本發(fā)明涉及肝素提取領域，具體而言，涉及一種提高肝素鈉提取得率的方法。
背景技術：
：肝素是一種由動物解讀組織的肥大細胞所產生的酸性粘多糖額硫酸酯類物質，因其具有強抗凝作用，是放置深層靜脈血栓形成等血酸栓塞性疾病的首選藥物，隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)肝素不僅有抗凝、抗血栓形成和調整血脂的作用，還有抗炎、抗過敏、抗病毒、抗癌等多種生物學功能。雖然將肝素類產品用于臨床已有60余年的歷史，但迄今還沒有一種能夠完全替代它的產品，所以它仍然是最重要的抗凝血和抗血栓的生化藥物，且目前只能從動物的部分組織中提取，仍然不能人工合成。我國是生豬飼養(yǎng)、屠宰和消費大國，更是腸衣加工大國。腸粘膜是提取肝素的最佳原料之一，我國也有大量致力于從腸黏膜中提取肝素產品的廠家。然而，我國現(xiàn)行的肝素提取和純化工藝比較落后，產品雜質含量較高。為了滿足醫(yī)學臨床及生化研究，每年要從國外大量進口精品肝素及低分子肝素。最早的肝素提取方法介紹見于howell在美國生理雜志上發(fā)表的文章，肝素提取需要去除雜質后再精制，因此在處理原料時要通過酶水解、鹽析等方法去除蛋白質，得到肝素粗品。粗品肝素中含有其它黏多糖，也含有一些殘余的蛋白質和核酸類物質，從而使粗品肝素的效價過低?，F(xiàn)有的工藝中，對酸堿性雜質是通過等電點沉淀及熱變性作用、鹽析作用等辦法去除；對低抗凝活性的水溶雜質，是通過控制產品溶液濃度特別是酒精沉淀濃度來加以去除；對熱原雜質，通過超濾氧化及離子交換方法加以去除。國內常用的豬小腸肝素提取方法是鹽析法；60、70年代美國專利技術-氧化法純化技術在國外曾經廣泛采用；國內90年代以前基本采用組合氧化法純化技術是肝素的主要純化方法，因此對氧化法純化技術研究的比較多。例如，現(xiàn)有技術(cn102746421a)公開了一種粗品肝素鈉提純的方法，主要時對粗品肝素鈉進行溶解、吸附、洗脫、沉淀和干燥處理，最終得到肝素鈉產品。同時，現(xiàn)有技術(cn103588902a)公開了一種采用吸附、醇沉以及兩步氧化法對粗品肝素鈉進行提純的方法。同樣的，現(xiàn)有技術(cn10299336a)公開了一種采用加入硅藻土、聚合氯化鋁后經離心除雜，再經醇沉、雙氧水氧化、醇沉以及過濾、冷凍干燥后得到肝素鈉產品。然而，這些傳統(tǒng)方法工藝較為復雜，產品的生產周期長，并且在提純過程中需要加入化學試劑，處理成本較高，精制的過程也較為復雜，產品純度也難以保證。近幾年，隨著生物技術的進展，以及新型高分子材料的不斷出現(xiàn)，又有新成果出現(xiàn)。酶解輔助提取肝素，離子交換層析分離肝素技術是現(xiàn)在企業(yè)主要使用的技術。加入蛋白水解酶，可以減少水解時間和減少微生物的污染。但酶解技術受限于溫度、ph的控制，提取肝素后還要滅酶、并將其除去，同時采用離子交換法從酶解液中吸附肝素時，由于吸附不完全，所以會導致殘留液中仍含有較高量的肝素，從而影響肝素得率。進一步的，由于吸附洗脫等條件未得到有效的調整和優(yōu)化，也進一步影響了肝素的有效分離和獲得，影響了肝素的得率。雖然肝素提取純化技術的研究已有眾多報道，專家們在各種提取、分離純化肝素的技術研究方面也做了大量工作，但綜合而言，提取技術水平較高的仍然是發(fā)達國家，他們不僅開創(chuàng)和掌握了扎實的提取技術，并具有專用的高分子材料和裝備。國內目前這方面欠缺的是先進的工藝和配套的裝備。為此，進一步深入探索粗肝素的酶解、提取和分離純化技術，選擇適合我國中小企業(yè)的粗品肝素生產模式及研究適合的技術裝備，將具有重要的實用價值。有鑒于此，特提出本發(fā)明。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一目的在于提供一種提高肝素鈉提取得率的方法，本發(fā)明方法中，通過采用復合酶對原料進行酶解處理，并對吸附后解離條件的調整和優(yōu)化，從而不僅提高了肝素鈉的提取效率，同時也提高了肝素鈉粗品的得率。本發(fā)明的第二目的在于提供一種肝素鈉的制備方法。為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術方案：一種提高肝素鈉提取得率的方法，所述方法包括如下步驟：將新鮮豬小腸處理后以復合酶進行酶解，所得酶解液濃縮過濾后加入樹脂進行吸附；吸附后的樹脂以濃度為0.3～0.6mol/l的鹽溶液進行洗脫，洗脫液醇沉后，將所得固形物干燥，得到肝素鈉粗品；優(yōu)選的，鹽溶液的濃度為0.4～0.5mol/l?？蛇x的，本發(fā)明中，所述將新鮮豬小腸處理包括如下步驟：將新鮮豬小腸放入刮腸機中，得到豬小腸粘膜，然后將其粉碎，加水攪拌?？蛇x的，本發(fā)明中，所述復合酶包括堿性蛋白酶和胰蛋白酶?？蛇x的，本發(fā)明中，所述復合酶的總量為0.3～0.5g/l?？蛇x的，本發(fā)明中，所述樹脂為大孔樹脂；優(yōu)選的，所述樹脂為d208樹脂?？蛇x的，本發(fā)明中，所述方法還進一步包括在加入樹脂吸附前對體系ph進行調整的步驟；優(yōu)選的，是將體系ph調整至7.5～8.5?？蛇x的，本發(fā)明中，所述吸附的溫度為35～55℃；優(yōu)選的，所述吸附的溫度為40～50℃?？蛇x的，本發(fā)明中，所述吸附的時間為3～6h；優(yōu)選的，所述吸附的時間為4～5h?？蛇x的，本發(fā)明中，所述鹽溶液為氯化鈉或氯化鉀溶液；優(yōu)選的，所述鹽溶液為氯化鈉溶液；更優(yōu)選的，所述氯化鈉溶液的濃度為0.3～0.6mol/l。同時，本發(fā)明還提供了一種肝素鈉的制備方法，所述方法包括如下步驟：首先按照本發(fā)明所述方法提取得到肝素鈉粗品，再由肝素鈉粗品精制得到肝素鈉。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果為：(1)本發(fā)明方法中，以復合酶進行酶解，從而能夠有效提高酶解處理的效率，而這也有利于提高肝素鈉粗品的得率；(2)本發(fā)明方法中，通過對吸附以及洗脫等步驟條件的選擇和調整，從而進一步提高對肝素鈉產品的吸附和洗脫率，從而能夠進一步提高肝素鈉粗品的收率。具體實施方式下面將結合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應視為限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產品。鑒于目前現(xiàn)有技術中對肝素提取所存在的肝素得率低等問題，本發(fā)明特采用一種復合酶酶解提取-提取液濃縮-過濾-樹脂吸附-洗脫-沉淀-干燥的方法進行肝素提取，通過采用復合酶酶解以及對吸附、洗脫步驟的調整，從而有效提高了肝素的酶解處理和分離效率，進而提高了肝素粗品的得率，具體的：本發(fā)明中，將原料新鮮豬小腸放入刮腸機中處理后，得到豬小腸粘膜，然后，將豬小腸粘膜粉碎后加水攪拌，得到待處理的混合體系；然后，對混合體系的溫度以及ph進行調節(jié)，并將體系調整至適于酶解處理的條件；優(yōu)選的，可以將體系的ph調節(jié)至8.5～9，溫度調節(jié)至55～65℃；在調整完成后，向體系內加入復合酶進行酶解；優(yōu)選的，所用到的復合酶為包含堿性蛋白酶和胰蛋白酶的復合酶，更優(yōu)選的，堿性蛋白酶和胰蛋白酶的質量比為(2～4)：(1～2)；進一步優(yōu)選的，在加入復合酶后，要使得體系中酶的總濃度能夠達到0.3～0.5g/l；酶解反應的時間優(yōu)選的控制在2～4h，然后，將所得酶解液濃縮，并在濃縮后過濾，然后向濾液中加入大孔樹脂進行吸附，優(yōu)選的，所述大孔樹脂為d208樹脂；進一步優(yōu)選的，在使用之前需要對大孔樹脂進行預處理，預處理的步驟可參考如下：將原料干樹脂在蒸餾水中充分浸泡，然后在溶脹后濾干，加等體積乙醇攪拌1h,用蒸餾水洗凈濾干,加4倍量的2mol/l的鹽酸溶液攪拌2h,用蒸餾水洗至中性,濾干；加2倍量2mol/l的氫氧化鈉溶液攪拌2h,蒸餾水洗至中性,濾干；最后用2倍量2mol/l的鹽酸溶液攪拌2h,水洗至中性,濾干后備用；加入大孔樹脂進行吸附的步驟可優(yōu)選的參考如下：將濃縮過濾后所得濾液加入吸附罐中，然后加入離子交換水，并調整其鹽濃度為1～6mol/l，同時，優(yōu)選的將體系的ph調節(jié)至7.5～8.5，體系的溫度調節(jié)為35～55℃，體系溫度更優(yōu)選的調整至40～50℃；然后加入樹脂進行離子交換，并吸附肝素鈉；吸附處理的時間優(yōu)選的控制在3～6h，更優(yōu)選的，吸附的時間控制在4～5h；然后，將離子交換后的樹脂以清水清洗后，進行洗脫；洗脫的步驟可以參考如下：將吸附后的樹脂以鹽水洗脫，優(yōu)選的，所用鹽水為氯化鈉或氯化鉀溶液，更優(yōu)選的，所述鹽溶液為氯化鈉溶液；進一步優(yōu)選的，所述氯化鈉溶液的濃度為0.3～0.6mol/l；更進一步優(yōu)選的，所述氯化鈉溶液的濃度為0.4～0.5mol/l；然后將所得洗脫液以酒精沉淀，沉淀的時間控制在10～12h；然后，將體系進行固液分離，將固形物在80～85℃條件下干燥10～15h后，即得到肝素鈉粗品。進一步的，還可以以本發(fā)明肝素鈉粗品為原料，并進一步精制得到高純度的肝素鈉，從而進一步提高產品的價值。實施例1新鮮豬小腸經刮腸機處理得到新鮮粘膜，將粘膜粉碎后加水攪拌；然后，將體系ph調節(jié)至8.5，溫度調整至60℃，然后，按照2:1的比例加入堿性蛋白酶以及胰蛋白酶，并使得體系中兩種酶的濃度達到0.5g/l,并進行酶解，酶解的時間控制在3h；將所得酶解液濃縮后過濾，然后向濾液中加入樹脂,調節(jié)體系ph至8.2，進行吸附，吸附過程中，保持體系的溫度為45℃；在吸附4.5h后，將樹脂過濾得到，并以濃度為0.45mol/l的氯化鈉溶液進行洗脫，然后將洗脫液以酒精沉淀，固液分離后，將固形物干燥得到實施例1的肝素鈉粗品。進一步的，還可以將實施例1的肝素鈉粗品進一步進行純化，并得到高純度的肝素鈉產品。實施例2新鮮豬小腸經刮腸機處理得到新鮮粘膜，將粘膜粉碎后加水攪拌；然后，將體系ph調節(jié)至8.5，溫度調整至60℃，然后，按照2:1的比例加入堿性蛋白酶以及胰蛋白酶，并使得體系中兩種酶的濃度達到0.5g/l,并進行酶解，酶解的時間控制在3h；將所得酶解液濃縮后過濾，然后向濾液中加入樹脂,調節(jié)體系ph至8.2，進行吸附，吸附過程中，保持體系的溫度為35℃；在吸附4.5h后，將樹脂過濾得到，并以濃度為0.45mol/l的氯化鈉溶液進行洗脫，然后將洗脫液以酒精沉淀，固液分離后，將固形物干燥得到實施例2的肝素鈉粗品。實施例3新鮮豬小腸經刮腸機處理得到新鮮粘膜，將粘膜粉碎后加水攪拌；然后，將體系ph調節(jié)至8.5，溫度調整至60℃，然后，按照2:1的比例加入堿性蛋白酶以及胰蛋白酶，并使得體系中兩種酶的濃度達到0.5g/l,并進行酶解，酶解的時間控制在3h；將所得酶解液濃縮后過濾，然后向濾液中加入樹脂,調節(jié)體系ph至8.2，進行吸附，吸附過程中，保持體系的溫度為55℃；在吸附4.5h后，將樹脂過濾得到，并以濃度為0.45mol/l的氯化鈉溶液進行洗脫，然后將洗脫液以酒精沉淀，固液分離后，將固形物干燥得到實施例3的肝素鈉粗品。實施例4新鮮豬小腸經刮腸機處理得到新鮮粘膜，將粘膜粉碎后加水攪拌；然后，將體系ph調節(jié)至8.5，溫度調整至60℃，然后，按照2:1的比例加入堿性蛋白酶以及胰蛋白酶，并使得體系中兩種酶的濃度達到0.5g/l,并進行酶解，酶解的時間控制在3h；將所得酶解液濃縮后過濾，然后向濾液中加入樹脂，調節(jié)體系的ph至7.5，進行吸附，吸附過程中，保持體系的溫度為45℃；在吸附4.5h后，將樹脂過濾得到，并以濃度為0.45mol/l的氯化鈉溶液進行洗脫，然后將洗脫液以酒精沉淀，固液分離后，將固形物干燥得到實施例4的肝素鈉粗品。實施例5新鮮豬小腸經刮腸機處理得到新鮮粘膜，將粘膜粉碎后加水攪拌；然后，將體系ph調節(jié)至8.5，溫度調整至60℃，然后，按照2:1的比例加入堿性蛋白酶以及胰蛋白酶，并使得體系中兩種酶的濃度達到0.5g/l,并進行酶解，酶解的時間控制在3h；將所得酶解液濃縮后過濾，然后向濾液中加入樹脂，調節(jié)體系的ph至8.5，進行吸附，吸附過程中，保持體系的溫度為45℃；在吸附4.5h后，將樹脂過濾得到，并以濃度為0.45mol/l的氯化鈉溶液進行洗脫，然后將洗脫液以酒精沉淀，固液分離后，將固形物干燥得到實施例5的肝素鈉粗品。實施例6新鮮豬小腸經刮腸機處理得到新鮮粘膜，將粘膜粉碎后加水攪拌；然后，將體系ph調節(jié)至8.5，溫度調整至60℃，然后，按照2:1的比例加入堿性蛋白酶以及胰蛋白酶，并使得體系中兩種酶的濃度達到0.5g/l,并進行酶解，酶解的時間控制在3h；將所得酶解液濃縮后過濾，然后向濾液中加入樹脂，,調節(jié)體系ph至8.2進行吸附，吸附過程中，保持體系的溫度為45℃；在吸附4.5h后，將樹脂過濾得到，并以濃度為0.35mol/l的氯化鈉溶液進行洗脫，然后將洗脫液以酒精沉淀，固液分離后，將固形物干燥得到實施例6的肝素鈉粗品。實施例7新鮮豬小腸經刮腸機處理得到新鮮粘膜，將粘膜粉碎后加水攪拌；然后，將體系ph調節(jié)至8.5，溫度調整至60℃，然后，按照2:1的比例加入堿性蛋白酶以及胰蛋白酶，并使得體系中兩種酶的濃度達到0.5g/l,并進行酶解，酶解的時間控制在3h；將所得酶解液濃縮后過濾，然后向濾液中加入樹脂,調節(jié)體系ph至8.2，進行吸附，吸附過程中，保持體系的溫度為45℃；在吸附4.5h后，將樹脂過濾得到，并以濃度為0.55mol/l的氯化鈉溶液進行洗脫，然后將洗脫液以酒精沉淀，固液分離后，將固形物干燥得到實施例7的肝素鈉粗品。對比例1新鮮豬小腸經刮腸機處理得到新鮮粘膜，將粘膜粉碎后加水攪拌；然后，將體系ph調節(jié)至8.5，溫度調整至60℃，然后，加入堿性蛋白酶，并使得體系中兩種酶的濃度達到0.5g/l,并進行酶解，酶解的時間控制在3h；將所得酶解液濃縮后過濾，然后向濾液中加入樹脂,調節(jié)體系ph至8.2，進行吸附，吸附過程中，保持體系的溫度為45℃；在吸附4.5h后，將樹脂過濾得到，并以濃度為0.45mol/l的氯化鈉溶液進行洗脫，然后將洗脫液以酒精沉淀，固液分離后，將固形物干燥得到對比例1的肝素鈉粗品。對比例2新鮮豬小腸經刮腸機處理得到新鮮粘膜，將粘膜粉碎后加水攪拌；然后，將體系ph調節(jié)至8.5，溫度調整至60℃，然后，加入胰蛋白酶，并使得體系中兩種酶的濃度達到0.5g/l,并進行酶解，酶解的時間控制在3h；將所得酶解液濃縮后過濾，然后向濾液中加入樹脂,調節(jié)體系ph至8.2，進行吸附，吸附過程中，保持體系的溫度為45℃；在吸附4.5h后，將樹脂過濾得到，并以濃度為0.45mol/l的氯化鈉溶液進行洗脫，然后將洗脫液以酒精沉淀，固液分離后，將固形物干燥得到對比例2的肝素鈉粗品。實驗例1按照肝素鈉得率＝肝素鈉粗品質量/新鮮粘膜質量，分別計算各組實施例和對比例的肝素鈉得率，結果如下：實驗組肝素鈉得率(×100％)實施例10.035實施例20.029實施例30.030實施例40.027實施例50.026實施例60.024實施例70.022對比例10.015對比例20.013由如上的對比數據可以看出，以復合酶進行酶解能夠有效提高肝素鈉粗品的得率；同時，由各實施例組的得率數據對比也可以看出，樹脂吸附和洗脫條件對于肝素鈉粗品的得率也有著一定的影響。然后，分別對各組所制得的肝素鈉粗品進行吸光度測試，結果顯示：實施例1的肝素鈉粗品的吸光度明顯低于對比例1、2的吸光度。由此可見，以復合酶進行酶解所得肝素鈉粗品的純度要優(yōu)于采用單一酶進行酶解的產物；同時，實施例2-7所得肝素鈉粗品的吸光度基本相當，且稍高于實施例1產品。由此可見，相較于其他實驗組而言，以實施例1條件進行樹脂吸附和鹽水洗脫所得肝素鈉的純度最高。盡管已用具體實施例來說明和描述了本發(fā)明，然而應意識到，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可以作出許多其它的更改和修改。因此，這意味著在所附權利要求中包括屬于本發(fā)明范圍內的所有這些變化和修改。當前第1頁12