用于飲料中總皂苷含量檢測(cè)的提純及檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于深加工技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及用于飲料(包括含酒精飲料)類食品中的總皂苷含量檢測(cè)的提純方法及其檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]皂苷是一類由留體或是三萜類化合物作為苷元與糖分子縮合而成的低聚糖苷，在自然界分布很廣，是很多中草藥中的主要活性成分。在保健食品、保健中藥和藥食兩用的食材中，總皂苷被認(rèn)為是以多味中藥為主原料的保健品中的主要功效成分，具有保護(hù)心血管、提高記憶力、抗疲勞、改善機(jī)體免疫力、抗菌等有價(jià)值的生物活性。因此對(duì)酒類食品基質(zhì)中總皂苷含量的質(zhì)量控制有重要意義。
[0003]關(guān)于總皂苷的純化和測(cè)定方法有很多研宄報(bào)道。采用大孔吸附樹脂法，是目前提取分離純化總皂苷的普遍方法。徐媛等人采用Amberlite XAD-2大孔樹脂純化保健酒樣品，以期去除一定的雜質(zhì)，提高酒類樣品中總皂苷的含量(徐媛等，保健酒中總皂苷含量測(cè)定方法研宄，藥物研宄，2014，30)。同樣江長(zhǎng)源等人也使用XAD-2大孔樹脂對(duì)傳統(tǒng)保健酒中的總皂苷進(jìn)行純化(江長(zhǎng)源等人，傳統(tǒng)保健酒中功效成分的檢測(cè)和穩(wěn)定性研宄，釀酒科技，2008，3 (165):78-80)。利用傳統(tǒng)的溶劑萃取也是提純總皂苷的常用方法。任小虎等人采用無(wú)水乙醇和正丁醇反復(fù)沉淀，對(duì)保健酒類樣品中的總皂苷進(jìn)行提取分離(任小虎等，保健酒中人參皂苷含量的測(cè)定，釀酒，2012，39(3)，65-67);李兆明等人采用正丁醇結(jié)合超聲波提取，反復(fù)沉淀提純保健酒中人參總皂苷，通過(guò)比色法測(cè)定含量(李兆明等，比色法測(cè)定保健酒中人參總皂苷含量，吉林中醫(yī)藥，2009，29 (5):425-426)。傳統(tǒng)采用大孔樹脂純化樣品后，直接使用比色法測(cè)定總皂苷含量。不同的前處理方法對(duì)保健食品中總皂苷含量的測(cè)定有明顯的影響。選用不同的大孔樹脂處理，結(jié)合比色法測(cè)定含量，對(duì)不同前處理對(duì)總皂苷的回收率進(jìn)行比較，得出，D-101和D-941聯(lián)用對(duì)總皂苷的純化效果最好(彭維等，不同前處理方法對(duì)保健食品中總皂苷含量測(cè)定的影響，食品研宄與開發(fā)，2014，35(8):90-93)。固相萃取小柱處理也是一種常用的純化富集總皂苷的方法。茅向軍等人采用不同填料(WatersOasis HLB柱，ODS小柱，Strata小柱)的固相萃取小柱，對(duì)血漿中人參皂苷Re進(jìn)行純化處理，結(jié)果表明Warers Oasis HLB柱有較好的處理效果(茅向軍等，不同填料的固相小柱對(duì)人參皂苷Re血漿樣品萃取回收率的研宄，中國(guó)重要雜志，2005，30 (19):1516-1518)。
[0004]目前常規(guī)的飲料中總皂苷含量的檢測(cè)方法采用大孔樹脂純化法結(jié)合比色法，但是對(duì)于含酒精飲料，由于酒精的存在會(huì)在很大程度上造成皂苷的流失，從而影響含量的測(cè)定結(jié)果，因此在樣品純化前通常要先經(jīng)過(guò)一步揮干步驟以除去酒精，但是揮干步驟不僅會(huì)增加皂苷的損失而且會(huì)使純化檢測(cè)變得復(fù)雜。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種用于飲料中總皂苷含量檢測(cè)的提純方法，所述方法操作簡(jiǎn)單，過(guò)程中總皂苷的損失少。
[0006]本發(fā)明的用于飲料中總皂苷含量檢測(cè)的提純方法包括以下步驟:
[0007]I)樣品預(yù)處理:向飲料中加入其0-5倍體積的蒸餾水，混勻；
[0008]2)固相萃取小柱預(yù)處理:固相萃取小柱先用2-4BV的有機(jī)溶劑活化，再用2-4BV的蒸餾水洗滌；
[0009]3)樣品純化:將一定量的樣品溶液緩慢加入已預(yù)處理的固相萃取小柱，先用
2-3BV的蒸餾水洗滌，然后用一定量的有機(jī)溶劑洗脫，收集洗脫液，所述洗脫液直接用于總皂苷含量的檢測(cè)。
[0010]進(jìn)一步地，步驟I)中加入蒸餾水的量根據(jù)飲料中的酒精含量而定，以使稀釋后的樣品中的酒精度數(shù)在25度以內(nèi)，更佳為在20度以內(nèi)。
[0011]優(yōu)選地，步驟I)中所述飲料為含酒精飲料。
[0012]優(yōu)選地，步驟2)中固相萃取小柱為反相C18柱或HLB柱。
[0013]優(yōu)選地，步驟2)和3)中所述有機(jī)溶劑為甲醇或乙醇。
[0014]本發(fā)明人在研宄中意外地發(fā)現(xiàn)在提純含酒精飲料時(shí)，如果將飲料中的酒精濃度控制在一定的范圍內(nèi)，則飲料中原有的酒精就不會(huì)造成較大的皂苷流失影響，因此本發(fā)明的方法在提純含酒精飲料之前將飲料進(jìn)行稀釋處理。
[0015]進(jìn)一步地，將本發(fā)明的提純方法應(yīng)用于飲料中總皂苷含量的檢測(cè)，所述檢測(cè)采用常規(guī)的比色法檢測(cè)樣品中總皂苷的含量，為了提高檢測(cè)方法的精確度，可在樣品溶液中加入內(nèi)標(biāo)后再進(jìn)行步驟3)的固相萃取操作，并在固相萃取之后增加內(nèi)標(biāo)得率的測(cè)定步驟:
[0016]將步驟3)得到的洗脫液采用高效液相色譜法測(cè)定內(nèi)標(biāo)峰面積，同樣條件測(cè)定未經(jīng)過(guò)固相萃取小柱處理的內(nèi)標(biāo)峰面積，利用面積比計(jì)算內(nèi)標(biāo)得率；
[0017]最后在常規(guī)比色法總皂苷含量的計(jì)算中將這個(gè)內(nèi)標(biāo)得率也計(jì)算在內(nèi)(除以內(nèi)標(biāo)得率)，即得出最終的樣品總皂苷含量值。
[0018]優(yōu)選地，所述內(nèi)標(biāo)為三七皂苷Rl。
[0019]優(yōu)選地，內(nèi)標(biāo)得率的測(cè)定步驟中所述高效液相色譜法的檢測(cè)程序?yàn)?流動(dòng)相A相:純水，B相:乙腈；梯度洗脫條件(v/v):0-20min, 15-40% B相，流速lmL/min ；C18色譜柱；柱溫20-40°C ；DAD檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)為203nm。
[0020]優(yōu)選地，內(nèi)標(biāo)得率的測(cè)定步驟中樣品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液上高效液相色譜前先經(jīng)過(guò)
0.45 μ m濾膜過(guò)濾。
[0021]優(yōu)選地，上述比色法檢測(cè)總皂苷的步驟為:
[0022]A)顯色反應(yīng):分別吸取200 μ L經(jīng)上述提純步驟得到的洗脫液和不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液至不同的具塞試管中，在60°C水浴蒸干，加入0.2mL的5%香草醛-冰乙酸溶液，混勻；再加入0.8mL高氯酸，搖勾，在60°C水浴加熱15min，取出后迅速冰浴冷卻5min，加入5mL冰乙酸稀釋，混勻，靜置2min ;以不加樣品或標(biāo)準(zhǔn)品的溶液為空白對(duì)照；
[0023]B)吸光度值測(cè)定:在400-700nm處掃描，確定最大吸收波長(zhǎng)，在最大吸收波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值；
[0024]C)樣品總皂苷含量計(jì)算:根據(jù)步驟B)得到的吸光度值制作濃度-吸光度值回歸曲線方程，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算樣品總皂苷含量。
[0025]優(yōu)選地，步驟A)中所述標(biāo)準(zhǔn)品為人參皂苷Re。
[0026]本發(fā)明所述的飲料中總皂苷的提純方法消除了飲料中的酒精對(duì)皂苷提純得率的影響，具有操作步驟簡(jiǎn)單，且過(guò)程中損失量少的優(yōu)點(diǎn)；采用固相萃取小柱進(jìn)一步提高了總皂苷的得率。將該提純方法用于飲料中總皂苷含量的檢測(cè)可提高該檢測(cè)方法的靈敏度，使該檢測(cè)方法的適用范圍更廣；進(jìn)一步，在該檢測(cè)方法中加入內(nèi)標(biāo)可將損失也計(jì)算在內(nèi)，從而提高檢測(cè)方法的精確度；采用制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法計(jì)算總皂苷含量也比常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)方法中的比例法更精確，誤差較小。
【附圖說(shuō)明】
[0027]圖1顯示的是實(shí)施例和對(duì)比例中測(cè)得的總皂苷含量的對(duì)比結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0028]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
[0029]實(shí)施例1
[0030]I)樣品預(yù)處理:取33度保健酒，加入I倍體積的蒸餾水，充分混勻，得到酒精度為16.5度的樣品溶液；
[0031]2)反相C18小柱預(yù)處理:先用3BV的甲醇沖洗活化柱子，再用3BV的蒸餾水沖洗，
備用;
[0032]3)樣品純化:將2mL稀釋后的樣品溶液(含有100 μ L三七皂苷Rl內(nèi)標(biāo))加入已處理好的反相C18柱，先用4mL蒸餾水沖洗，再用2mL甲醇洗脫，收集洗脫液；
[0033]4)高效液相色譜檢測(cè):將步驟3)中得到的樣品以及未經(jīng)固相萃取處理的三七皂苷Rl配制成的相同濃度的溶液，等體積以同樣的條件采用高效液相色譜法測(cè)定內(nèi)標(biāo)峰面積，具體步驟為:過(guò)0.45 μπι濾膜，使用程序I檢測(cè)，記錄峰面積；所述程序I中的流動(dòng)相分別為A相:純水，B相:乙腈，色譜純；采用的梯度洗脫條件(v/v):0-20min，15-40%B相；流速 lmL/min，采用常規(guī)的 C18 色譜柱(250X4.6mm 1.d.，5 μπι);柱溫 20-40°C ；DAD 檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)為203nm。得到峰面積，按照濃度-峰面積比，計(jì)算三七皂苷Rl的得率為97.53%。
[0034]5)顯色反應(yīng):分別吸取步驟3)中得到的洗脫液和不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液(人參皂苷Re) 200 μ L至不同的具塞試管中，在60°C水浴蒸干，加入0.2mL的5%香草醛-冰乙酸溶液，混勾；再加入0.8mL高氯酸，搖勾，在60°C水浴加熱15min，取出后迅速冰浴冷卻5min，加入5mL冰乙酸稀釋，混勻，靜置2min ;以不加樣品溶液為空白對(duì)照。
[0035]6)吸光度值測(cè)定:在400-700nm處掃描，確定最大吸收波長(zhǎng)為545nm ;在545nm測(cè)定步驟5)之后得到的樣品溶液和不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液(人參皂苷Re)的吸光度值；
[0036]7)總皂苷含量計(jì)算:根據(jù)步驟6)測(cè)定的不同濃度的人參皂苷Re的吸光度值，濃度-吸光度值回歸得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和步驟4)中得到的內(nèi)標(biāo)的得率