本發(fā)明屬于食品添加劑的檢測(cè)領(lǐng)域，特別是涉及一種面粉中偶氮甲酰胺的比色檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

偶氮甲酰胺（ADA）是一種工業(yè)中常用到的發(fā)泡劑，可用于制造塑料橡膠制品。同時(shí)，它也被廣泛應(yīng)用于食品加工，是一種國(guó)家批準(zhǔn)的食品添加劑，可以增加面粉的強(qiáng)度和韌性。在美國(guó)、加拿大、亞洲等許多國(guó)家都規(guī)定，面粉中偶氮甲酰胺的最大添加量為45 mg/kg。它作為氧化劑與濕面團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，主要產(chǎn)物是聯(lián)二脲，二次代謝物是鹽酸氨基脲。報(bào)道稱偶氮甲酰胺的二次代謝物鹽酸氨基脲是弱的動(dòng)物致癌物質(zhì)，同時(shí)，鹽酸氨基脲是一種獸藥呋喃西林的特征性代謝產(chǎn)物。所以，面粉中過(guò)量添加偶氮甲酰胺會(huì)對(duì)人體健康產(chǎn)生傷害。因此，對(duì)面粉中的偶氮甲酰胺的含量進(jìn)行監(jiān)測(cè)十分重要。

目前，面粉中偶氮甲酰胺的主要檢測(cè)方法有直接檢測(cè)法和間接檢測(cè)法。直接檢測(cè)法有紅外光譜法、拉曼光譜法、表面增強(qiáng)拉曼光譜法和高效液相色譜等。間接檢測(cè)法主要是通過(guò)檢測(cè)偶氮甲酰胺的二次衍生物鹽酸氨基脲來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)面粉中偶氮甲酰胺的檢測(cè)。這類方法先采取一些方法將面粉中偶氮甲酰胺反應(yīng)轉(zhuǎn)化成鹽酸氨基脲，再采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法或酶免疫吸附測(cè)定法對(duì)鹽酸氨基脲進(jìn)行測(cè)定。上述所有的直接檢測(cè)法和間接檢測(cè)法都存在儀器昂貴，成本高、耗時(shí)長(zhǎng)，前處理步驟復(fù)雜等缺點(diǎn)，拉曼和紅外光譜還存在重現(xiàn)性差等缺點(diǎn)，都無(wú)法滿足面粉中偶氮甲酰胺的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的需要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種面粉中偶氮甲酰胺的比色檢測(cè)方法，本發(fā)明建立的以金納米粒子為信號(hào)、谷胱甘肽為探針，通過(guò)對(duì)谷胱甘肽的定量間接檢測(cè)偶氮甲酰胺的比色分析方法具有快速、簡(jiǎn)便和靈敏等特點(diǎn)，可以通過(guò)裸眼觀測(cè)和紫外可見分光光度法實(shí)現(xiàn)對(duì)面粉中偶氮甲酰胺的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)；克服了傳統(tǒng)偶氮甲酰胺檢測(cè)方法儀器昂貴、前處理操作復(fù)雜等缺點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)面粉中偶氮甲酰胺的快速、低成本檢測(cè)。

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，采用如下技術(shù)方案：

一種面粉中偶氮甲酰胺的比色檢測(cè)方法，具體步驟如下：

（1）樣品前處理：稱取0.1g面粉于50 mL離心管中，加入10 mL丙酮，搖床30^oC，200rpm振揺20分鐘，然后超聲15分鐘，離心速度3000 rpm，離心5 min，取上清液5 mL，40 ^oC氮吹近干后加入H₂O定容成5 mL，用濾膜將溶液進(jìn)行過(guò)濾，在濾液中加入適量的三價(jià)砷（As³⁺）溶液，振揺20 min；

（2）制備樣品檢測(cè)液：在1.5 mL的離心管中，加入100μL 15μM的谷胱甘肽溶液，然后加入100μL步驟（1）溶液，混合均勻，置于50 ^oC恒溫振蕩器振蕩1 小時(shí)；接著加入100μL 濃度為20 mmol/L 的Britton-Robison緩沖溶液（pH=2.9），混合均勻；最后，加入300μL納米金溶液，40分鐘后通過(guò)目視觀測(cè)溶液顏色，同時(shí)，用紫外-可見分光光度計(jì)在400-800 nm范圍內(nèi)掃描溶液的吸光度；

（3）建立定性和定量分析模型：取8個(gè)1.5 mL 的離心管中，分別加入100μL 15μM的谷胱甘肽溶液，然后分別加入100μL不同濃度的偶氮甲酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，混合均勻，置于50 ^oC恒溫振蕩器振蕩1 小時(shí)；接著分別加入100μL 濃度為20 mmol/L 的Britton-Robison緩沖溶液（pH=2.9），混合均勻；最后，分別加入300μL納米金溶液，40分鐘后目視觀測(cè)不同濃度的偶氮甲酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的顏色，同時(shí)用紫外-可見分光光度計(jì)在400-800 nm范圍內(nèi)掃描溶液的吸光度，計(jì)算溶液在520nm和668nm處吸光度的比值（A₅₂₀/A₆₆₈），以濃度為橫坐標(biāo)、A₅₂₀/A₆₆₈做出標(biāo)準(zhǔn)工作曲線；

（4）進(jìn)行定性和定量分析：通過(guò)目視觀測(cè)溶液顏色，對(duì)比不同濃度偶氮甲酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的顏色，目視檢測(cè)步驟（2）樣品溶液中偶氮甲酰胺的含量；同時(shí)，也可以利用步驟（2）的樣品溶液在520nm和668nm處吸光度的比值（A₅₂₀/A₆₆₈），對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)工作曲線求出溶液中偶氮甲酰胺的含量；

步驟（1）中濾液中加入的三價(jià)砷的終濃度為5ppm；

步驟（2）所述的納米金溶液為：以檸檬酸為穩(wěn)定劑的納米金溶液，納米金粒徑為15-20nm。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)比較具有以下優(yōu)點(diǎn)：

（1）本發(fā)明所建立的偶氮甲酰胺檢測(cè)方法，具有較高的靈敏度，通過(guò)目視比色可以檢測(cè)低至500 nM (58.1 ppb)的偶氮甲酰胺，采用紫外可見分光光度法可以檢測(cè)低至50 nM (5.81 ppb)的偶氮甲酰胺，可滿足實(shí)際面粉類食品中偶氮甲酰胺的檢測(cè)，無(wú)需借助大型昂貴的儀器。

（2）操作簡(jiǎn)單、方便，檢測(cè)速度快，檢測(cè)整個(gè)過(guò)程在2小時(shí)之內(nèi)完成；檢測(cè)成本低，一個(gè)樣品檢測(cè)成本低于1元。

（3）本發(fā)明所建立的檢測(cè)方法檢測(cè)面粉實(shí)際樣品無(wú)需復(fù)雜的前處理過(guò)程，相對(duì)于色譜方法無(wú)需復(fù)雜的分離過(guò)程便可立即檢測(cè)。

附圖說(shuō)明

圖1利用所建立的方法檢測(cè)不同濃度偶氮甲酰胺溶液顏色的變化圖。

圖2利用所建立的方法檢測(cè)不同濃度偶氮甲酰胺溶液的紫外-可見吸收光譜圖。

圖3不同濃度偶氮甲酰胺溶液的工作曲線。

具體實(shí)施方式

為進(jìn)一步公開而不是限制本發(fā)明，以下結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。

一種面粉中偶氮甲酰胺的比色檢測(cè)方法，具體步驟如下：

（1）稱取0.1g 面粉于 50 mL 離心管中，加入10 mL丙酮，搖床30^oC，200rpm振揺 20 分鐘，然后超聲15分鐘，離心機(jī)3000 rpm離心5 min，取上清液5 mL，40 ^oC氮吹近干后加入 H₂O 定容成5 mL,用0.45μm濾膜將溶液進(jìn)行過(guò)濾，在濾液中加入終濃度為5ppm的的三價(jià)砷（As³⁺）溶液，振揺20 min，最終溶液用于偶氮甲酰胺的檢測(cè)；

（2）在1.5 mL 的離心管中，加入100μL 15μM的谷胱甘肽溶液，然后加入100μL含有步驟（1）制備的樣品溶液，混合均勻，置于50 ^oC恒溫振蕩器振蕩1 小時(shí)。接著加入100μL 濃度為20 mmol/L 的BR緩沖液（pH=2.9），混合均勻。最后，加入300μL納米金溶液（納米金粒徑15-20nm，溶液呈酒紅色），40分鐘后通過(guò)目視觀測(cè)溶液顏色，同時(shí)，用紫外-可見分光光度計(jì)在400-800 nm范圍內(nèi)掃描溶液的吸光度，計(jì)算溶液在520nm和668nm處吸光度的比值（A₅₂₀/A₆₆₈）；

（3）取8個(gè)1.5 mL 的離心管中，分別加入100μL 15μM的谷胱甘肽溶液，然后分別加入100μL不同濃度的偶氮甲酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，混合均勻，置于50 ^oC恒溫振蕩器振蕩1 小時(shí)；接著分別加入100μL 濃度為20 mmol/L 的BR緩沖溶液（pH=2.9），混合均勻；最后，分別加入300μL納米金溶液，40分鐘后目視觀測(cè)不同濃度的偶氮甲酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的顏色，同時(shí)用紫外-可見分光光度計(jì)在400-800 nm范圍內(nèi)掃描溶液的吸光度，計(jì)算溶液在520nm和668nm處吸光度的比值（A₅₂₀/A₆₆₈），以濃度為橫坐標(biāo)、A₅₂₀/A₆₆₈做出標(biāo)準(zhǔn)工作曲線；

（4）通過(guò)目視觀測(cè)溶液顏色，對(duì)比不同濃度偶氮甲酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的顏色，目視檢測(cè)樣品溶液中偶氮甲酰胺的含量。同時(shí)，也可以利用步驟（2）的樣品溶液在520nm和668nm處吸光度的比值（A₅₂₀/A₆₆₈），對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)工作曲線求出溶液中偶氮甲酰胺的含量。

本發(fā)明以納米金為信號(hào)指示劑、谷胱甘肽為識(shí)別探針，在固定濃度的谷胱甘肽存在下，谷胱甘肽會(huì)通過(guò)巰基與納米金粒子表面產(chǎn)生作用形成共價(jià)鍵，使金納米粒子形成自組裝網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致金納米粒子發(fā)生團(tuán)聚，使納米金溶液呈藍(lán)色（納米金溶液原本為酒紅色），同時(shí)溶液在520nm的吸收減小、而在668nm處出現(xiàn)一個(gè)新的吸收峰。而偶氮甲酰胺可以和固定濃度的谷胱甘肽產(chǎn)生定量偶聯(lián)反應(yīng)，降低了谷胱甘肽對(duì)金納米溶液的團(tuán)聚作用，使納米金溶液呈現(xiàn)酒紅色，同時(shí)溶液在520nm的吸收增大、而在668nm的吸收降低，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)偶氮甲酰胺的可視化和比色測(cè)定。

表1是利用所建立的方法對(duì)實(shí)際樣面粉河南省洛陽(yáng)市產(chǎn)自磨面粉的分析結(jié)果。

表1： 自磨面粉中偶氮甲酰胺加標(biāo)回收的分析結(jié)果

“-^a”表示沒有檢出

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。