本發(fā)明涉及一種基于回音壁模式微腔陣列的微流控檢測(cè)芯片，屬于微流控檢測(cè)芯片領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

微流控檢測(cè)芯片技術(shù)出現(xiàn)于以功能基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)為核心的后基因組時(shí)代，從20世紀(jì)90年代初、中期發(fā)明至今僅十余年時(shí)間，卻已經(jīng)在生命科學(xué)研究中的諸多領(lǐng)域進(jìn)行應(yīng)用，在臨床上廣泛被應(yīng)用在癌癥的檢測(cè)、病原性疾病和免疫性疾病的診斷等方面。但是現(xiàn)在大多數(shù)微流控檢測(cè)芯片檢測(cè)載體需使用雙抗夾心法進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)過(guò)程需要進(jìn)行兩步反應(yīng)，三步洗滌，操作復(fù)雜、耗時(shí)且成本高。

解決上述問(wèn)題的解決方案是以非標(biāo)記的檢測(cè)載體代替現(xiàn)有的利用雙抗夾心法的檢測(cè)載體。利用具有回音壁模式微腔的熒光微球作為固相載體進(jìn)行生物分子檢測(cè)就是一種能夠?qū)崿F(xiàn)非標(biāo)記檢測(cè)的有效方法。其原理是微球中的熒光染料受泵浦之后，在回音壁微腔中形成受激輻射，其輻射模式對(duì)微球表面的折射率變化響應(yīng)靈敏，因此微球表面抗原抗體的結(jié)合會(huì)導(dǎo)致其輻射模式的改變，改變的大小則可以反應(yīng)待測(cè)物濃度的高低。為了能夠同時(shí)檢測(cè)多個(gè)組分，實(shí)現(xiàn)多元非標(biāo)記檢測(cè)，微球可以用其所含有的熒光染料作為編碼，不同的熒光染料產(chǎn)生不同的受激輻射模式，可以對(duì)不同的待測(cè)物做出響應(yīng)。本發(fā)明旨在提供一種利用回音壁模式微腔陣列的微流控芯片，實(shí)現(xiàn)非標(biāo)記多元生物分子檢測(cè)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

技術(shù)問(wèn)題：本發(fā)明目的是提供一種基于回音壁模式微腔的微流控芯片，通過(guò)將熒光染料編碼的微球排列于微孔板中，待測(cè)樣品溶液以流過(guò)式穿過(guò)微球，充分與微球接觸，待測(cè)物與微球表面的生物探針分子反應(yīng)之后引起回音壁微腔中熒光染料受激輻射模式的改變，從而實(shí)現(xiàn)多元非標(biāo)記生物分子檢測(cè)，該芯片制備簡(jiǎn)單，可以用于核酸和蛋白質(zhì)等的高通量檢測(cè)，操作簡(jiǎn)單，靈敏度高，成本低。

技術(shù)方案：本發(fā)明提供了一種基于回音壁模式微腔陣列的微流控檢測(cè)芯片，該芯片由蓋片、微孔板和基片自上而下組裝而成，所述蓋片依次由進(jìn)液口、進(jìn)液口通道和上反應(yīng)腔組成，且上反應(yīng)腔的下部具有下開口，所述的基片依次由出液口、出液口通道和下反應(yīng)腔組成，且下反應(yīng)腔的上部具有上開口，其中下開口和上開口對(duì)齊放置構(gòu)成反應(yīng)池，微孔板平放于下開口和上開口之間，進(jìn)液口管線貫穿進(jìn)液口，出液口管線貫穿出液口，所述微孔板的中部排列有微球陣列。

其中：

所述蓋片和基片的材料為聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚對(duì)苯二甲酸乙二酯、環(huán)烯烴共聚物、環(huán)烯烴聚合物或玻璃。

所述的微球陣列由具有回音壁模式的微球組成，所述微球的內(nèi)部含有熒光染料，且表面固定有生物分子探針，利用所述微球的粒徑大小、內(nèi)部含有的熒光染料和表面固定的生物分子探針對(duì)該微球進(jìn)行編碼，通過(guò)微球的粒徑大小的差異、內(nèi)部含有的熒光染料的差異和表面固定的生物分子探針的差異實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)分子的多元非標(biāo)記檢測(cè)。

所述的熒光染料在微球內(nèi)部受激發(fā)光，由于微球的回音壁模式，激發(fā)強(qiáng)度達(dá)到一定閾值之后，熒光染料產(chǎn)生受激輻射；不同熒光染料的受激輻射模式不同，用于編碼不同的微球，不同編碼的微球表面固定不同的生物分子探針，檢測(cè)不同的靶標(biāo)分子。

所述的熒光染料在微球內(nèi)的受激輻射模式響應(yīng)微球表面折射率的變化，固定在微球表面的生物分子探針捕獲靶標(biāo)分子引起微球表面折射率的改變，從而使熒光染料受激輻射模式產(chǎn)生變化，通過(guò)生物分子探針與靶標(biāo)分子結(jié)合前后熒光染料受激輻射模式的變化實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)分子的非標(biāo)記檢測(cè)。

所述的不同熒光染料受激輻射模式的變化響應(yīng)生物分子探針與靶標(biāo)分子相互作用的變化區(qū)間位于不同的光譜區(qū)間，并且不重合，在不同熒光染料編碼微球表面分別檢測(cè)不同的靶標(biāo)分子，從而實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)分子的非標(biāo)記多元檢測(cè)。

所述微球的直徑為1～500μm，微球的材料是微球的材料是聚苯乙烯、聚丁二烯、聚異戊二烯、聚苯乙烯、苯乙烯-丙烯酸、苯乙烯-甲基丙烯酸、苯乙烯-丁二烯-苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚氧化乙烯、殼聚糖、聚丙烯酰胺、聚乳酸、聚丙交酯、聚(乳酸-羥基乙酸)、聚己內(nèi)酯、聚芳醚酮、聚苯硫醚、聚醚醚酮、聚苯胺、聚噻吩、聚丙烯腈、聚苯并咪唑、聚酰亞胺、尼龍、聚4-乙烯吡啶、聚氨酯、聚乙烯、聚醋酸乙烯酯、海藻酸鈉、聚乙烯咔唑、聚(乙烯-醋酸乙烯酯)、聚(乙烯-乙烯醇)、聚丙烯、聚氯乙烯、聚四氟乙烯、聚硅氧烷、聚甲醛、聚乙醛、聚碳酸酯、聚羥基丁二酸戊酸酯、聚對(duì)苯二甲酸苯二胺、聚對(duì)苯二甲酸苯二酯、纖維素或聚醚酰亞胺。

所述的熒光染料是異硫氰酸熒光素、尼羅紅、Alexa Fluor系列染料、水溶性3H-吲哚菁型生物熒光標(biāo)示染料、藻紅蛋白、卟啉、熒光增白劑、吖啶、菲啶類染料、嗪類染料、羅丹明類染料、二氟垸硼類染料、萘酰亞胺類染料、芴類熒光染料或酞菁類染料。

所述的熒光染料需要泵浦源激發(fā)，其中泵浦源是指激光器、汞燈光源或者弧光光源。

所述的生物分子探針是具有識(shí)別功能的分子。

所述的具有識(shí)別功能的分子是核酸、蛋白質(zhì)、多肽。

所述微孔板為是玻璃微孔板、金屬微孔板或硅微孔板，其上的微孔為正方形，微孔的邊長(zhǎng)為0.6～300μm，微球被捕獲在方形微孔中。

該檢測(cè)芯片利用具有分液閥門的進(jìn)樣泵將溶液通過(guò)進(jìn)液口管線注入進(jìn)液口通道，其中進(jìn)樣泵是蠕動(dòng)泵或者注射泵。

有益效果：本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1、芯片制備簡(jiǎn)單：只要將基片、蓋片、微孔板、微球、進(jìn)液口管線、出液口管線、進(jìn)樣泵等進(jìn)行組裝即可完成，大大降低了芯片的成本。

2、樣品需要量少，檢測(cè)速度快，靈敏度高：由于檢測(cè)反應(yīng)只在芯片內(nèi)進(jìn)行，反應(yīng)液來(lái)回流動(dòng)，可以減少溶液的揮發(fā)和目的靶分子到達(dá)探針的時(shí)間，提高反應(yīng)的速度，縮短檢測(cè)時(shí)間；同時(shí)，檢測(cè)反應(yīng)以微球?yàn)檩d體，比表面積大，檢測(cè)靈敏度高。

3、降低成本，簡(jiǎn)化操作步驟：通過(guò)使用固定有生物分子探針的具有回音壁模式微腔的熒光編碼微球作為檢測(cè)的固相載體，可以在與樣品溶液一次反應(yīng)并洗滌后進(jìn)行檢測(cè)，而不需要進(jìn)行多次抗原抗體的反應(yīng)以及多次的洗滌，從而既節(jié)約了成本，又簡(jiǎn)化了操作步驟。

4、檢測(cè)方便：由于具有回音壁模式的熒光編碼微球被封裝在反應(yīng)池中且彼此之間有一定的距離，不用對(duì)單個(gè)微球進(jìn)行單獨(dú)操作，可以對(duì)微球逐個(gè)檢測(cè)，簡(jiǎn)化了操作難度；

5、檢測(cè)通量高：采用具有回音壁模式微腔的熒光編碼微球作為檢測(cè)反應(yīng)的固相載體，因此可以進(jìn)行多元生物分子檢測(cè)，同時(shí)檢測(cè)同一個(gè)樣品中的多個(gè)指標(biāo)；在芯片中放入n種標(biāo)記不同探針的熒光編碼微球就可以檢測(cè)n種分子，檢測(cè)通量高。

6、可擴(kuò)展性高：由于采用了微流控芯片的形式，可以方便的同樣品預(yù)處理等微流控芯片集成，促進(jìn)了分析系統(tǒng)的微型化和自動(dòng)化。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明基于回音壁模式微腔的微流控芯片的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2為單個(gè)微球的回音壁模式光路圖；

其中有蓋片1、進(jìn)液口1-1、進(jìn)液口管線1-2、進(jìn)液口通道1-3、上反應(yīng)腔1-4、下開口1-5、基片2、出液口2-1、出液口管線2-2、出液口通道2-3、下反應(yīng)腔2-4、上開口2-5、微孔板3、微球4、進(jìn)樣泵5、溶液6。

具體實(shí)施方案

本發(fā)明提供了一種回音壁模式微腔的微流控芯片，芯片中設(shè)有具有回音壁模式的微球4作為生物分子檢測(cè)的固相載體，微球4被放置在微孔板3的微孔中。芯片通過(guò)裝備有分液閥的進(jìn)樣泵5輸入溶液6：待測(cè)樣品、反應(yīng)液以及洗滌液。

實(shí)施例1：

微流控芯片的制備：

1、蓋片1和基片2的制備：使用2cm×3cm×3mm(長(zhǎng)×寬×高)的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)，通過(guò)激光微加工在PMMA片中切削出所需結(jié)構(gòu)：其中進(jìn)液口通道1-3(或出液口通道2-3)長(zhǎng)度為5mm，直徑為1.5mm，上反應(yīng)腔1-4(或下反應(yīng)腔2-4)的直徑為2.5mm，高度為1.5mm，下開口1-5(或上開口2-5)直徑為2.5mm。

2、微孔板3為圓形方孔鎳網(wǎng)，其直徑為3mm，孔徑50μm，具有回音壁模式的微球卡在微孔板的方孔中。

3、芯片的組裝：在基片2的上開口2-5所在的面上涂一層PDMS(下反應(yīng)腔2-4內(nèi)部不涂)，放入75℃烘箱預(yù)固化10min，之后將微孔板3蓋在上開口2-5處，再將蓋片1中的下開口1-5與基片1中上開口2-5相對(duì)齊粘合，壓緊后放入75℃烘箱固化2h。

4、將進(jìn)液口1-1和出液口2-1分別用膠水做密封，將材質(zhì)為硅膠的、外徑為1mm、長(zhǎng)度為10mm的進(jìn)液口管線1-2和出液口管線2-2分別貫穿進(jìn)液口1-1的密封處和出液口2-1的密封處。

實(shí)施例2：

用基于回音壁模式微腔陣列的微流控芯片檢測(cè)血液中腫瘤標(biāo)志物甲胎蛋白(AFP)、癌胚還原(CEA)、糖原125(CA125)：

1、微流控芯片的制備同實(shí)施例1，其中微孔板3為圓形方孔硅網(wǎng)，直徑3mm，微孔邊長(zhǎng)為0.6μm。

2、將固定有甲胎蛋白(AFP)、癌胚還原(CEA)、糖原125(CA125)抗體的三種熒光編碼的微球4各五個(gè)通過(guò)進(jìn)液口管線1-2通入反應(yīng)池5，將微球4固定到微孔陣列中，微球4的直徑為1μm，；采集每個(gè)微球4的熒光染料受激輻射模式光譜；

3、然后，將進(jìn)液口硅膠管線與裝備有分液閥門的往返式蠕動(dòng)泵相連，通過(guò)蠕動(dòng)泵輸入待檢測(cè)血清，使待檢測(cè)血清與15個(gè)微球4充分接觸，設(shè)置蠕動(dòng)泵為往返運(yùn)動(dòng)模式，使血清在芯片中來(lái)回流動(dòng)，充分與微球4混合反應(yīng)，保持反應(yīng)體系溫度為37℃；

4、反應(yīng)完畢，通過(guò)蠕動(dòng)泵將待測(cè)血清泵出，同時(shí)不斷泵入洗滌緩沖液對(duì)微球4進(jìn)行洗滌，洗滌充分后，采集每個(gè)微球4的熒光染料受激輻射模式光譜，并與反應(yīng)前的模式光譜對(duì)應(yīng)，得出分析結(jié)果。

實(shí)施例3：

用基于回音壁模式微腔陣列的微流控芯片檢測(cè)血液中腫瘤標(biāo)志物甲胎蛋白(AFP)、癌胚還原(CEA)、糖原125(CA125)：

1、微流控芯片的制備同實(shí)施例1，其中微孔板3為圓形方孔硅網(wǎng)，直徑3mm，微孔邊長(zhǎng)18μm。

2、將固定有甲胎蛋白(AFP)、癌胚還原(CEA)、糖原125(CA125)抗體的三種熒光編碼的微球4各五個(gè)通過(guò)進(jìn)液口管線1-2通入反應(yīng)池5，將微球3固定到微孔陣列中，微球3的直徑為20μm，；采集每個(gè)微球3的熒光染料受激輻射模式光譜；

3、然后，將進(jìn)液口硅膠管線與裝備有分液閥門的往返式蠕動(dòng)泵相連，通過(guò)蠕動(dòng)泵輸入待檢測(cè)血清，使待檢測(cè)血清與15個(gè)微球4充分接觸，設(shè)置蠕動(dòng)泵為往返運(yùn)動(dòng)模式，使血清在芯片中來(lái)回流動(dòng)，充分與微球4混合反應(yīng)，保持反應(yīng)體系溫度為37℃；

4、反應(yīng)完畢，通過(guò)蠕動(dòng)泵將待測(cè)血清泵出，同時(shí)不斷泵入洗滌緩沖液對(duì)微球4進(jìn)行洗滌，洗滌充分后，采集每個(gè)微球4的熒光染料受激輻射模式光譜，并與反應(yīng)前的模式光譜對(duì)應(yīng)，得出分析結(jié)果。

實(shí)施例4：

用基于回音壁模式微腔陣列的微流控芯片檢測(cè)血液中腫瘤標(biāo)志物糖原242(CA242)、糖原199(CA19-9)、前列腺特異抗原(PSA)。

1、微流控芯片的制備同實(shí)施例1，其中微孔板為圓形方孔硅網(wǎng)，直徑3mm，微孔邊長(zhǎng)85μm。

2、將固定有糖原242(CA242)、糖原199(CA19-9)、前列腺特異抗原(PSA)抗體的三種熒光編碼微球各5個(gè)通過(guò)進(jìn)液口管線通入反應(yīng)池，將微球固定到微孔陣列中。微球的直徑為100μm；采集每個(gè)微球的熒光染料受激輻射模式光譜。

3、然后，將進(jìn)液口管線與裝備有分液閥門的往返式蠕動(dòng)泵相連，通過(guò)蠕動(dòng)泵輸入待檢測(cè)血清，使待檢測(cè)血清與15個(gè)熒光微球充分接觸，設(shè)置蠕動(dòng)泵為往返運(yùn)動(dòng)模式，使血清在毛細(xì)管中來(lái)回流動(dòng)，充分與熒光微球混合反應(yīng)，保持反應(yīng)體系溫度為37℃；

4、反應(yīng)完畢，通過(guò)蠕動(dòng)泵將待測(cè)血清泵出，同時(shí)不斷泵入洗滌緩沖液對(duì)熒光微球進(jìn)行洗滌，洗滌充分后，采集每個(gè)微球的熒光染料受激輻射模式光譜，并與反應(yīng)前的模式光譜對(duì)應(yīng)，得出分析結(jié)果。

實(shí)施例5：

用基于回音壁模式微腔陣列的微流控芯片檢測(cè)血液中腫瘤標(biāo)志物糖原242(CA242)、糖原199(CA19-9)、前列腺特異抗原(PSA)。

1、微流控芯片的制備同實(shí)施例1，其中微孔板為圓形方孔硅網(wǎng)，直徑3mm，微孔邊長(zhǎng)170μm。

2、將固定有糖原242(CA242)、糖原199(CA19-9)、前列腺特異抗原(PSA)抗體的三種熒光編碼微球各5個(gè)通過(guò)進(jìn)液口管線通入反應(yīng)池，將微球固定到微孔陣列中。微球的直徑為200μm；采集每個(gè)微球的熒光染料受激輻射模式光譜。

3、然后，將進(jìn)液口管線與裝備有分液閥門的往返式蠕動(dòng)泵相連，通過(guò)蠕動(dòng)泵輸入待檢測(cè)血清，使待檢測(cè)血清與15個(gè)熒光微球充分接觸，設(shè)置蠕動(dòng)泵為往返運(yùn)動(dòng)模式，使血清在毛細(xì)管中來(lái)回流動(dòng)，充分與熒光微球混合反應(yīng)，保持反應(yīng)體系溫度為37℃；

4、反應(yīng)完畢，通過(guò)蠕動(dòng)泵將待測(cè)血清泵出，同時(shí)不斷泵入洗滌緩沖液對(duì)熒光微球進(jìn)行洗滌，洗滌充分后，采集每個(gè)微球的熒光染料受激輻射模式光譜，并與反應(yīng)前的模式光譜對(duì)應(yīng)，得出分析結(jié)果。

實(shí)施例6：

用基于回音壁模式微腔陣列的微流控芯片檢測(cè)血液中腫瘤標(biāo)志物甲胎蛋白(AFP)、癌胚還原(CEA)、糖原125(CA125)：

1、微流控芯片的制備同實(shí)施例一，其中微孔板為圓形方孔硅網(wǎng)，直徑3mm，微孔邊長(zhǎng)280μm。

2、，將固定有糖原242(CA242)、糖原199(CA19-9)、前列腺特異抗原(PSA)抗體的三種微球各5個(gè)通過(guò)進(jìn)液口管線通入反應(yīng)池，將微球固定到微孔陣列中；，微球的直徑為300μm，采集每個(gè)微球的熒光染料受激輻射模式光譜；3、然后，將進(jìn)液口管線與裝備有分液閥門的往返式蠕動(dòng)泵相連，通過(guò)蠕動(dòng)泵輸入待檢測(cè)血清，使待檢測(cè)血清與15個(gè)熒光微球充分接觸，設(shè)置蠕動(dòng)泵為往返運(yùn)動(dòng)模式，使血清在毛細(xì)管中來(lái)回流動(dòng)，充分與熒光微球混合反應(yīng)，保持反應(yīng)體系溫度為37℃；

4、反應(yīng)完畢，通過(guò)蠕動(dòng)泵將待測(cè)血清泵出，同時(shí)不斷泵入洗滌緩沖液對(duì)熒光微球進(jìn)行洗滌，洗滌充分后，采集每個(gè)微球的熒光染料受激輻射模式光譜，并與反應(yīng)前的模式光譜對(duì)應(yīng)，得出分析結(jié)果。

用基于回音壁模式微腔陣列的微流控芯片檢測(cè)血液中腫瘤標(biāo)志物甲胎蛋白(AFP)、癌胚還原(CEA)、糖原125(CA125)：

實(shí)施例7：

1、微流控芯片的制備同實(shí)施例一，其中微孔板為圓形方孔硅網(wǎng)，直徑3mm，微孔邊長(zhǎng)300μm。

2、，將固定有糖原242(CA242)、糖原199(CA19-9)、前列腺特異抗原(PSA)抗體的三種微球各5個(gè)通過(guò)進(jìn)液口管線通入反應(yīng)池，將微球固定到微孔陣列中；，微球的直徑為500μm，采集每個(gè)微球的熒光染料受激輻射模式光譜；3、然后，將進(jìn)液口管線與裝備有分液閥門的往返式蠕動(dòng)泵相連，通過(guò)蠕動(dòng)泵輸入待檢測(cè)血清，使待檢測(cè)血清與15個(gè)熒光微球充分接觸，設(shè)置蠕動(dòng)泵為往返運(yùn)動(dòng)模式，使血清在毛細(xì)管中來(lái)回流動(dòng)，充分與熒光微球混合反應(yīng)，保持反應(yīng)體系溫度為37℃；

4、反應(yīng)完畢，通過(guò)蠕動(dòng)泵將待測(cè)血清泵出，同時(shí)不斷泵入洗滌緩沖液對(duì)熒光微球進(jìn)行洗滌，洗滌充分后，采集每個(gè)微球的熒光染料受激輻射模式光譜，并與反應(yīng)前的模式光譜對(duì)應(yīng)，得出分析結(jié)果。