本發(fā)明涉及一種宮頸癌的篩查試劑盒。
背景技術：
：宮頸癌是女性的第二大惡性腫瘤，發(fā)病率僅次于乳腺癌，每年新增宮頸癌的病例數(shù)超過150萬，死于宮頸癌的人數(shù)超過30萬。宮頸癌是由致癌的人類乳頭瘤病毒(HPV)持續(xù)感染引起的。雖然HPV感染是一個不可或缺的因素，但它不足以引起癌癥。大多數(shù)急性HPV感染引起的低級別前體病變，超過90％的病例會在幾個月后自發(fā)清除，只有小于10％的病例會最終進展為高級別病變或浸潤性癌。宮頸上皮內(nèi)瘤變是明確的宮頸癌前病變，并且在癌前病變到惡性腫瘤的演變過程中，各種癌基因和侵襲性相關基因的表達明顯異常。目前，宮頸癌的具體發(fā)病機制和導致宮頸上皮內(nèi)瘤變發(fā)展到宮頸癌的關鍵分子尚未闡明。因此，新型生物標志物的檢測可能在宮頸癌早期診斷中具有重要的作用。SPARCL1(SPARCL1)，SPARCL1(secretedproteinacidicandrichincysteines-like1)最早是由Johnston等于1990年從鼠腦表達文庫中分離提取出來的一種分泌型細胞外基質(zhì)糖蛋白。1995年，Girard和Springer從人扁桃體淋巴組織中高內(nèi)皮微靜脈的內(nèi)皮細胞中將SPARCL1克隆出來，從此人們對SPARCL1的研究愈加深入。SPARCL1是SPARC家族成員之一，又被稱為Hevin、SPARC-like1、SC1、MAST9、RAGS-1、QR1和ECM2。可參與多種生理功能(如細胞增殖、肌肉分化等)，并通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞的黏附作用來促進淋巴細胞轉運。SPARCL1廣泛表達于人類正常組織，特別是在肺、胎盤、骨骼肌、胰腺、心臟和大腦中，而腎中表達較低，肝則缺失，在人類生長發(fā)育過程中起到重要作用?，F(xiàn)有研究還發(fā)現(xiàn)SPARCL1基因表達異常與消化系統(tǒng)腫瘤、泌尿系統(tǒng)腫瘤、非小細胞肺癌、卵巢癌、子宮肌瘤、乳腺癌及神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展相關，并參與調(diào)節(jié)黏著斑等信號通路。未見SPARCL1與宮頸癌相關的報道。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種創(chuàng)傷小、副作用小、便于使用的宮頸癌檢測試劑盒。本發(fā)明宮頸癌的篩查試劑盒，它包括任選的用于檢測血液中SPARCL1表達水平的試劑。其中，所述檢測血液中SPARCL1表達水平的試劑是ELISA檢測用試劑。其中，所述檢測血液中SPARCL1表達水平的試劑是Western-blot檢測方法用試劑。本發(fā)明還提供了檢測血液中SPARCL1表達水平的試劑在制備宮頸癌篩查用試劑中的用途。其中，所述檢測血液中SPARCL1表達水平的試劑是ELISA檢測用試劑。其中，所述檢測血液中SPARCL1表達水平的試劑是Western-blot檢測方法用試劑。本發(fā)明試劑盒通過檢測SPARCL1(SPARCL1)的表達水平，可以判斷待檢人群患宮頸癌的風險：若SPARCL1(SPARCL1)的表達水平低，則患宮頸癌的風險高，可用于臨床宮頸癌的輔助診斷，本發(fā)明試劑盒僅僅只需采集待檢人群的血液，就可以篩查其患宮頸癌的風險，創(chuàng)傷小、副作用小、使用方便，臨床應用前景良好。顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。以下通過實施例形式的具體實施方式，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進一步的詳細說明。但不應將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術均屬于本發(fā)明的范圍。附圖說明圖1SPARC1在宮頸癌組織樣本和患者血清中表達水平。A.SPARCL1的表達與臨床分期有關(P＝0.0332).B.SPARCL1的表達與腫瘤分級有關(P＝0.0379).C.隨著宮頸癌的發(fā)展,SPARCL1的表達明顯減少.D.與正常相比,宮頸癌血清中SPARCL1表達下調(diào)。具體實施方式實驗材料：宮頸癌組織微陣列(CR602a和CR806)購買自BiomaxUS(MD，USA)?？筍PARCL1多克隆抗體獲自ProteinTechGroup，Inc(中國武漢)。人類SPARCL1ELISA試劑盒(EME-H8276)購買自KITZOME(中國深圳)。所有其他試劑盒或試劑購買自碧云天生物技術有限公司(中國上海)。實施例1SPARCL1(SPARCL1)的表達水平與宮頸癌的關系一、實驗方法1、樣本本研究中收集的血清樣本和進行的實驗，由成都醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院倫理委員會根據(jù)指南標準批準。在第一次手術之前和在接受任何治療之前的患者中收集血液。2、血液中SPARCL1(SPARCL1)表達水平的檢測方法2.1血液分離抽取臨床患者及健康對照血液，EDTA抗凝后離心(1200rpm，10min)，將上清吸取后進行第二次離心(3000rpm，15min)，吸取上清分裝后-80度保存；2.2ELISA檢測使用ELISA試劑盒(KITZOME，中國深圳)根據(jù)制造商的說明書測量血清中的SPARCL1水平并定量。每個血清樣本分析三次。檢測步驟：2.2.1加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔，標準孔加系列稀釋度的標準品，空白孔加樣品稀釋液100ul，待測孔加待測樣品；各孔加完后，給酶標板覆膜，37℃孵育60min。2.2.2洗板：棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2min，洗滌液350ul/孔，甩干并在吸水紙上輕拍將孔內(nèi)液體排干。2.2.3加待測抗體：立即每孔加入配好的檢測抗體工作液100ul，37℃孵育60min。2.2.4洗板：棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2min，洗滌液350ul/孔，甩干并在吸水紙上輕拍將孔內(nèi)液體排干。2.2.5加底物讀數(shù)：每孔加底物溶液90ul，酶標板上覆膜37℃避光孵育15min。每孔加終止液50ul，終止反應。立即用酶標儀在450nm波長測量各孔的光密度(OD值)。2.2.6濃度計算：根據(jù)標準孔OD值及相對應的已知濃度，制作標準曲線。根據(jù)標準曲線計算樣品中SPARCL1的濃度。2.3結果統(tǒng)計至少進行三次獨立實驗。GraphPadPrism5(SanDiego，CA)單因素方差分析和雙尾T檢驗用于比較各種處理的效果。數(shù)據(jù)顯示為均數(shù)±標準誤。P<0.05被認為具有統(tǒng)計學意義。3、血漿中SPARCL1(SPARCL1)的表達水平與宮頸癌的相關性檢測結果如下表1和圖1：表1血漿中SPARCL1(SPARCL1)與宮頸癌的相關性SPARCL1(SPARCL1)的表達平均水平健康對照8.294±1.159ng/ml宮頸癌患者3.651±0.581ng/ml經(jīng)過統(tǒng)計學分析，二者的差異顯著(P<0.05)。由表1和圖1可以看出，與健康人群相比，宮頸癌患者的血液中SPARCL1表達水平明顯升高，且差異顯著(P<0.05)；由以上結果可以看出，與健康人群相比，宮頸癌患者的SPARCL1(SPARCL1)表達水平顯著降低(P<0.05)，說明宮頸癌與血液中SPARCL1(SPARCL1)的表達水平呈負相關，血液中SPARCL1(SPARCL1)的低表達會顯著提高患宮頸癌的可能性。因此，可以通過檢測待檢人群血液中SPARCL1(SPARCL1)的表達水平，將宮頸癌的易感人群篩查出來。實施例2本發(fā)明檢測血液SPARCL1(SPARCL1)的試劑盒的組成及其使用方法一、ELISA檢測試劑盒1、試劑盒的組成檢測試劑盒(50人份)：組分體積捕獲抗體(Captureantibody)5ml(4.0ug/ml)標準品(SPARCL1standard)2ml(12000pg/ml)檢測抗體(Detectionantibody)5ml(100ng/ml)酶聯(lián)免疫親和素(Streptavidin-HRP)25ul(1:200稀釋)底物溶液(Substratesolution)5ml終止液(Stopsolution)2.5ml洗滌液(Washbuffer)200ml試劑稀釋液(reagentdiluent)50ml2、試劑盒的使用方法抽取待檢樣本血液，EDTA抗凝后離心(1200rpm，10min)，將上清吸取后進行第二次離心(3000rpm，15min)，吸取上清，采用如下方法檢測SPARCL1(SPARCL1)的表達水平：2.1加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔，標準孔加系列稀釋度的標準品，空白孔加樣品稀釋液100ul，待測孔加待測樣品；各孔加完后，給酶標板覆膜，37℃孵育60min。2.2洗板：棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2min，洗滌液350ul/孔，甩干并在吸水紙上輕拍將孔內(nèi)液體排干。2.3加待測抗體：立即每孔加入配好的檢測抗體工作液100ul，37℃孵育60min。2.4洗板：棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2min，洗滌液350ul/孔，甩干并在吸水紙上輕拍將孔內(nèi)液體排干。2.5加底物讀數(shù)：每孔加底物溶液90ul，酶標板上覆膜37℃避光孵育15min。每孔加終止液50ul，終止反應。立即用酶標儀在450nm波長測量各孔的光密度(OD值)。2.6濃度計算：根據(jù)標準孔OD值及相對應的已知濃度，制作標準曲線。根據(jù)標準曲線計算樣品中SPARCL1的濃度。綜上，本發(fā)明試劑盒通過檢測SPARCL1(SPARCL1)的表達水平，可以篩查待檢人群患宮頸癌的風險：若SPARCL1(SPARCL1)的表達水平低，則患宮頸癌的風險高，可用于臨床宮頸癌的輔助診斷，為患者采取相關的治療措施或者決策提供有效的依據(jù)，臨床應用前景良好。當前第1頁1 2 3