光可檢測100cfu/μl，其等于使用同樣5小時(shí)孵育期的電化學(xué)的檢測極限。虛線表示來自空白樣本的信號。與使用熒光的檢測相比，使用電化學(xué)進(jìn)行檢測可能更有用，因?yàn)樗ǔ２恍枰糜谧x取的復(fù)雜或龐大的儀器，并且傳感器(例如，電極)可以直接整合到培養(yǎng)室中。不同的是，在最敏感的熒光化驗(yàn)中，該化驗(yàn)通常在一系列納升液滴中進(jìn)行，通常需要大功率熒光顯微鏡來順序讀取液滴。使用電化學(xué)，可以將傳感器直接集成到納升培養(yǎng)室中，從而消除對用于讀取的昂貴光學(xué)設(shè)備的需求。電化學(xué)讀取所需的電子裝置可以集成到小型臺式或便攜式裝置中，這有助于降低裝置的成本和/或占地面積。進(jìn)行另一項(xiàng)研究，用于使用示例性裝置驗(yàn)證孔內(nèi)細(xì)菌捕獲。圖3a是使用示例性裝置的孔內(nèi)細(xì)菌捕獲的另一示意圖。將細(xì)菌捕捉到基于孔內(nèi)大小的過濾器內(nèi)，所述過濾器由固定在每個(gè)孔內(nèi)的聚苯乙烯珠的床制成。圖3b是過濾器的示例性光學(xué)圖，所述過濾器包括固定在預(yù)制孔內(nèi)屏障中的微珠。圖3c是顯示通過微珠過濾器捕捉在孔內(nèi)的表達(dá)gfp的大腸桿菌(e.coli)的熒光圖。這些結(jié)果表明在每個(gè)孔內(nèi)可重現(xiàn)地捕獲細(xì)菌。為了定量示例性裝置的捕獲效率，以10μl/min的流速引入100μl體積的gfp大腸桿菌(e.coli)的連續(xù)稀釋液。在捕獲后，將細(xì)菌引入瓊脂平板，并將板徹夜孵育后對大腸桿菌(e.coli)菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。圖3d顯示作為引入細(xì)菌濃度函數(shù)的捕獲效率。這些結(jié)果表明，示例性裝置可以在低至1cfu/μl的濃度下實(shí)現(xiàn)～80％的捕獲。在通過上述示例性研究討論證明有效捕獲的情況下，進(jìn)行其它研究以測試所公開的裝置和方法檢測捕獲在孔內(nèi)的存活細(xì)菌的能力。用100cfu/μl(尿路感染臨床相關(guān)濃度)的大腸桿菌(e.coli)挑戰(zhàn)示例性裝置。2該濃度等于每孔超過100個(gè)細(xì)菌。對信號的時(shí)間依賴性進(jìn)行研究，以確定檢測存活細(xì)菌臨床相關(guān)濃度所需的最短時(shí)間。圖4是說明細(xì)菌活力的孔內(nèi)電化學(xué)測定圖。發(fā)現(xiàn)由刃天青產(chǎn)生的電化學(xué)信號作為100cfu/μl的存活大腸桿菌(e.coli)的孵育時(shí)間的函數(shù)而降低。在30分鐘內(nèi)檢測到可行的大腸桿菌(e.coli)。為了比較，在使用空白培養(yǎng)基、且未摻入細(xì)菌的純化和未純化的尿液的對照中孵育60分鐘后，沒有觀察到陽性信號變化。這些結(jié)果與2.8小時(shí)的先前記錄相比，孵育時(shí)間減少到小于前者的五分之一。20在空白介質(zhì)的情況下觀察到小的信號增加，這可能是由于小的芯片到芯片的變化。在空白尿和未凈化尿液的情況下觀察到一些信號降低，這也可能歸因于電極的表面結(jié)垢。通過從11na的最大峰值電流中減去所獲得的峰值電流來計(jì)算信號減少。上述研究證明了所公開的裝置和方法用于檢測存活細(xì)菌的適用性。進(jìn)行其他研究以化驗(yàn)示例性裝置對于快速確定未稀釋尿液中細(xì)菌的抗生素耐藥性曲線的適用性。為了更好地模擬臨床樣本，本研究測試了大腸桿菌(e.coli)(upec)和肺炎克雷伯氏桿菌(k.pneumoniae)的尿路感染菌株(uropathogenicstrain)，其是涉及尿路感染的兩種最常見的病原體。2肺炎克雷伯桿菌菌株從感染患者的尿液中分離出，并產(chǎn)生廣譜的β-內(nèi)酰胺酶，其賦予對各種β-內(nèi)酰胺抗生素的耐藥性。2在本研究中，測試對于兩類常用于治療尿路感染的抗生素的易感性——氨芐青霉素、β-內(nèi)酰胺抗生素；和環(huán)丙沙星、氟喹諾酮。為了選擇適用于敏感性試驗(yàn)的孵育期，調(diào)查了抗生素開始抑制細(xì)菌代謝活性所需的時(shí)間。為了研究這一點(diǎn)，使用高濃度的細(xì)菌以確定呈現(xiàn)不同代謝活性的細(xì)菌對于響應(yīng)用于測試的抗生素的所需的最短時(shí)間。1×105cfu/μl的肺炎克雷伯氏菌(k.pneumoniae)在37℃，在氨芐青霉素和環(huán)丙沙星的存在下，在lb培養(yǎng)基和1mm刃天青中以100μg/ml進(jìn)行孵育。記錄了通過代謝活性細(xì)菌轉(zhuǎn)化刃天青引發(fā)的熒光增加。圖16顯示了表明抗生素抑制細(xì)菌代謝活性所需時(shí)間的示例性結(jié)果。發(fā)現(xiàn)來自由環(huán)丙沙星孵育樣本的信號在30分鐘內(nèi)被抑制，表明抗生素快速抑制肺炎克雷伯菌(k.pneumoniae)的代謝。由于這種肺炎克雷伯菌(k.pneumoniae)對氨芐青霉素具有抗性，所以由于肺炎支原體轉(zhuǎn)化了刃天青，熒光增加。這些結(jié)果表明，敏感性試驗(yàn)所選擇的60分鐘的孵育期對于不同代謝活性細(xì)菌響應(yīng)所測試抗生素足夠長。如上所述，還研究了通過用lb培養(yǎng)基孵育該裝置而引發(fā)表面結(jié)垢的影響，其結(jié)果示于圖15b。結(jié)果表明，在孵育前后所獲得的信號僅有小的變化，表明結(jié)垢可歸因于約15％的信號變化，這在示例性裝置不意圖用于再次使用的情況下是可接受的。經(jīng)在未示稀釋的尿液中以100cfu/μl的濃度存在的大腸桿菌(e.coli)(upec)和肺炎克雷伯菌(k.pneumoniae)引入示例性裝置。在捕獲后，引入培養(yǎng)基、刃天青、氨芐青霉素或環(huán)丙沙星。圖5c和5d顯示了在37℃孵育1小時(shí)后獲得的作為抗生素濃度函數(shù)的電化學(xué)信號?？瞻啄蛞簶颖緵]有觀察到信號變化。對于大腸桿菌(e.coli)菌株，發(fā)現(xiàn)對于所有環(huán)丙沙星濃度都產(chǎn)生低的信號，表明細(xì)菌對濃度超過1μg/ml的抗生素敏感(參見圖5c)。發(fā)現(xiàn)該信號隨著氨芐青霉素濃度降低，表明在10～100μg/ml濃度處的敏感性。這些結(jié)果使用標(biāo)準(zhǔn)微量稀釋化驗(yàn)孵育24小時(shí)進(jìn)行確認(rèn)，以確定大腸桿菌(e.coli)和肺炎克雷伯菌(k.pneumoniae)對氨芐青霉素和環(huán)丙沙星的抗生素耐藥性曲線(圖5a和5b)。發(fā)現(xiàn)抑制90％大腸桿菌(e.coli)細(xì)菌生長(mic90)的最小抗生素濃度為16μg/ml(對于氨芐青霉素)，低于0.1μg/ml(對于環(huán)丙沙星)。對于肺炎克雷伯菌(k.pneumoniae)，發(fā)現(xiàn)信號隨著氨芐青霉素濃度的增加而近似恒定，表明細(xì)菌活力不受氨芐青霉素劑量的影響——這是耐藥性的標(biāo)志。由于該菌株產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶，預(yù)期具有對氨芐青霉素(其作為一種抗β-內(nèi)酰胺抗生素)的耐藥性。相比之下，在環(huán)丙沙星的情況下觀察到濃度依賴性信號，表明細(xì)菌活力通過增加環(huán)丙沙星濃度而降低。這表明該菌株對環(huán)丙沙星敏感，并發(fā)現(xiàn)在1～10μg/ml濃度下抑制(參見圖5d)。使用標(biāo)準(zhǔn)微量稀釋化驗(yàn)，確實(shí)發(fā)現(xiàn)肺炎克雷伯菌(k.pneumoniae)對氨芐青霉素具有耐藥性，但對環(huán)丙沙星敏感(參見圖5b)。發(fā)現(xiàn)肺炎克雷伯桿菌(k.pneumoniae)的mic90對于環(huán)丙沙星為2μg/ml，并且對于氨芐青霉素為大于100μg/ml。對于兩種菌株，使用示例性裝置獲得的這些結(jié)果顯示出與使用金標(biāo)法確定的mic良好的一致性，所述金標(biāo)法需要的孵育時(shí)間比使用示例性裝置片上化驗(yàn)所需長超過20倍。在片上敏感性化驗(yàn)和具有r2值(對大腸桿菌(e.coli)和肺炎克雷伯氏菌分別為0.81和0.82)的標(biāo)準(zhǔn)化驗(yàn)之間發(fā)現(xiàn)良好的相關(guān)性(參見圖17)。細(xì)微差異可歸因于當(dāng)比較兩種方法時(shí)使用的不同檢測方法和孵育期。還進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)以確定未純化尿中細(xì)菌的抗生素敏感性。圖5e顯示了在37℃下以不同水平的抗生素進(jìn)行1小時(shí)孵育后，來自使用示例性裝置對未純化尿中大腸桿菌(e.coli)進(jìn)行抗生素敏感性的電化學(xué)測定的示例性結(jié)果。電流標(biāo)準(zhǔn)化為最大值。誤差欄表示標(biāo)準(zhǔn)誤差。將大腸桿菌(e.coli)以100cfu/μl直接摻入未稀釋且未純化的尿中。將樣本通過10μm的過濾器，所述過濾器除去大顆粒物而使得細(xì)菌通過。圖18說明了預(yù)過濾器尺寸對回收摻入未稀釋尿中的細(xì)菌的影響。發(fā)現(xiàn)使用具有10μm孔徑的預(yù)過濾器能直接從尿中有效地回收大腸桿菌(e.coli)。將濾液引入示例性裝置中，并在37℃下孵育1小時(shí)，針對氨芐青霉素和環(huán)丙沙星進(jìn)行測試。發(fā)現(xiàn)大腸桿菌(e.coli)對濃度1μg/ml及以上的環(huán)丙沙星敏感，并且對濃度10～100μg/ml的氨芐青霉素敏感。當(dāng)使用空白對照樣本的未純化尿液時(shí)(參加圖4，如上文所述)，沒有發(fā)現(xiàn)明顯的信號變化。發(fā)現(xiàn)這些結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)的微量稀釋抗生素敏感性化驗(yàn)一致，表明可以由使用簡單在線預(yù)過濾樣本處理步驟的未純化的尿樣挑戰(zhàn)該裝置。使用示例性裝置獲得的代表性電化學(xué)掃描在圖19a-19d中顯示。這些圖顯示了在引入以100cfu/μl摻入尿液中的大腸桿菌(e.coli)、且隨后引入1m的刃天青和抗生素后，片上獲得的示例性電化學(xué)掃描。樣本在37℃下孵育60分鐘。將大腸桿菌(e.coli)與100μg/ml氨芐青霉素(圖19a)、1μg/ml氨芐青霉素(圖19b)、100μg/ml環(huán)丙沙星(圖19c)和1μg/ml環(huán)丙沙星(圖19d)一起孵育。在1μg/ml氨芐青霉素的存在下，發(fā)現(xiàn)由于氨芐青霉素濃度不足以抑制大腸桿菌(e.coli)的代謝，信號幅度減小。用示例性裝置的au參比電極在片上獲得電化學(xué)掃描。與使用ag/agcl參比電極相比，峰遷移到更低的負(fù)電勢。為了在片上測試未稀釋的尿液，從尿液中除去大顆粒物而使得細(xì)菌通過過濾器。測試各種預(yù)過濾器尺寸，以確保能夠回收摻入全部尿液中的細(xì)菌。將大腸桿菌(e.coli)以1×102cfu/μl的濃度加入全部尿液中，并將100μl尿液通過具有各種孔徑的預(yù)過濾器。將濾液鋪展在瓊脂平板上，并在37℃下徹夜孵育。對細(xì)菌菌落數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)，并發(fā)現(xiàn)使用10μm的預(yù)過濾器，可以從整個(gè)尿液直接回收近75％的細(xì)菌。在各種示例中，本發(fā)明描述了方法和裝置，與傳統(tǒng)方法相比，所述方法和裝置可以提供直接從未純化尿液中更快報(bào)告臨床相關(guān)濃度下對抗生素敏感性檢測。通過將細(xì)菌濃縮在納升體積中(這增加了細(xì)菌的局部有效濃度)可有助于快速周轉(zhuǎn)時(shí)間。通過在分離的納升隔間中孵育細(xì)菌，使得通過限制擴(kuò)散使得還原形式的刃天青快速積聚到可檢測水平，可進(jìn)一步降低周轉(zhuǎn)時(shí)間。所公開的方法還是純電子的，其可以通過減少或消除對昂貴且龐大的光學(xué)設(shè)備的需要來促進(jìn)即時(shí)診斷(point-of-care)的抗生素敏感性試驗(yàn)的研發(fā)。在臨床設(shè)置中，所公開的裝置的示例可以用作標(biāo)準(zhǔn)敏感性試驗(yàn)的替代方案，以在基于初始培養(yǎng)的細(xì)菌鑒定后提供結(jié)果，例如孵育1小時(shí)。目前，常規(guī)抗生素敏感性試驗(yàn)通常在初始培養(yǎng)步驟后需要額外18-24小時(shí)。所公開的裝置的示例還可以與基于標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)的抗生素敏感性試驗(yàn)結(jié)合使用，以在1小時(shí)的孵育期內(nèi)直接從未稀釋的尿提供即時(shí)診斷的敏感性結(jié)果。這可以使得在過渡期間快速施用有效的抗生素，直到2-3天后可獲得標(biāo)準(zhǔn)抗生素敏感性試驗(yàn)結(jié)果，在此時(shí)可以完善治療。這可以使得醫(yī)生幾乎立即施用有針對性的抗生素，這可能會改善患者的預(yù)后，并可以通過減少廣譜抗生素的使用抑制抗生素耐藥性的上升。在導(dǎo)致尿膿病癥(urosepsis)的感染中、最嚴(yán)重的是uti，所公開的方法和裝置可具有臨床實(shí)用性，因?yàn)檫@些感染通常需要立即施用有效的抗生素。4在上面討論的示例性研究中，發(fā)現(xiàn)當(dāng)用含有單一菌株的樣本進(jìn)行挑戰(zhàn)時(shí)，示例性公開的裝置準(zhǔn)確且快速地確定了對各種抗生素的敏感性。為了能夠在多種感染物種的情況下進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(盡管多發(fā)性感染在尿膿病癥中并不常見(5％-11％)36)，示例性裝置的多個(gè)納升室可致力于復(fù)合組合的細(xì)菌以及局部代謝感測。使用能夠檢測代謝活性細(xì)菌的電化學(xué)方法，示例性公開的方法和裝置能夠使用相對短的30分鐘孵育期實(shí)現(xiàn)存活細(xì)菌的檢測。通過在示例性裝置中在小型化隔間內(nèi)濃縮和分析細(xì)菌，可以減少檢測存活細(xì)菌所需的時(shí)間。本文公開的化驗(yàn)可以用于監(jiān)測對抗生素進(jìn)行響應(yīng)的細(xì)菌代謝，以快速讀取抗生素敏感性輪廓。在采用基于標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)的敏感性測試結(jié)果之前，這種方法可以使得能夠快速施用抗生素。本發(fā)明描述了用于檢測細(xì)菌的代謝活性的示例，以測試對抗生素敏感性。然而，本公開也可以適用于檢測其它目標(biāo)細(xì)胞的代謝活性。例如，本發(fā)明可以酌情進(jìn)行修改，用于檢測哺乳動物細(xì)胞(例如，癌細(xì)胞)、真菌(例如酵母菌)，并且可以用于測試它們對旨在抑制其活性的化合物的敏感性。例如，可以使用類似的基于刃天青的化驗(yàn)來檢測哺乳動物細(xì)胞、或真菌的代謝活性。也可以使用其它報(bào)告化合物，例如亞甲基藍(lán)，甲或四唑鎓鹽。樣本也可以不是緩沖液或尿液樣本；例如，樣本可以是任何合適的生物或非生物樣本，包括生物樣本(例如血液樣本(其可以適當(dāng)?shù)仡A(yù)處理以避免堵塞示例性裝置中的微型過濾器)、唾液樣本、血漿(plasma)樣本、或其它組織樣本)或非生物樣本(例如水樣本(例如，用于測試供水中的細(xì)菌水平)或緩沖液樣本)?？梢赃m當(dāng)?shù)剡M(jìn)行預(yù)處理以從這些樣本中分離所針對的細(xì)胞。由于所公開的裝置和方法可以提供表示每個(gè)孔內(nèi)目標(biāo)細(xì)胞的代謝活性的測定結(jié)果，所公開的裝置和方法可用作樣本中代謝活性目標(biāo)細(xì)胞的相對量的測定(例如，與對照組相比較)。本公開的示例可用于估算樣本中的平均細(xì)胞數(shù)，因?yàn)榭蓹z測電化學(xué)信號的變化可能取決于影響報(bào)告化合物的細(xì)胞數(shù)量(例如，成比例)。為了改進(jìn)該估算，可以將來自多個(gè)孔的測量值一起進(jìn)行平均；附加地或可選地，孔可以具有多個(gè)電極以從相同孔獲得多次測量，這些都可以一起進(jìn)行平均。可以將測定結(jié)果與查找表格(lookup-table)或參考圖進(jìn)行比較，例如，該查詢表格或參考圖表示細(xì)胞已知濃度的預(yù)期測定結(jié)果。本申請的示例可以用于確定給定抗生素對給定微生物的最小抑制濃度(mic)。作為抗微生物敏感性試驗(yàn)(ast)報(bào)告的一部分，例如可以包括mic值以指導(dǎo)處方。如上所述的本發(fā)明實(shí)施方式僅是指實(shí)施例。本發(fā)明可以其它特定形式體現(xiàn)。或者，可以對本閥門進(jìn)行修改和變化而不偏離本發(fā)明的限定范圍。在本文中所公開和顯示的系統(tǒng)、設(shè)備和方法包含一定量的元件/部件的同時(shí)，系統(tǒng)、設(shè)備和組件可以進(jìn)行修改以包括額外或更少的該元件/部件。例如，雖然任何所公開的元件/部件中可以被稱為單數(shù)，但是本文公開的實(shí)施方式可以修改為包括多個(gè)這樣的元件/部件?？梢越M合來自一個(gè)或多個(gè)上述實(shí)施方式的所選特征以產(chǎn)生未明確描述的替代實(shí)施方式。所公開范圍內(nèi)的所有值和子范圍也已公開。本文中所述主題旨在覆蓋和包括技術(shù)中的所有適當(dāng)變化。提及的所有參考文獻(xiàn)以參考的方式全文納入本文。參考文獻(xiàn)1.s.b.levy和b.marshall,nat.med.,2004,10,s122–9。2.b.foxman,nat.rev.urol.,2010,7,653–60。3.m.a.pfaller和r.n.jones,arch.pathol.lab.med.,2006,130,767-778。4.f.m.e.wagenlehner,a.pilatz,和w.weidner,int.j.antimicrob.agents,2011,38,51–57。5.w.j.mcisaac和c.l.hunchak,med.decis.making,2011,31,405–11。6.v.perreten,l.vorlet-fawer,p.slickers,r.ehricht,p.kuhnert,和j.frey,j.clin.microbiol.,2005,43,2291。7.b.strommenger,c.kettlitz,g.werner,和w.witte,j.clin.microbiol.,2003,41,4089。8.s.shenai,f.krapp,j.allen,r.tahirli,r.blakemore,r.rustomjee,a.milovic,m.jones,s.m.o.brien,d.h.persing,s.ruesch-gerdes,e.gotuzzo,c.rodrigues,d.alland,和m.d.perkins,n.engl.j.med.,2010,363,1005–1015。9.k.e.mach,r.mohan,e.j.baron,m.-c.shih,v.gau,p.k.wong,和j.c.liao,j.urol.,2011,185,148–53。10.m.c.roberts,s.schwarz,和h.j.m.aarts,front.microbiol.,2012,3,384。11.g.longo,l.alonso-sarduy,l.m.rio,a.bizzini,a.trampuz,j.notz,g.dietler,和s.kasas,nat.nanotechnol.,2013,8,522–6。12.t.s.mann和s.r.mikkelsen,anal.chem.,2008,80,843–8。13.y.lu,j.gao,d.d.zhang,v.gau,j.c.liao,和p.k.wong,anal.chem.,2013,85,3971–6。14.p.ertl,b.unterladstaetter,k.bayer,和s.r.mikkelsen,anal.chem.,2000,72,4949–4956。15.p.ertl,m.wagner,e.corton,和s.r.mikkelsen,biosens.bioelectron.,2003,18,907–916。16.k.chotinantakul,w.suginta,和a.schulte,anal.chem.,2014,86,10315–10322。17.b.li,y.qiu,a.glidle,d.mcilvenna,q.luo,j.cooper,h.-c.shi,和h.yin,anal.chem.,2014,86,3131–3137。18.m.w.kadlec,d.you,j.c.liao,和p.k.wong,j.lab.autom.,2013,19,258–266。19.j.palomino,a.martin,m.camacho,h.guerra,j.swings,和f.portaels,antimicrob.agentschemother.,2002,42,2720–2722。20.j.q.boedicker,l.li,t.r.kline,和r.f.ismagilov,labchip.,2008,8,1265–72。21.k.churski,t.s.kaminski,s.jakiela,w.kamysz,w.baranska-rybak,d.b.weibel,和p.garstecki,labchip.,2012,12,1629–37。22.f.deiss,m.e.funes-huacca,j.bal,k.f.tjhung,和r.derda,labchip.,2014,14,167–71。23.n.j.cira,j.y.ho,m.e.dueck,和d.b.weibel,labchip.,2012,12,1052–9。24.c.h.chen,y.lu,m.l.y.sin,k.e.mach,d.d.zhang,v.gau,j.c.liao,和p.k.wong,anal.chem.,2010,82,1012–9。25.d.-k.kang,m.m.ali,k.zhang,s.s.huang,e.peterson,m.a.digman,e.gratton,和w.zhao,nat.commun.,2014,5,5427。26.m.safavieh,m.u.ahmed,m.tolba,和m.zourob,biosens.bioelectron.,2012,31,523–8。27.m.varshney,y.li,b.srinivasan,和s.tung,sensorsactuatorsbchem.,2007,128,99–107。28.k.hsieh,a.s.patterson,b.s.ferguson,k.w.plaxco,和h.t.soh,angew.chem.int.ed.,2012,51,4896–900。29.a.s.patterson,k.hsieh,h.t.soh,和k.w.plaxco,trendsbiotechnol.,2013,31,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