本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)生物學技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種維生素B12與BtuF蛋白相互作用的分析方法。

背景技術(shù)：

蛋白質(zhì)與配體的相互作用和識別是蛋白質(zhì)發(fā)揮其生物功能的重要途徑，在各種生命活動中扮演著非常重要的角色，因此，了解蛋白質(zhì)和配體之間的相互作用機制對于理解生物體調(diào)控機制有著至關(guān)重要的意義。大腸桿菌中維生素B12吸收系統(tǒng)由BtuB、BtuF、BtuCD組成。BtuF在細胞周質(zhì)中捕獲VB12后與BtuCD對接形成穩(wěn)定的BtuCDF復(fù)合物，并開始VB12由膜外向膜內(nèi)的運輸。

BtuF的兩個球形結(jié)構(gòu)域之間只有一個鉸鏈狀“連接器”，屬于周質(zhì)蛋白家族中第Ⅲ類。第Ⅲ類周質(zhì)蛋白，如與鋅結(jié)合的蛋白質(zhì)TroA[100]、與鎂離子結(jié)合的蛋白質(zhì)PsaA、與維生素B12結(jié)合的蛋白質(zhì)BtuF[Karpowich NK,et al.Crystal structures of the BtuF periplasmic-binding protein for vitamin B12suggest a functionally important reduction in protein mobility upon ligand binding.J Biol Chem[J].2003,278(10):8429-8434.]等，其空載狀態(tài)的晶體結(jié)構(gòu)和結(jié)合配體后的晶體結(jié)構(gòu)之間并無較明顯差異。然而近幾年的研究對此結(jié)論提出了質(zhì)疑。Kand[Kandt C,et al.Opening and Closing Motions in the Periplasmic Vitamin B12Binding Protein BtuF.Biochemistry[J].2006,45(44):13284-13292.]通過計算機模擬實驗認為BtuF是一種非常靈活的蛋白質(zhì)，它在空載和結(jié)合配體后構(gòu)象會一直發(fā)生“打開”、“閉合”等運動，但BtuF與VB12結(jié)合之后構(gòu)象更傾向于處于閉合狀態(tài)。LM等[Liu M,et al.Study on the mechanism of the BtuF periplasmic-binding protein for vitamin B12.Biophys Chem[J].2008,135(1-3):19-24.]也通過構(gòu)建BtuF、BtuCDF晶體結(jié)構(gòu)模型等計算機模擬實驗發(fā)現(xiàn)BtuF-VB12復(fù)合物釋放VB12過程中，自由能變化非常大，意味著BtuF-VB12復(fù)合物處于一種很穩(wěn)定的狀態(tài)。而另一方面又發(fā)現(xiàn)BtuF-VB12復(fù)合物的構(gòu)象也會由發(fā)生“扭曲”、“打開”等運動趨勢。

目前用來表征蛋白質(zhì)-配體的相互作用的分析方法和計算方法，如：量熱儀、熒光、傅里葉變換紅外光譜(FTIR)、表面等離子體共振(SPR)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、核磁共振(NMR)和X射線晶體衍射等，很難提供蛋白質(zhì)與配體結(jié)合其構(gòu)象發(fā)生的變化，需要消耗大量的樣品和時間。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對傳統(tǒng)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)生物學研究方法中的靈敏度低、對蛋白質(zhì)分子量有限制、所需樣品量大、所需樣品純度較高和圖譜解析耗時等缺點，本發(fā)明提供了一種維生素B12與BtuF蛋白相互作用的分析方法，能夠?qū)崿F(xiàn)蛋白質(zhì)與配體相互作用的高效、準確檢測分析。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種維生素B12與BtuF蛋白相互作用的分析方法，將BtuF蛋白置換到pH8.0的醋酸銨緩沖液中，按摩爾比1：1加入維生素B12制備BtuF-VB溶液，在相同的質(zhì)譜條件下，對BtuF蛋白、BtuF-VB、蛋白質(zhì)標準品進行質(zhì)譜分析，采集三者的離子淌度數(shù)據(jù)，并對離子淌度數(shù)據(jù)進行處理，得到各自的漂移時間分布，根據(jù)蛋白質(zhì)標準品的漂移時間分布和理論碰撞橫截面積，BtuF、BtuF-VB的漂移時間分布，得到BtuF、BtuF-VB的碰撞橫截面積，根據(jù)漂移時間分布和碰撞橫截面積，分析BtuF-VB的相互作用，具體步驟如下：

第一步，將BtuF蛋白和蛋白質(zhì)標準品用超濾膜進行脫鹽處理，將脫鹽后的BtuF蛋白置換到pH8.0的醋酸銨緩沖液中，蛋白質(zhì)標準品置換到pH7.4的醋酸銨緩沖液中；

第二步，在第一步得到的BtuF蛋白溶液中加入維生素B12的醋酸銨緩沖溶液，得到BtuF-VB復(fù)合物溶液；

第三步，在相同的質(zhì)譜條件下，對BtuF蛋白、BtuF-VB和蛋白質(zhì)標準品進行質(zhì)譜分析，采集各自的離子淌度數(shù)據(jù)；

第四步，將得到的離子淌度數(shù)據(jù)處理，得到BtuF蛋白、BtuF-VB、蛋白質(zhì)標準品的漂移時間分布；

第五步，根據(jù)蛋白質(zhì)標準品的漂移時間分布和理論碰撞橫截面積，以及BtuF蛋白、BtuF-VB的漂移時間分布，得到BtuF蛋白、BtuF-VB的碰撞橫截面積，最后根據(jù)漂移時間分布和碰撞橫截面積，分析BtuF-VB的相互作用。

第一步中，BtuF蛋白脫鹽時，溫度為4℃，離心轉(zhuǎn)速為14000rcf，時間不低于30min，重復(fù)不少于5次。

第二步中，BtuF蛋白與維生素B12的摩爾比為1:1。

第三步中，離子淌度質(zhì)譜儀條件為：針尖電壓1.5kV，錐孔電壓10V，源補償電壓10V，一級碰撞室電壓2V，二級碰撞室電壓2V，一級碰撞室和離子淌度分離室之間的反電壓28V，碰撞室內(nèi)氬氣流速2mL/min，氦氣室氣體流速150mL/min，離子淌度分離室中用氮氣做分離氣體且流速為60mL/min，離子淌度分離室行波速度1100m/s，離子淌度分離室行波振幅37V。

第三步中，所述的蛋白質(zhì)標準品為乙醇脫氫酶、刀豆蛋白、抗生物素蛋白、β-乳球蛋白、肌球蛋白、細胞色素c和血清淀粉樣蛋白。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下顯著優(yōu)點：(1)操作方法簡單；(2)所需樣品量少；(3)對樣品純度要求不高；(4)實驗重復(fù)性好；(5)圖譜解析較為簡單。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實例1得到的BtuF和BtuF-VB的漂移時間分布圖。

圖2是本發(fā)明實例1中由蛋白質(zhì)標準品的漂移時間和理論碰撞橫截面積得到的校正曲線以及漂移時間第二步校正值與碰撞橫截面積的關(guān)系式。

圖3是本發(fā)明實例1中由蛋白質(zhì)標準品的漂移時間和理論碰撞橫截面積得到的校正曲線以及漂移時間第二步校正值與碰撞橫截面積的關(guān)系式。

圖4是本發(fā)明實例1中由蛋白質(zhì)標準品的漂移時間和理論碰撞橫截面積得到的校正曲線以及漂移時間第二步校正值與碰撞橫截面積的關(guān)系式。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明作進一步詳細說明。

實施例1

第一步，BtuF蛋白質(zhì)和所有的蛋白質(zhì)標準品(包括乙醇脫氫酶、刀豆蛋白、抗生物素蛋白、β-乳球蛋白、肌球蛋白、細胞色素c和血清淀粉樣蛋白)都用10kD的超濾膜進行脫鹽處理，離心溫度為4℃，離心轉(zhuǎn)速14000rcf，離心30min，重復(fù)5次，其中脫鹽后的BtuF蛋白質(zhì)置換到pH8.0的醋酸銨緩沖液中，脫鹽后的蛋白質(zhì)標準品置換到pH7.4的醋酸銨緩沖液中；

第二步，在第一步得到的BtuF蛋白溶液中加入等摩爾量的、用pH8.0的醋酸銨緩沖液配制的維生素B12溶液，得到BtuF-VB復(fù)合物溶液；

第三步，吸取2μL終濃度為10uM BtuF蛋白、BtuF-VB、終濃度為5uM蛋白質(zhì)標準品上質(zhì)譜，調(diào)節(jié)好儀器參數(shù)如：工作模式為離子淌度模式，電離模式為正離子模式，針尖電壓1.5kV，錐孔電壓10V，源補償電壓10V，一級碰撞室電壓2V，二級碰撞室電壓2V，一級碰撞室和離子淌度分離室之間的反電壓28V，碰撞室內(nèi)氬氣流速2mL/min，氦氣室氣體流速150mL/min，離子淌度分離室中用氮氣做分離氣體且流速為60mL/min，離子淌度分離室行波速度11001100m/s，離子淌度分離室行波振幅37V，采集BtuF蛋白、BtuF-VB、各蛋白質(zhì)標準品的離子淌度數(shù)據(jù)；

第四步，將第三步得到的離子淌度數(shù)據(jù)經(jīng)Masslynx和Driftscope軟件處理，得到BtuF蛋白、BtuF-VB、各蛋白質(zhì)標準品的漂移時間分布；

第五步，根據(jù)蛋白質(zhì)標準品的漂移時間分布和理論碰撞橫截面積，以及BtuF蛋白、BtuF-VB的漂移時間分布，得到BtuF蛋白、BtuF-VB的碰撞橫截面積，最后根據(jù)漂移時間分布和碰撞橫截面積，分析BtuF-VB的相互作用。

表1三次獨立重復(fù)實驗的結(jié)果

結(jié)果如圖1，可知BtuF和BtuF-VB的漂移時間為14.94ms、16.22ms，并計算得知其碰撞橫截面積分別為與分別由BtuF、BtuF-VB晶體結(jié)構(gòu)得到的碰撞橫截面積一致，表明BtuF、BtuF-VB蛋白在質(zhì)譜氣相中仍然保留其在溶液環(huán)境中的天然構(gòu)象，因此我們的實驗設(shè)計具有生理意義。漂移時間分布一般會呈現(xiàn)高斯分布且含有多種構(gòu)象狀態(tài)的離子會導致較寬的漂移時間分布，可根據(jù)漂移時間分布來判斷蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的動力學變化以及結(jié)構(gòu)異質(zhì)性等。BtuF的漂移時間半峰寬分別為1.417ms，而當其與維生素B12結(jié)合后漂移時間半峰寬降為1.05ms，表明BtuF-VB復(fù)合物的結(jié)構(gòu)均一性更好而且構(gòu)象處于更加緊湊的狀態(tài)。

圖2為用蛋白質(zhì)標準品的漂移時間分布，理論碰撞橫截面積和BtuF、BtuF-VB的漂移時間分布，計算BtuF、BtuF-VB碰撞橫截面積時的校正曲線。得到碰撞橫截面積與漂移時間校正值的關(guān)系式為y＝43.323x+508.35，得到BtuF、BtuF-VB的漂移時間分別為且線性相關(guān)系數(shù)為0.9931，表明此此趨勢線具有很好的可靠性。

圖3是實例1中在相同的實驗條件下重復(fù)此實驗，并用蛋白質(zhì)標準品的漂移時間分布，理論碰撞橫截面積和BtuF、BtuF-VB的漂移時間分布，計算BtuF、BtuF-VB碰撞橫截面積時的校正曲線。得到碰撞橫截面積與漂移時間校正值的關(guān)系式為y＝43.431x+509.69，得到BtuF、BtuF-VB的漂移時間分別為且線性相關(guān)系數(shù)為0.9923，表明此趨勢線具有很好的可靠性。圖4是實例1中在相同的實驗條件下重復(fù)此實驗，并用蛋白質(zhì)標準品的漂移時間分布，理論碰撞橫截面積和BtuF、BtuF-VB的漂移時間分布，計算BtuF、BtuF-VB碰撞橫截面積時的校正曲線。得到碰撞橫截面積與漂移時間校正值的關(guān)系式為y＝48.842x+466.82，得到BtuF、BtuF-VB的漂移時間分別為且線性相關(guān)系數(shù)為0.9935，表明此趨勢線具有很好的可靠性。

表1是三次獨立重復(fù)實驗的結(jié)果匯總。BtuF、BtuF-VB12復(fù)合物的碰撞橫截面積分別為BtuF、BtuF-VB12復(fù)合物的漂移時間分布分別為1.299±0.125ms、1.050±0.079ms。