本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)艱難梭菌的試劑盒及其用途。
背景技術(shù)：
：艱難梭菌(C.DIFF)是一種革蘭氏染色陽(yáng)性、有芽孢、專(zhuān)性厭氧的梭狀桿菌，是唯一能引起院內(nèi)感染的厭氧菌，也是引起院內(nèi)感染病原體中唯一能形成芽孢的細(xì)菌。艱難梭菌感染引起的腹瀉主要原因是因?yàn)榭股氐氖褂脤?dǎo)致菌群細(xì)菌組分改變引起菌群生態(tài)失調(diào)，從而使艱難梭菌菌群增殖，最終導(dǎo)致腹瀉。較高的發(fā)生率已經(jīng)被認(rèn)為發(fā)生在那些長(zhǎng)期暴露于抗生素以及具有嚴(yán)重潛在并存病的免疫能力低下的老年和兒童患者中。感染的癥狀變化范圍廣泛，從無(wú)癥狀狀態(tài)或輕度艱難梭菌感染到嚴(yán)重及威脅生命的狀態(tài)。自從21世紀(jì)初，艱難梭菌感染的發(fā)生率和嚴(yán)重性急劇上升，在發(fā)達(dá)國(guó)家，艱難梭菌是院內(nèi)感染性腹瀉的首要病因，高達(dá)20％報(bào)道的抗生素相關(guān)性腹瀉以及近乎所有的假膜性結(jié)腸炎都是由艱難梭菌感染引起的。因此，高效檢測(cè)艱難梭菌非常重要。臨床上各種各樣的檢測(cè)方式不斷發(fā)展，包括從最初的產(chǎn)毒株培養(yǎng)，細(xì)胞毒性檢測(cè)和毒素中和試驗(yàn)，到現(xiàn)在最常用的酶聯(lián)免疫兩步法、三步法和PCR基因檢測(cè)法。PCR基因檢測(cè)法檢測(cè)靈敏度過(guò)高，但導(dǎo)致的假陽(yáng)性率也高。酶聯(lián)免疫法二步法也存在檢測(cè)效果不佳的問(wèn)題，需要進(jìn)一步改進(jìn)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供了一種新的用于檢測(cè)艱難梭菌的試劑盒。本發(fā)明艱難梭菌的酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試劑盒，它包括如下組分：稀釋液、封閉液、包被有艱難梭菌抗體的酶標(biāo)板、酶標(biāo)二抗、陽(yáng)性對(duì)照品、洗滌液、顯色液和終止液，其中，稀釋液為每100ml含有1mlNP-40、0.5～2mlTritonX-100、1gBSA，0.05mlTween20的磷酸鹽緩沖液。其中，稀釋液為每100ml含有1mlNP-40、0.5～2mlTritonX-100、1gBSA，0.05mlTween20的磷酸鹽緩沖液。所述稀釋液為每100ml含有1mlNP-40、0.5～1mlTritonX-100、1gBSA，0.05mlTween20的磷酸鹽緩沖液；進(jìn)一步優(yōu)選所述稀釋液為每100ml含有1mlNP-40、0.5mlTritonX-100、1gBSA，0.05mlTween20的磷酸鹽緩沖液。優(yōu)選地，所述封閉液每100ml含有2gBSA、1g-5g海藻糖、1ml-5mlFBS。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述封閉液為每100ml含有2gBSA、2g-3g海藻糖、2ml-3mlFBS的磷酸鹽緩沖液；優(yōu)選所述封閉液為每100ml含有2gBSA、3g海藻糖、3mlFBS的磷酸鹽緩沖液。優(yōu)選地，所述酶標(biāo)板上包被的艱難梭菌抗體為鼠抗艱難梭菌谷氨酸脫氫酶單克隆抗體以及羊抗艱難梭菌毒素A多克隆抗體和羊抗艱難梭菌毒素B多克隆抗體的混合物。優(yōu)選地，所述包被有艱難梭菌抗體的酶標(biāo)板按照如下方法制備：取抗體，稀釋制成溶液，以抗體計(jì)0.2-0.5微克/孔加入酶標(biāo)板的孔中，4℃包被10-14小時(shí)。優(yōu)選地，所述酶標(biāo)二抗中的抗體分別為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗艱難梭菌谷氨酸脫氫酶多克隆抗體以及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗艱難梭菌毒素A多克隆抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗艱難梭菌毒素B多克隆抗體的混合物。優(yōu)選地，所述酶標(biāo)二抗包括酶標(biāo)二抗1和酶標(biāo)二抗2，酶標(biāo)二抗1為每100ml含有1g-2gBSA、5ml-20mlFBS、20-50μg辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗艱難梭菌谷氨酸脫氫酶多克隆抗體、50ml甘油的磷酸鹽緩沖液；酶標(biāo)二抗2為每100ml含有1g-2gBSA、5ml-20mlFBS、20-50μg辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗艱難梭菌毒素A多克隆抗體、20-50μg辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗艱難梭菌毒素B多克隆抗體、50ml甘油的磷酸鹽緩沖液。優(yōu)選地，所述洗滌液是含有0.05％Tween20的磷酸鹽緩沖液；所述顯色液包括含過(guò)氧化物的A液及含四甲基聯(lián)苯胺的B液。所述終止液是濃度為0.5M-2M的硫酸溶液。本發(fā)明還提供了前述試劑盒在檢測(cè)艱難梭菌中的用途。NP-40：乙基苯基聚乙二醇。TritonX-100：聚乙二醇辛基苯基醚。BSA：牛血清白蛋白。Tween20：吐溫20。FBS：胎牛血清。本發(fā)明稀釋液通過(guò)各個(gè)組分的配合，可有效的幫助抗體捕獲樣本中的抗原，提高產(chǎn)品的敏感性。采用本發(fā)明試劑盒，應(yīng)用酶聯(lián)免疫法二步法可以高效快速檢測(cè)艱難梭菌，應(yīng)用前景良好。下面通過(guò)具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但是并不是對(duì)本發(fā)明的限制，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。具體實(shí)施方式實(shí)施例1本發(fā)明用于檢測(cè)艱難梭菌的試劑盒1、本發(fā)明試劑盒的組成(1)本發(fā)明稀釋液：配方1：PBS(PH7.4)、1％NP-40、0.5％TritonX-100、1％BSA，0.05％Tween20配方2：PBS(PH7.4)、1％NP-40、1％TritonX-100、1％BSA，0.05％Tween20配方3：PBS(PH7.4)、1％NP-40、2％TritonX-100、1％BSA，0.05％Tween20PBS：磷酸緩沖鹽溶(2)本發(fā)明封閉液配方1：PBS、2％BSA、1％海藻糖、1％FBS配方2：PBS、2％BSA、2％海藻糖、2％FBS配方3：PBS、2％BSA、3％海藻糖、3％FBS配方4：PBS、2％BSA、5％海藻糖、5％FBS(3)其余組分：包被有特異性抗體的酶標(biāo)板、HRP酶標(biāo)二抗、陽(yáng)性對(duì)照品(GLDH重組抗原，ToxinA/B重組抗原)、洗滌液、顯色液、終止液。特異性抗體的酶標(biāo)板：特異性抗體為鼠抗艱難梭菌谷氨酸脫氫酶單克隆抗體，羊抗艱難梭菌毒素A多克隆抗體和羊抗艱難梭菌毒素B多克隆抗體，均購(gòu)自南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司；各抗體以碳酸鹽稀釋后，以0.2-0.5微克/孔加入，4℃包被10-14小時(shí)，其中，鼠抗艱難梭菌谷氨酸脫氫酶單克隆抗體單獨(dú)一個(gè)孔，羊抗艱難梭菌毒素A多克隆抗體和羊抗艱難梭菌毒素B多克隆抗體混在一起。HRP酶標(biāo)二抗：辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗艱難梭菌谷氨酸脫氫酶多克隆抗體，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗艱難梭菌毒素A多克隆抗體，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗艱難梭菌毒素B多克隆抗體，購(gòu)自武漢博歐特生物科技有限公司，制成每100ml含有1g-2gBSA、5ml-20mlFBS、抗體20-50微克(每種抗體20-50微克)、50ml甘油的磷酸鹽緩沖液，pH5.0-7.0。陽(yáng)性對(duì)照品：含有谷氨酸脫氫酶重組抗原，ToxinA/B重組抗原的磷酸鹽緩沖液。谷氨酸脫氫酶重組抗原，ToxinA/B重組抗原均購(gòu)自南京中鼎生物技術(shù)有限公司。洗滌液：每100ml含0.05mlTween20的磷酸鹽緩沖液。顯色液：含過(guò)氧化物的A液及含TMB(四甲基聯(lián)苯胺)的B液。購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，使用時(shí)A液和B液等比混合后100微升/孔加入顯色。終止液：每1L含有0.5M-2M的硫酸溶液。以下用實(shí)驗(yàn)例的方式來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的有益效果：實(shí)驗(yàn)例1與現(xiàn)有通用稀釋液的比較1、實(shí)驗(yàn)材料本發(fā)明試劑盒：采用本發(fā)明實(shí)施例1的試劑盒，其中封閉液為配方2，稀釋液分別采用配方1～配方10的稀釋液。配方1：PBS(PH7.4)、1％NP-40、0.5％TritonX-100、1％BSA，0.05％Tween20配方2：PBS(PH7.4)、1％NP-40、1％TritonX-100、1％BSA，0.05％Tween20配方3：PBS(PH7.4)、1％NP-40、2％TritonX-100、1％BSA，0.05％Tween20配方4：PBS(PH7.4)、0.1％NP-40、1％BSA、0.05％Tween20配方5：PBS(PH7.4)、1％NP-40、1％BSA、0.05％Tween20配方6：PBS(PH7.4)、5％NP-40、1％SDS、1％BSA，0.05％Tween20配方7：PBS(PH7.4)、1％NP-40、1％SDS、1％BSA，0.05％Tween20配方8：PBS(PH7.4)、1％NP-40、2％SDS、1％BSA，0.05％Tween20配方9：PBS(PH7.4)、1％NP-40、1％SDS、0.5％TritonX-100、1％BSA，0.05％Tween20配方10：PBS(PH7.4)、1％NP-40、2％SDS、0.5％TritonX-100、1％BSA，0.05％Tween20對(duì)照試劑盒：除了稀釋液為通用稀釋液以外，其余組分同本發(fā)明試劑盒，通用稀釋液為：PBS(PH7.4)、1％BSA、0.05％Tween20。2、實(shí)驗(yàn)方法取GLDH重組抗原、陽(yáng)性樣本1，2(產(chǎn)毒艱難梭菌培養(yǎng)上清)，陰性樣本(普通大腸桿菌培養(yǎng)上清)和空白(空白為稀釋液)，采用本發(fā)明試劑盒和對(duì)照試劑盒分別檢測(cè)。檢測(cè)方法如下：分別用不同的稀釋液稀釋重組抗原、陰性樣本、陽(yáng)性樣本，并以稀釋液作為空白對(duì)照，在包被有特異性抗體的酶標(biāo)板孔里面分別加入50微升抗原/陰性樣本/陽(yáng)性樣本/稀釋液對(duì)照和50微升HRP酶標(biāo)二抗，37℃孵育1小時(shí)后，TMB顯色，顯色結(jié)束后終止液終止，并在450nm波長(zhǎng)讀數(shù)。3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表1所示：表1采用不同稀釋液檢測(cè)的結(jié)果抗原/樣本通用稀釋液配方1配方2配方3配方4配方5配方6配方7配方8配方9配方10GLDH重組抗原1.5501.6591.0670.9981.0861.8940.2520.4520.3320.8980.776陰性樣本0.1190.1400.1000.2300.0560.1170.4080.0340.0680.2000.170陽(yáng)性樣本10.2991.9991.5650.7980.0710.4300.2110.0780.0890.6890.430陽(yáng)性樣本20.2781.9661.0470.4900.0750.4050.2430.0690.0350.4420.331空白0.0620.0550.0560.0880.1000.0580.0620.0550.0470.0680.098如上表1可知，使用通用稀釋液檢測(cè)陽(yáng)性樣本1和陽(yáng)性樣本2，其OD值低，結(jié)果呈弱陽(yáng)性，接近本試劑盒的cutoff值，容易造成誤判。而使用本發(fā)明配方(配方1、2、3)，陽(yáng)性樣本的OD值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于通用稀釋液，也高于其他的配方，用于實(shí)際檢測(cè)時(shí)，產(chǎn)品的敏感性高，優(yōu)選配方1和2，最優(yōu)選配方1，檢測(cè)時(shí)陽(yáng)性樣本1和陽(yáng)性樣本2為強(qiáng)陽(yáng)性，同時(shí)陽(yáng)性對(duì)照(重組抗原)的檢測(cè)值不低于通用稀釋液的檢測(cè)值。ToxinA和ToxinB對(duì)稀釋液的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)：表2ToxinA和ToxinB驗(yàn)證結(jié)果由于本試劑盒還包含了ToxinA/ToxinB兩個(gè)抗原的檢測(cè)，因此利用ToxinA/ToxinB兩個(gè)抗原對(duì)本發(fā)明稀釋液進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證結(jié)果如上表2所示，使用通用稀釋液檢測(cè)陽(yáng)性樣本1和陽(yáng)性樣本2，其OD值低，結(jié)果呈弱陽(yáng)性，接近本試劑盒的cutoff值，容易造成誤判。而使用本發(fā)明稀釋液(配方1)可檢測(cè)出陽(yáng)性樣本1和陽(yáng)性樣本2為強(qiáng)陽(yáng)性，同時(shí)陽(yáng)性對(duì)照(重組抗原)的檢測(cè)值與通用稀釋液的檢測(cè)值無(wú)明顯差異。因此，本發(fā)明稀釋液(配方1)可有效提高本試劑盒產(chǎn)品的敏感性。實(shí)驗(yàn)例2與現(xiàn)有通用封閉液的比較1、實(shí)驗(yàn)材料本發(fā)明試劑盒：采用本發(fā)明實(shí)施例1的試劑盒，其中封閉液為配方1～配方4，稀釋液分別采用配方1。對(duì)照試劑盒：除了稀釋液為通用封閉液以外，其余組分同本發(fā)明試劑盒，通用封閉液為：PBS(PH7.4)、1％BSA、0.05％Tween20。2、實(shí)驗(yàn)方法取GLDH重組抗原、陽(yáng)性樣本1，2(產(chǎn)毒艱難梭菌培養(yǎng)上清)，陰性樣本(普通大腸桿菌培養(yǎng)上清)和空白(空白為稀釋液)，采用本發(fā)明試劑盒和對(duì)照試劑盒分別檢測(cè)。檢測(cè)方法如下：分別用不同的封閉液對(duì)包被有特異性抗體的酶標(biāo)板進(jìn)行封閉，各配方的封閉液封閉完以后，一部分于4℃保存，同時(shí)另一部分于37℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行加速試驗(yàn)，10天后對(duì)各條件的酶標(biāo)板進(jìn)行ELISA檢測(cè)。檢測(cè)步驟：在包被有特異性抗體的酶標(biāo)板孔里面分別加入50微升抗原/陰性樣本/陽(yáng)性樣本/稀釋液對(duì)照和50微升HRP酶標(biāo)二抗，37℃孵育1小時(shí)后，TMB顯色，顯色結(jié)束后終止液終止，并在450nm波長(zhǎng)讀數(shù)。3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表3所示：表3采用不同封閉液檢測(cè)的結(jié)果如上表3可知，使用通用封閉液對(duì)酶標(biāo)板進(jìn)行封閉保護(hù)，酶標(biāo)板在37℃加速10天后，其檢測(cè)重組抗原和陽(yáng)性樣本的OD值均明顯下降，證明酶標(biāo)板內(nèi)抗體活性下降，酶標(biāo)板穩(wěn)定性較差。而使用本發(fā)明封閉液(配方1-配方4)對(duì)酶標(biāo)板進(jìn)行封閉保護(hù)，酶標(biāo)板在37℃加速10天后，其檢測(cè)重組抗原和陽(yáng)性樣本的OD值與加速前(4℃保存)幾乎無(wú)異，證明酶標(biāo)板內(nèi)抗體活性及基本保持不變，酶標(biāo)板穩(wěn)定性較好，其中，優(yōu)選配方2和3，最優(yōu)選配方3。ToxinA和ToxinB對(duì)封閉液的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)：表4ToxinA和ToxinB驗(yàn)證結(jié)果由于本試劑盒還包含了ToxinA/ToxinB兩個(gè)抗原的檢測(cè)，因此利用ToxinA/ToxinB兩個(gè)抗原對(duì)本發(fā)明封閉液進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證結(jié)果如上表4所示，使用通用封閉液對(duì)酶標(biāo)板進(jìn)行封閉保護(hù)，酶標(biāo)板在37℃加速10天后，其檢測(cè)重組抗原和陽(yáng)性樣本的OD值均明顯下降，證明酶標(biāo)板內(nèi)抗體活性下降，酶標(biāo)板穩(wěn)定性較差。而使用本發(fā)明封閉液(配方1-配方4)對(duì)酶標(biāo)板進(jìn)行封閉保護(hù)，酶標(biāo)板在37℃加速10天后，其檢測(cè)重組抗原和陽(yáng)性樣本的OD值與加速前(4℃保存)幾乎無(wú)異，證明酶標(biāo)板內(nèi)抗體活性及基本保持不變，酶標(biāo)板穩(wěn)定性較好。綜上，本發(fā)明試劑盒可以高效檢測(cè)艱難梭菌，且產(chǎn)品穩(wěn)定性好，保質(zhì)期長(zhǎng)，應(yīng)用前景良好。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3