本發(fā)明涉及藥材質(zhì)量的檢測方法，具體涉及苦瓜葉中總皂苷含量的檢測方法。

背景技術(shù)：

苦瓜葉為葫蘆科苦瓜屬一年生蔓性草本植物苦瓜(Momordica charantia L.)的干燥葉。性涼、味苦。具清熱解毒、殺菌、止痢、止痛的功效，能治療胃痛，痢疾，疔瘡腫毒?？喙先~作為常用民間藥，使用廣泛，常用于治療蚊蟲叮咬后皮膚的紅腫熱痛、小兒痱子、熱毒瘡腫、楊梅瘡、狗咬和鵝掌風(fēng)。

苦瓜葉資源豐富，療效確切，民間使用廣泛，認(rèn)可度高且方便易得，具有較好的開發(fā)價值。但是目前，國內(nèi)外多對苦瓜果實進(jìn)行多角度研究而其葉研究甚少，尚缺乏對苦瓜葉的質(zhì)量評價方法和標(biāo)準(zhǔn)。

因此，為了確?？喙先~的質(zhì)量和安全，需要一種檢測方法，用于評估苦瓜葉的質(zhì)量。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種苦瓜葉中總皂苷含量的檢測方法，其特征在于：包括以下步驟：

(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：

a、對照品溶液的制備：

取人參皂苷Rg₁對照品，加甲醇配制成對照品溶液；

b、對照品溶液的測定：

取對照品溶液，除去溶劑，加入5％香草醛冰醋酸溶液，再加入的高氯酸溶液，混勻，密塞，于50℃～90℃下加熱，冷卻，加冰醋酸，在紫外分光光度儀中于558nm下測定吸光度，根據(jù)檢測結(jié)果得到標(biāo)準(zhǔn)曲線；

其中，所述5％香草醛冰醋酸溶液與對照品溶液的體積比為3：1～6：1，高氯酸溶液與對照品溶液的體積比為15：1；

(2)待測樣品中總皂苷含量的測定：

c、供試品溶液的制備：

取待測苦瓜葉樣品，60℃～90℃的石油醚回流提取，過濾，棄去濾液，重復(fù)一次，取殘渣，60％～90％的乙醇超聲或回流提取，過濾，用相應(yīng)濃度的乙醇補(bǔ)足所失重量，得供試品溶液；

d、供試品溶液的測定：

取供試品溶液，以步驟b的方法進(jìn)行測定，根據(jù)步驟(1)的標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測樣品中總皂苷的含量。

進(jìn)一步地，所述步驟b中，5％香草醛冰醋酸溶液與對照品溶液的體積比為4：1。

進(jìn)一步地，所述步驟b的加熱為60℃下加熱。

進(jìn)一步地，所述步驟b的加熱時間不少于20分鐘。

進(jìn)一步地，所述步驟b中，冰醋酸與對照品溶液的體積比為25：1。

進(jìn)一步地，步驟c中，所述乙醇為70％的乙醇。

進(jìn)一步地，步驟c中，所述乙醇提取為回流提取。

進(jìn)一步地，所述乙醇回流提取的溫度為60℃。

進(jìn)一步地，所述乙醇回流提取的時間為0.5～1.5小時，優(yōu)選1小時。

進(jìn)一步地，所述乙醇與待測苦瓜葉樣品的體積質(zhì)量比為100mL：1g～160mL：1g。

本發(fā)明苦瓜葉中總皂苷含量的檢測方法，通過多個工藝的篩選，可以準(zhǔn)確、可靠、簡便地檢測苦瓜葉中總皂苷的含量，從而有效監(jiān)控苦瓜葉藥材的質(zhì)量，為苦瓜葉的臨床療效提供了有效保障。

顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。

以下通過實施例形式的具體實施方式，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

附圖說明

圖1為苦瓜葉總皂苷紫外測定標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖2為不同產(chǎn)地苦瓜葉總皂苷測定結(jié)果。

具體實施方式

下述實施例所用實驗材料如下：

不同采收地點(diǎn)的樣品于2011年8月前后分別采自四川省成都市、彭州市、簡陽市、內(nèi)江市、自貢市、宜賓市及河北保定，浙江嘉興，廣東佛山等地。采集新鮮葉，除去雜質(zhì)，陰干即得。以上實驗樣品均經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院蔣桂華教授鑒定為葫蘆科植物苦瓜Momordica charantia L.的干燥葉。樣品采集地點(diǎn)、時間及生長環(huán)境見表1。

于2011年8月20日對口采于四川省彭州市敖平鎮(zhèn)，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院蔣桂華教授鑒定為葫蘆科苦瓜屬植物苦瓜Momordica charantia L.的干燥葉，作為對照藥材；所用試劑均為分析純。

表1不同產(chǎn)地苦瓜葉樣品

儀器如下：

十萬分之一電子天平(德國SartoriusBP211D)，紫外分光光度計(日本島津UV-1600型)，真空干燥箱(上海森信實驗儀器有限公司，DZG-6090型)，電子天平(上海YP601N)，超聲波清洗器，電子恒溫水浴鍋等。

試藥與試劑如下

人參皂苷Rg₁(中國食品藥品檢定研究院110703-201128)；石油醚，乙醇，冰醋酸，高氯酸等均為分析純試劑。

實施例1

(1)總皂苷含量測定方法的考查

1對照品溶液

對照品溶液：取干燥至恒重的人參皂苷Rg₁對照品適量，精密稱定，置于10mL容量瓶，加入甲醇，定容，制成0.5mg/mL的人參皂苷Rg₁溶液。

2測定波長考查

精密量取0.125mL人參皂苷Rg₁對照品溶液于10mL的具塞刻度試管中，水浴揮干溶劑，加新配制的5％香草醛冰醋酸溶液0.2mL、高氯酸2.0mL，搖勻，密塞，結(jié)果顯示，在558nm處人參皂苷Rg₁對照品溶液有最大吸收。

因此，將測定波長定為558nm。

3顯色方法考查

3.1香草醛用量考查

精密量取人參皂苷Rg₁對照品溶液0.2mL，6份，于10mL的具塞刻度試管中，水浴揮干溶劑，分別加入新配制的5％香草醛冰醋酸溶液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL，再加高氯酸0.8mL，搖勻，密塞，于60℃水浴加熱15min，冷卻，加冰醋酸5.0mL，于紫外分光光度儀中測定吸光度。結(jié)果見表2。

表2 5％香草醛冰醋酸用量考查

結(jié)果顯示：當(dāng)5％香草醛冰醋酸溶液加入量為0.6～1.2mL時，吸光度均較大。其中，0.8mL的加入量為最佳。

因此，將5％香草醛冰醋酸溶液用量定為0.8mL。

3.2高氯酸用量考查

精密量取人參皂苷Rg₁對照品溶液0.2mL，6份，于10mL的具塞刻度試管中，水浴揮干溶劑，加新配制的5％香草醛冰醋酸溶液0.8mL，再分別加高氯酸2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL，搖勻，密塞，于60℃水浴加熱15min,冷卻，加冰醋酸5mL，于紫外分光光度儀中測定吸光度。結(jié)果見表3。

表3高氯酸用量考查

結(jié)果顯示：高氯酸加入量為3.0mL時，供試品的吸光度值最大為0.348。

因此，將高氯酸用量定為3.0mL。

3.3顯色溫度考查

精密量取人參皂苷Rg₁對照品溶液0.2mL，6份，于10mL的具塞刻度試管中，水浴揮干溶劑，加入新配制的5％香草醛冰醋酸溶液0.8mL、高氯酸3mL，搖勻，密塞，分別于40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃水浴加熱15min，冷卻，加冰醋酸5mL，于紫外分光光度儀中測定吸光度。結(jié)果見表4。

表4顯色溫度考查

結(jié)果顯示：當(dāng)顯色溫度為60℃時已能充分顯色，故選擇顯色溫度為60℃。

3.4顯色時間考查

精密量取人參皂苷Rg₁對照品溶液0.2mL，6份，于10mL的具塞刻度試管中，水浴揮干溶劑，加入新配制的5％香草醛冰醋酸溶液0.8mL、高氯酸3mL，搖勻，密塞，60℃水浴加熱5min、10min、15min、20min、25min、30min，冷卻，加冰醋酸5mL，于紫外分光光度儀中測定吸光度。結(jié)果見表5。

表5顯色時間考查

結(jié)果顯示：吸光度值A(chǔ)在供試品溶液顯色20min后趨于穩(wěn)定，因此，將顯色時間定為20min。

小結(jié)：最佳顯色方法為：量取供試品溶液適量，于10mL的具塞刻度試管中，水浴揮干溶劑，加入新配制的5％香草醛冰醋酸溶液0.8mL、高氯酸3mL，搖勻，密塞，60℃水浴加熱20min。

(2)線性關(guān)系考查

分別精密移取人參皂苷Rg₁對照品溶液50μL、100μL、150μL、200μL、250μL、300μL、350μL、400μL于10mL的具塞刻度試管中，水浴揮干溶劑，加新配制的5％香草醛冰醋酸溶液0.8mL、高氯酸3.0mL，搖勻，密塞，于60℃水浴加熱20min，冷卻，加冰醋酸5.0mL，測定吸光度。以吸光度A為縱坐標(biāo)，人參皂苷Rg₁含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得線性方程A＝4.7599x-0.0139，R₂＝0.9970。在0.0252～0.2021mg范圍內(nèi)，吸光度值A(chǔ)與人參皂苷Rg₁含量呈良好的線性關(guān)系。結(jié)果見表6、圖1。

表6線性關(guān)系考察

(3)儀器精密度考查

精密量取人參皂苷Rg₁對照品溶液適量，于10mL具塞試管中，照前述最佳顯色條件顯色，測定其吸光度A。結(jié)果見表7。

表7儀器精密度考查

實驗結(jié)果顯示，人參皂苷Rg₁溶液的吸光度值A(chǔ)穩(wěn)定，計算其RSD值，為0.12％，說明該儀器精密度良好，可進(jìn)行人參皂苷Rg₁溶液的吸光度值A(chǔ)的測定。

(4)苦瓜葉供試品溶液制備方法考查

1提取方法考查

取同一批次(表1中6號樣)苦瓜葉樣品粉末0.5g，6份，精密稱定，置于250mL錐形瓶中，加石油醚(60～90℃)50mL，水浴回流1h，濾過，棄去濾液。重復(fù)一次。殘渣加入不同提取溶劑50mL，稱重，采用不同提取方法下提取1小時，用相應(yīng)提取溶劑補(bǔ)至原重，過濾，取濾液250μL于10mL具塞試管中，水浴揮干溶劑，顯色，定容，測定吸光度，結(jié)果見表8.

表8提取方法的選擇

實驗結(jié)果顯示：回流提取所測定的吸光度A略高于超聲提取；隨著乙醇濃度的升高，所測定的吸光度A也隨之升高，在乙醇濃度為70％時達(dá)到峰值，隨后略有下降。70％乙醇回流提取時所測得的吸光度A最大，為0.899。因此，將苦瓜葉總皂苷的提取方法定為70％乙醇回流提取。

2回流提取溫度考查

取同一批次(表1中6號樣)苦瓜葉樣品粉末0.5g，6份，精密稱定，置于250mL錐形瓶中，加石油醚(60～90℃)50mL，水浴回流1h，濾過，棄去濾液。重復(fù)一次。殘渣加70％乙醇50mL，稱重，在不同溫度下提取1h，用70％乙醇補(bǔ)至原重，過濾，取濾液250μL于10mL具塞試管中，水浴揮干溶劑，顯色，定容，測定吸光度。結(jié)果如表9。

表9回流提取溫度考查

結(jié)果顯示：60℃回流提取時吸光度最大，故選擇提取溫度為60℃。

3提取時間考查

取同一批次(表1中6號樣)苦瓜葉樣品粉末0.5g，6份，精密稱定，置于250mL錐形瓶中，加石油醚(60～90℃)50mL，水浴回流1h，濾過，棄去濾液。重復(fù)一次。殘渣加70％乙醇50mL，稱重，60℃回流提取不同時間，用70％乙醇補(bǔ)至原重，過濾，取濾液250μL于10mL具塞試管中，水浴揮干溶劑，顯色，定容，測定吸光度。結(jié)果如表10。

表10提取時間考查

結(jié)果顯示：以70％乙醇為溶劑回流提取1h，所測定的吸光度最大。故選擇提取時間為1h。4料液比考查

取同一批次(表1中6號樣)苦瓜葉樣品粉末0.5g，6份，精密稱定，置于250mL錐形瓶中，加石油醚(60～90℃)50mL，水浴回流1h，濾過，棄去濾液。重復(fù)一次。殘渣加70％乙醇不同體積，稱重，60℃回流提取1h，用70％乙醇補(bǔ)至原重，過濾，取濾液250μL于10mL具塞試管中，水浴揮干溶劑，顯色，定容，測定吸光度。結(jié)果如表11。

表11料液比考查

結(jié)果顯示：提取溶劑為50mL時已能充分提取苦瓜葉中的總皂苷，當(dāng)提取溶劑為70mL時提取效率最高；綜合考慮0.5g苦瓜葉以80％乙醇50mL提取最佳。故選擇提取體積為50mL，即料液比為1:100。

小結(jié)：供試品溶液的最佳制備方法為：取苦瓜葉粉末0.5g，精密稱定，置于250mL錐形瓶中，加石油醚(60～90℃)50mL，水浴回流1h，濾過，棄去濾液。重復(fù)一次。殘渣加70％乙醇50mL，稱重，60℃回流提取1h，用70％乙醇補(bǔ)至原重，過濾。即得供試品溶液。

(5)穩(wěn)定性實驗

平行精密量取供試品溶液250μL共6份，置于10mL具塞試管中，水浴揮干溶劑，顯色，定容，計時，每間隔10min測定一次吸光度值A(chǔ)。結(jié)果如表12。

表12苦瓜葉總皂苷測定穩(wěn)定性試驗

實驗結(jié)果顯示：60min內(nèi)吸光度A無明顯變化，在0.900～0.904之間。計算得RSD值為0.16％，說明在本實驗條件下，供試品溶液顯色60min內(nèi)吸光度值A(chǔ)穩(wěn)定，說明本實驗方法穩(wěn)定性良好。

(6)重復(fù)性試驗

取同一批次(表1中6號樣)苦瓜葉樣品粉末0.5g，6份，精密稱定，按前述最佳的供試品溶液制備方法制備供試品溶液。精密量取供試品溶液250μL于10mL具塞試管中，照前述最佳的顯色條件顯色，測定吸光度。計算苦瓜葉藥材中總皂苷含量。結(jié)果如表13。

表13苦瓜葉總皂苷測定重復(fù)性試驗

結(jié)果顯示：1～6平行供試品溶液的吸光度為0.893～0.903，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算得出1～6平行供試品總皂苷含量為7.70％～7.72％，平均含量為7.71％，計算得出其RSD值為0.18％，說明本實驗方法重復(fù)性較好。

(7)回收率實驗

取同一批次(表1中6號樣)苦瓜葉樣品粉末0.5g，6份，精密稱定，加入人參皂苷Rg₁對照品1mg，按前述最佳的苦瓜葉總皂苷含量測定供試品溶液制備方法制備供試品溶液。量取供試品溶液250μL，置于10mL具塞試管中，水浴揮干溶劑，按前述最佳的顯色條件顯色，測定吸光度。按線性方程計算苦瓜葉總皂苷含量，結(jié)果見表14。

表14苦瓜葉總皂苷測定回收率考查

實驗結(jié)果顯示：1～6號供試品的加樣回收率為99.92％～100.04％，均值為99.97％，計算其RSD為0.38％，說明本實驗方法加樣回收良好。

(8)苦瓜葉總皂苷含量測定

取苦瓜葉粉末各0.5g，精密稱定，前述最佳的苦瓜葉總皂苷含量測定供試品溶液制備方法制備供試品溶液：量取供試品溶液100μL，置于10mL具塞試管中，水浴揮干溶劑，按前述最佳的顯色條件顯色，測定吸光度。按線性方程計算苦瓜葉總皂苷含量。結(jié)果見表15、圖2。

表15苦瓜葉總皂苷含量測定結(jié)果(n＝2)

綜上所述，本發(fā)明苦瓜葉中總皂苷含量的檢測方法，通過多個工藝的篩選，可以準(zhǔn)確、可靠、簡便地檢測苦瓜葉中總皂苷的含量，從而有效監(jiān)控苦瓜葉藥材的質(zhì)量，為苦瓜葉的臨床療效提供了有效保障。