本發(fā)明涉及免疫學(xué)領(lǐng)域和化學(xué)發(fā)光分析領(lǐng)域，具體涉及一種多腫瘤標(biāo)志物的無標(biāo)記化學(xué)發(fā)光成像免疫傳感器的制備及分析方法。

背景技術(shù)：

腫瘤的早期診斷與治療是提高腫瘤患者存活率的關(guān)鍵。人血清中腫瘤標(biāo)志物的含量與腫瘤的發(fā)展階段有著密切的聯(lián)系，其對腫瘤的鑒別診斷、輔助診斷、觀察療效、監(jiān)測復(fù)發(fā)和愈后評價都有非常高的應(yīng)用價值。因此，對腫瘤標(biāo)志物可靠靈敏的檢測是腫瘤篩查和預(yù)估的關(guān)鍵。然而，許多資料證實，不同的腫瘤或同種腫瘤的不同組織類型既可能有共同的腫瘤標(biāo)志物，也可能有不同的腫瘤標(biāo)志物，因此尋找僅針對某一種腫瘤，并具有100％特異性和敏感性的“理想”腫瘤標(biāo)志物是十分困難的，臨床上為了提高腫瘤檢測的準(zhǔn)確性和可靠性，往往都是將檢測與目標(biāo)腫瘤相關(guān)的一組標(biāo)志物，僅能檢測一種腫瘤標(biāo)志物的單組分分析方法已經(jīng)滿足不了臨床診斷的需求，因此亟待發(fā)展多組分免疫分析新技術(shù)。

多組分分析技術(shù)可以在單個分析流程中實現(xiàn)多種組分的同時或近同時檢測，具有分析通量高、樣品消耗少、所需時間短、分析成本低等優(yōu)點。目前多組分免疫分析方法主要有空間分辨和多標(biāo)記物兩種模式。多標(biāo)記物模式中，需要將多種標(biāo)記物標(biāo)記在蛋白上，存在標(biāo)記步驟的復(fù)雜、費力、耗時，標(biāo)記后的抗體或抗原分子生物活性降低等缺陷。多種標(biāo)記物經(jīng)常需要不同的最優(yōu)分析條件，如各種標(biāo)記酶催化反應(yīng)的最優(yōu)pH值、溫度等都不相同，因此只能妥協(xié)某些條件從而導(dǎo)致較差的分析性能。此外，由于化學(xué)發(fā)光的檢測沒有選擇性，多種標(biāo)記物之間相互干擾或化學(xué)發(fā)光信號的重疊也會使分析性能變差。

空間分辨模式是當(dāng)前多組分免疫分析模式中研究最多、應(yīng)用最廣的分析模式，其通過將各個組分按發(fā)光產(chǎn)生的位置不同來進(jìn)行區(qū)分，然后以陣列檢測器(如CID，CCD等)進(jìn)行檢測，從而得到相對應(yīng)的組分含量。從理論上講，只要基質(zhì)足夠大或者陣列足夠小，集成化程度高，就可以在基質(zhì)上構(gòu)建大量陣列，以達(dá)到同時檢測大量樣品的目的。因此基于陣列法的空間分辨模式具有高分析通量和多檢測對象，分析速度快，樣品消耗少等優(yōu)點，滿足臨床應(yīng)用的實際需求，是多組分免疫分析的主流趨勢。

發(fā)明申請“一種基于納米模擬酶的無標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫傳感器及制備和分析方法”(專利申請?zhí)枺?01510919955.1)通過使用納米模擬酶代替天然酶，改善了傳統(tǒng)化學(xué)發(fā)光免疫分析中天然酶穩(wěn)定性差，易受環(huán)境影響等缺點，使得構(gòu)建的化學(xué)發(fā)光體系的穩(wěn)定性和靈敏度得到顯著的提高，但是這個基于納米模擬酶的無標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫傳感器一次只能進(jìn)行單組份免疫分析，存在分析時間長，勞動量大，試劑消耗多等缺陷，這極大地限制了該傳感器的臨床應(yīng)用。因此本發(fā)明基于納米模擬酶的無標(biāo)記化學(xué)發(fā)光策略，進(jìn)一步構(gòu)建了免疫陣列傳感器，實現(xiàn)了多種腫瘤標(biāo)志物的同時、高通量檢測，適用于腫瘤早期的大規(guī)模篩查，具有非常重要的應(yīng)用價值和實際意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提出了一種基于納米模擬酶的無標(biāo)記化學(xué)發(fā)光成像免疫傳感器的制備及分析方法，用于多種腫瘤標(biāo)志物的同時檢測。

本發(fā)明通過絲網(wǎng)印刷技術(shù)在可拋式環(huán)氧硅烷化的載玻片表面制得4×12免疫傳感陣列，其包含48個檢測位點，即可以對48個樣品同時檢測，并將分散于殼聚糖的硫化銅納米粒子滴涂于陣列微孔中；再將生物素化的抗體修飾于鏈酶親和素功能化的硫化銅納米粒子表面，封閉后即制得該無標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫傳感器；與抗原發(fā)生特異性免疫反應(yīng)后形成的免疫復(fù)合物能有效阻礙化學(xué)發(fā)光底物向硫化銅納米粒子的擴(kuò)散并抑制模擬酶催化化學(xué)發(fā)光，引起化學(xué)發(fā)光信號強度的減弱，化學(xué)發(fā)光信號由電荷耦合檢測器CCD收集。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明提供了一種多腫瘤標(biāo)志物無標(biāo)記化學(xué)發(fā)光成像免疫傳感器的制備及分析方法，包括以下步驟：

(1)使用絲網(wǎng)印刷機在環(huán)氧硅烷化的載玻片表面制作4×12傳感陣列，形成48個陣列微孔；

(2)將硫化銅納米粒子超聲分散于蒸餾水中，取硫化銅懸濁液與殼聚糖溶液等體積混合，超聲分散均勻；取上述混合溶液滴涂于陣列微孔中，在室溫下反應(yīng)直至晾干；

(3)取鏈酶親和素溶液均勻滴涂于陣列微孔中，室溫下反應(yīng)后，4℃下放置過夜直至晾干，隨后用磷酸鹽緩沖液沖洗，在氮氣氣氛中吹干；

(4)取多種生物素化的抗體繼續(xù)滴涂于傳感陣列的陣列微孔中，室溫下反應(yīng)后，用磷酸鹽緩沖溶液沖洗，在氮氣氣氛中吹干；

(5)將封閉液，均勻滴涂與陣列微孔中封閉多余的活性位點，在4℃下封閉后，用磷酸鹽緩沖溶液沖洗，在氮氣氣氛中吹干；

(6)取帶有多種分析抗原的樣品溶液加入陣列微孔中，在線溫育；

(7)取含0.05％Tween-20的磷酸鹽緩沖溶液(PBST)沖洗免疫陣列，除去未反應(yīng)的免疫試劑，在氮氣氣氛中吹干；

(8)取化學(xué)發(fā)光底物滴入陣列微孔中；

(9)化學(xué)發(fā)光陣列檢測器采集化學(xué)發(fā)光信號。

進(jìn)一步地，步驟(1)中，4×12免疫傳感陣列如圖1所示，白色部分為環(huán)氧硅烷化的陣列微孔，直徑為2mm，邊緣間距為4mm；黑色部分為陣列微孔周圍的載玻片，并印刷有具有疏水作用的絕緣油漆。進(jìn)一步地，步驟(2)中所述的硫化銅納米粒子用量為1.0-3.0mg，殼聚糖溶液的濃度為1.0-2.0wt％。

進(jìn)一步地，步驟(3)中所述的鏈酶親和素溶液的濃度為20-50μg/mL。

進(jìn)一步地，步驟(4)中所述的生物素化的抗體的濃度為2-10μg/mL。

進(jìn)一步地，步驟(5)中所述的封閉液為1.0-5.0％牛血清蛋白溶液。

進(jìn)一步地，步驟(6)所述溫育的時間為20-40min。

進(jìn)一步地，步驟(9)所述的化學(xué)發(fā)光陣列檢測器為電荷耦合檢測器CCD，動態(tài)積分時間為5-10min。

進(jìn)一步地，步驟(2)(3)(4)(5)(6)(8)所述的滴入陣列微孔中的試劑量為4-8μL。

本發(fā)明達(dá)到了如下的有益效果：

本發(fā)明基于硫化銅納米模擬酶的無標(biāo)記化學(xué)發(fā)光分析策略，構(gòu)建了一種多組分免疫分析的傳感器，通過化學(xué)發(fā)光成像實現(xiàn)了同時檢測多種檢測腫瘤標(biāo)志物。本發(fā)明通過絲網(wǎng)印刷技術(shù)在可拋式環(huán)氧硅烷化的載玻片表面制得4×12免疫傳感陣列，即可以對48個樣品同時檢測，并將分散于殼聚糖的硫化銅納米粒子滴涂于陣列微孔中；再將生物素化的抗體修飾于鏈酶親和素功能化的硫化銅納米粒子表面，封閉后即制得該無標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫傳感陣列。此外，本發(fā)明還構(gòu)建了一種多腫瘤標(biāo)志物的無標(biāo)記化學(xué)發(fā)光成像免疫傳感陣列的分析方法。本發(fā)明具有如下優(yōu)點：

(1)本發(fā)明成功構(gòu)建了免疫傳感陣列，實現(xiàn)了空間分辨多組分免疫分析，改善了單組分免疫分析每次只能檢測一個樣品，存在分析時間長、勞動量大、試劑消耗多等缺陷。本發(fā)明所構(gòu)建的免疫傳感陣列能同時檢測48個分析試樣，具有高分析通量和多檢測對象、分析速度快、樣品消耗少等優(yōu)點，滿足臨床應(yīng)用的實際需求，適用于腫瘤早期的大規(guī)模篩查。

(2)本發(fā)明每個陣列微孔中只需加入4-8μL免疫試劑，極大地減小了試劑用量，節(jié)省了分析成本。此外，小體積的陣列微孔減小免疫試劑向界面的擴(kuò)散時間，加速了免疫試劑向界面的傳質(zhì)過程，從而縮短了免疫分析的時間，提高了分析的速度。

(3)本發(fā)明構(gòu)建的傳感器具有高的靈敏性、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，這是因為硫化銅具有大的比表面積和較強的吸附性能，結(jié)合生物素-鏈酶親和素系統(tǒng)的放大效應(yīng)，使傳感陣列界面上修飾了大量的抗體。具有良好生物相容性的傳感界面，不僅保持了抗體的生物活性，而且均一穩(wěn)定的抗體層覆蓋在硫化銅納米粒子信號層之上，能高效捕獲目標(biāo)抗原形成免疫復(fù)合物，從而阻礙化學(xué)發(fā)光底物向信號層的擴(kuò)散，極有利于無標(biāo)記分析策略的實現(xiàn)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明免疫傳感器的制作和免疫分析示意圖。

圖2為本發(fā)明免疫傳感器同時檢測AFP和CEA標(biāo)準(zhǔn)樣品的線性曲線。

圖中，1.水虎魚酸(H₂SO₄:H₂O₂＝7:3，v/v)；2.GPTMS(γ-環(huán)氧丙氧丙基三甲氧基硅烷)；3.硫化銅納米粒子；4.生物素化的抗體；5.鏈霉親和素；6.抗原；7.化學(xué)發(fā)光底物；8.電荷耦合檢測器CCD。

具體實施方式

為了闡明本發(fā)明的技術(shù)方案及技術(shù)目的，下面結(jié)合附圖及具體實施方式對本發(fā)明做進(jìn)一步的介紹。

實施例1

一種無標(biāo)記化學(xué)發(fā)光成像免疫傳感器，用于同時檢測甲胎蛋白(AFP)和癌胚抗原(CEA)，該免疫傳感器的制備及分析方法包括以下步驟：

(1)使用絲網(wǎng)印刷機在環(huán)氧硅烷化的載玻片表面制作4×12傳感陣列；

(2)將2.0mg硫化銅納米粒子超聲分散于蒸餾水中，取硫化銅懸浮液與1.0wt％殼聚糖溶液等體積混合，超聲分散均勻；取5μL上述混合溶液滴涂于陣列微孔中，在室溫下反應(yīng)直至晾干；

(3)取5μL 50μg/mL鏈酶親和素溶液均勻滴涂于陣列微孔中，室溫下反應(yīng)后，4℃下放置過夜直至晾干，隨后用磷酸鹽緩沖液沖洗，在氮氣氣氛中吹干；

(4)取5μL 1μg/mL生物素化的AFP抗體和2μg/mL生物素化的CEA抗體分別滴涂于傳感陣列的兩列陣列微孔中，室溫下反應(yīng)后，用磷酸鹽緩沖溶液沖洗，在氮氣氣氛中吹干；

(5)將5μL 1.0％血清白蛋白溶液，均勻滴涂陣列微孔中封閉多余的活性位點，在4℃下封閉后，用磷酸鹽緩沖溶液沖洗，在氮氣氣氛中吹干，制得該無標(biāo)記免疫傳感陣列；

(6)取5μL帶有AFP和CEA抗原的樣品加入陣列微孔中，在線溫育25min；

(7)PBST沖洗免疫陣列，除去未反應(yīng)的免疫試劑，在氮氣氣氛中吹干；

(8)取5μL化學(xué)發(fā)光底物[luminol(5mM)-PIP(0.6mM)-H₂O₂(4mM)]滴入陣列微孔中；

(9)電荷耦合檢測器CCD采集化學(xué)發(fā)光信號，動態(tài)積分時間為400s。

如圖2所示，測定不同濃度的AFP和CEA標(biāo)準(zhǔn)樣品，制得AFP和CEA標(biāo)準(zhǔn)樣品的線性曲線。制得標(biāo)準(zhǔn)曲線后，為考察該基于硫化銅納米模擬酶的無標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫傳感器實際應(yīng)用的可靠性，進(jìn)行了人血清樣品的檢測，并與標(biāo)準(zhǔn)方法(表1中樣品1-5的參考值由江蘇省腫瘤醫(yī)院提供，由商品化的電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測量)進(jìn)行了比較，實驗結(jié)果如表1所示：

表1

實施例2

一種無標(biāo)記化學(xué)發(fā)光成像免疫傳感器用于同時檢測糖鏈抗原125(CA125)、糖鏈抗原199(CA199)、甲胎蛋白(AFP)和癌胚抗原(CEA)，該免疫傳感器的制備及分析方法包括以下步驟：

(1)使用絲網(wǎng)印刷機在環(huán)氧硅烷化的載玻片表面制作4×12傳感陣列；

(2)將3.0mg硫化銅納米粒子超聲分散于蒸餾水中，取硫化銅懸浮液與2.0wt％殼聚糖溶液等體積混合，超聲分散均勻；取6μL上述混合溶液滴涂于陣列微孔中，在室溫下反應(yīng)直至晾干；

(3)取6μL 100μg/mL鏈酶親和素溶液均勻滴涂于陣列微孔中，室溫下反應(yīng)后，4℃下放置過夜直至晾干，隨后用磷酸鹽緩沖液沖洗，在氮氣氣氛中吹干；

(4)取6μL 1μg/mL生物素化的AFP抗體、1μg/mL生物素化的CEA抗體、1μg/mL生物素化的CA125抗體和1μg/mL生物素化的CA199抗體，分別滴涂于傳感陣列的一列陣列微孔中，室溫下反應(yīng)后，用磷酸鹽緩沖溶液沖洗，在氮氣氣氛中吹干；

(5)將6μL 1.0％血清白蛋白溶液，均勻滴涂于陣列微孔中封閉多余的活性位點，在4℃下封閉后，用磷酸鹽緩沖溶液沖洗，在氮氣氣氛中吹干，制得該無標(biāo)記免疫傳感陣列；

(6)取6μL帶有CA125、CA199、AFP和CEA抗原的樣品加入陣列微孔中，在線溫育35min；

(7)PBST沖洗免疫陣列，除去未反應(yīng)的免疫試劑，在氮氣氣氛中吹干；

(8)取6μL化學(xué)發(fā)光底物[luminol(5mM)-PIP(0.6mM)-H₂O₂(4mM)]滴入陣列微孔中；

(9)電荷耦合檢測器CCD采集化學(xué)發(fā)光信號，動態(tài)積分時間為8min。

以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進(jìn)，本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書、說明書及其等效物界定。