本發(fā)明涉及一種肝素的定量檢測(cè)方法，特別涉及一種基于特異性多肽修飾的對(duì)肝素的電化學(xué)檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

肝素是一種天然存在的含高電荷密度的聚陰離子的生物大分子，是糖胺聚糖(GAG)家族中最結(jié)構(gòu)復(fù)雜的成員。肝素通過(guò)與凝血酶抑制劑如抗凝血酶III(ATIII)的相互作用而在血液凝固級(jí)聯(lián)中起靜脈內(nèi)抗凝劑作用。因此，肝素被認(rèn)為是臨床中廣泛使用的預(yù)防和治療劑，特別是作為醫(yī)學(xué)上用于手術(shù)的抗凝血?jiǎng)?。傳統(tǒng)的血液中的肝素濃度檢測(cè)方法(例如aPTT技術(shù)、抗Xa測(cè)定法或血栓粘度計(jì)(TEG))存在一些難題，如成本昂貴，靈敏度低，有些不能提供精確定量的信息等。

近年來(lái)，電化學(xué)技術(shù)發(fā)展迅速，具有許多優(yōu)點(diǎn)，如高靈敏度、快速響應(yīng)和使用價(jià)格低廉的儀器和試劑。而與此同時(shí)，多肽由于其對(duì)特異性分析物具有強(qiáng)的結(jié)合力、高生物相容性和在水溶液中的高溶解度而被廣泛用于生物傳感器。因此本發(fā)明開(kāi)發(fā)出了一種選擇性高、敏感性高的檢測(cè)肝素的新方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問(wèn)題，本案提供一種肝素的定量檢測(cè)方法，采用電化學(xué)的方法，在金電極上修飾多肽后，浸入待測(cè)試樣品中，樣本中的肝素會(huì)與之結(jié)合，并且發(fā)生電化學(xué)阻抗譜(EIS)的響應(yīng)，可通過(guò)電化學(xué)工作站讀出交流阻抗信息，經(jīng)分析，其與肝素濃度在一定的濃度范圍內(nèi)存在線性關(guān)系，檢測(cè)限為0.01μg/mL，遠(yuǎn)低于臨床需要的肝素水平。此外，特異性多肽的結(jié)合顯示出很高的親和力，并且不受其他生物分子的干擾。所提出的方法也適用于人類全血中的肝素測(cè)量。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本案通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種肝素的定量檢測(cè)方法，其包括：

1)以金電極作為工作電極，對(duì)金電極進(jìn)行預(yù)處理；

2)將多肽修飾于所述金電極表面；

3)將巰基己醇修飾于所述金電極表面，用于對(duì)未修飾上多肽的金電極表面進(jìn)行占位；

4)將所述金電極插入待測(cè)液中進(jìn)行反應(yīng)，并采集相應(yīng)電化學(xué)阻抗譜，計(jì)算阻抗值；

5)根據(jù)阻抗值與肝素濃度的對(duì)應(yīng)關(guān)系，獲得待測(cè)液中肝素的濃度；

其中，所述多肽序列為CGSGRKRLQVQLSIRT。

優(yōu)選的是，所述的肝素的定量檢測(cè)方法，其中，對(duì)金電極進(jìn)行預(yù)處理包括：

將金電極在修飾前浸泡于水虎魚(yú)洗液中，以除去電極表面吸附的雜質(zhì)；其中，以體積比為計(jì)，所述水虎魚(yú)洗液的組成為98％H₂SO₄∶30％H₂O₂＝3∶1。

優(yōu)選的是，所述的肝素的定量檢測(cè)方法，其中，對(duì)金電極進(jìn)行預(yù)處理還包括：將金電極用碳化硅砂紙打磨至呈鏡面光滑，隨后將金電極分別在乙醇和蒸餾水中超聲清洗。

優(yōu)選的是，所述的肝素的定量檢測(cè)方法，其中，對(duì)金電極進(jìn)行預(yù)處理還包括：將金電極用0.5M H₂SO₄溶液清洗，隨后用氮?dú)飧稍镆源罄m(xù)的修飾。

優(yōu)選的是，所述的肝素的定量檢測(cè)方法，其中，將多肽修飾于所述金電極表面具體包括：將經(jīng)預(yù)處理的金電極與100μM多肽溶液在常溫下反應(yīng)16小時(shí)；其中，所述多肽溶液中包括有20mM的4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)和10mM的三(2-羧乙基)膦(TCEP)。

優(yōu)選的是，所述的肝素的定量檢測(cè)方法，其中，將巰基己醇修飾于所述金電極表面具體包括：將已修飾有多肽的金電極在1mM巰基己醇(MCH)溶液中浸泡30分鐘，隨后用雙蒸水徹底沖洗并在氮?dú)饬髦懈稍锎谩?/p>

優(yōu)選的是，所述的肝素的定量檢測(cè)方法，其中，所述交流阻抗電化學(xué)法采用三電極系統(tǒng)，其中，工作電極為金電極，對(duì)電極為鉑電極，參比電極為飽和甘汞電極；交流阻抗所用緩沖液為含有KCl、[Fe(CN)₆]^3-和[Fe(CN)₆]^4-的水溶液。

優(yōu)選的是，所述的肝素的定量檢測(cè)方法，其中，所述KCl的濃度為1M。

優(yōu)選的是，所述的肝素的定量檢測(cè)方法，其中，所述[Fe(CN)₆]^3-和[Fe(CN)₆]^4-的濃度之和為5mM。

本發(fā)明的有益效果是：本案提出的對(duì)肝素的檢測(cè)方法具有靈敏度高、快速、成本低的特點(diǎn)，檢測(cè)限為0.01μg/mL，通過(guò)設(shè)計(jì)的特異性多肽與電化學(xué)技術(shù)的結(jié)合，可以實(shí)現(xiàn)肝素生物傳感的應(yīng)用。

附圖說(shuō)明

圖1為本案肝素的電化學(xué)檢測(cè)示意圖。

圖2為金電極不同修飾階段的交流阻抗圖：(a)裸金電極；(b)多肽修飾后；(c)在與肝素相互作用后；(d)在肝素酶處理后。

圖3為血樣的TEG測(cè)試結(jié)果：(a)普通杯，(b)肝素酶杯。

圖4為結(jié)合肝素后的多肽修飾電極的Nyquist圖，(a-f)：0.05、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0μg/mL。

圖5為肝素濃度相對(duì)應(yīng)的阻抗值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，圖中誤差條表示三次獨(dú)立測(cè)量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

圖6為肝素檢測(cè)量(10.0μg/mL)相對(duì)于其他過(guò)量的干擾生物分子(包括葡萄糖、ADP、DNA、BSA)的選擇性對(duì)比圖：(a)為電化學(xué)阻抗譜圖，(b)為電阻值的直方圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說(shuō)明書(shū)文字能夠據(jù)以實(shí)施。

本案列出一實(shí)施例的肝素的定量檢測(cè)方法，具體可包括：

1)實(shí)驗(yàn)中使用金電極作為工作電極。電極在修飾前需在新配置的水虎魚(yú)洗液(98％H₂SO₄：30％H₂O₂＝3:1)中浸泡5分鐘，除去電極表面吸附的雜質(zhì)。

2)用蒸餾水洗干凈后，將電極用碳化硅砂紙(3000目)打磨到鏡面光滑。然后，將電極分別在乙醇和蒸餾水中超聲清洗各5分鐘。接著，在使用前先在氮?dú)夥諆?nèi)干燥。

3)處理過(guò)的電極用0.5M H₂SO₄溶液進(jìn)行電化學(xué)清洗。然后，將電極用氮?dú)飧稍镆赃M(jìn)一步修飾。

4)將經(jīng)預(yù)處理的電極與100μM多肽溶液(20mM HEPES和10mM TCEP，pH 7.0)在室溫下反應(yīng)16小時(shí)。多肽序列為CGSGRKRLQVQLSIRT。將修飾的電極進(jìn)一步在1mM MCH中浸泡30分鐘，用于對(duì)未修飾上多肽的金電極表面進(jìn)行占位，從而可以防止電極界面上的物理吸附。然后，用雙蒸水徹底沖洗并在氮?dú)饬髦懈稍镉糜谝韵聦?shí)驗(yàn)。

5)將多肽修飾的電極在室溫下浸入100μL具有不同濃度的肝素中。多肽可以將肝素定位在電極表面上。反應(yīng)3小時(shí)后，用雙蒸水小心沖洗電極，除去非特異性吸附的肝素。

6)所有電化學(xué)實(shí)驗(yàn)均使用計(jì)算機(jī)控制的CHI 660D電化學(xué)工作站(CH Instruments，中國(guó))進(jìn)行。使用三電極系統(tǒng)，其中工作電極是與鉑對(duì)電極和飽和甘汞參比電極結(jié)合的金電極(直徑2mm)。EIS的緩沖液為含有1M KCl的5mM[Fe(CN)₆]^3-/4-溶液(5mM[Fe(CN)₆]^3-/4-表示[Fe(CN)₆]^3-和[Fe(CN)₆]^4-的濃度之和為5mM)。

此外，本案還使用了血栓彈力圖儀測(cè)試分析肝素來(lái)作為對(duì)照方法：收集靜脈血樣品并預(yù)先注射到檸檬酸鈉抗凝劑管中。將1mL血液樣品加入到標(biāo)準(zhǔn)高嶺土試劑中，充分混合，并靜置4分鐘用于活化。然后，儀器的兩個(gè)通道裝載普通杯(測(cè)試類型為CK-檸檬酸化高嶺土)和肝素酶杯(測(cè)試類型為具有肝素酶的CKH-檸檬酸化高嶺土)。接著，加入20μL CaCl₂試劑和340μL活化血液樣品，然后開(kāi)始彈力測(cè)量，測(cè)量時(shí)間約30分鐘。測(cè)試結(jié)果參見(jiàn)圖3。

圖2中的EIS用于表征多步表面修飾階段電極的電化學(xué)性質(zhì)，包括在電極上修飾多肽，肝素的組裝和進(jìn)一步的肝素酶處理。隨著電化學(xué)頻率的增加，典型的阻抗譜通常包含與擴(kuò)散狀態(tài)和電子轉(zhuǎn)移過(guò)程相對(duì)應(yīng)的線性部分和半圓部分。半圓部分越大，阻抗越大。如圖2所示，在裸電極(曲線a)上沒(méi)有觀察到阻抗譜的明顯半圓區(qū)域，由于空間位阻和正電荷的平衡，在多肽修飾的電極(曲線b)上出現(xiàn)一個(gè)微小半圓區(qū)域。具有明顯擴(kuò)大的半圓形區(qū)域的曲線c表示多肽修飾的電極可以特異性吸附肝素，這證明結(jié)合的肝素在電極的界面上有效地阻礙電荷轉(zhuǎn)移。在肝素通過(guò)肝素酶降解后觀察到阻抗譜的大幅減少(曲線d)。

圖3通過(guò)TEG的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證在肝素酶的作用下，樣本中的肝素會(huì)發(fā)生降解，從而抵消肝素對(duì)血液凝固的影響。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果可用于驗(yàn)證圖2中肝素酶降解肝素從而使阻抗值恢復(fù)為原有水平這一現(xiàn)象。

圖4表明通過(guò)多肽修飾電極的肝素結(jié)合反應(yīng)，可以通過(guò)電化學(xué)阻抗值讀數(shù)來(lái)評(píng)估不同的肝素水平。圖4顯示了不同濃度肝素的典型的nyquist圖。阻抗值隨著肝素濃度的增加而增加。

圖5表明阻抗值在0.05至10.0μg/mL的范圍內(nèi)顯示與肝素濃度的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系。回歸方程為y＝256.2x+1298.13(R²＝0.995，重復(fù)次數(shù)n＝3)，其中y是阻抗值，x是肝素濃度的對(duì)數(shù)。檢測(cè)限為0.01μg/mL，不僅優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)中的方法，而且遠(yuǎn)低于手術(shù)后和長(zhǎng)期治療的肝素治療劑量的最大水平。

圖6通過(guò)使用一些過(guò)量的干擾生物分子(包括葡萄糖，ADP，DNA和BSA)來(lái)驗(yàn)證所提出的多肽方法的特異性。在肝素測(cè)定和對(duì)照實(shí)驗(yàn)之間存在顯著的電化學(xué)信號(hào)差異。因此，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明多肽-肝素的結(jié)合是有效和可靠的，而所有對(duì)照分子的阻抗可以忽略不計(jì)，證實(shí)了所提出方法的高選擇性。(ADP：二磷酸腺苷。BSA：牛血清白蛋白。)

盡管本發(fā)明的實(shí)施方案已公開(kāi)如上，但其并不僅僅限于說(shuō)明書(shū)和實(shí)施方式中所列運(yùn)用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域，對(duì)于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地實(shí)現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細(xì)節(jié)和這里示出與描述的圖例。

多肽序列為：CGSGRKRLQVQLSIRT