一種檢測多種雞細胞因子化學發(fā)光成像免疫傳感器的制備及分析方法
【專利摘要】本文發(fā)明了一種檢測多種雞細胞因子化學發(fā)光成像免疫傳感器的制備及分析方法，成像免疫傳感器用硅烷化的可拋式玻片制得，將不同雞細胞因子捕獲抗體用共價結合的方式包被于相應結合位點，信號分子辣根過氧化物酶與標記抗體共同固定在金納米粒子上，實現(xiàn)信號放大。基于夾心免疫反應，每一個檢測位點捕捉到的HRP會觸發(fā)化學發(fā)光，信號由電荷耦合器CCD收集，用于多種雞細胞因子的同時檢測。這種方法具有高通量、易操作、低成本等優(yōu)點，可實現(xiàn)對多種雞細胞因子的同時檢測，其穩(wěn)定性，可重復性及準確性使多種雞細胞因子的化學發(fā)光成像免疫檢測技術在禽類疾病檢測中顯示了很好的應用前景。
【專利說明】
一種檢測多種雞細胞因子化學發(fā)光成像免疫傳感器的制備及 分析方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及免疫學領域、化學發(fā)光分析和禽類細胞因子檢測等領域，具體涉及了 一種檢測多種雞細胞因子化學發(fā)光成像免疫傳感器的制備及分析方法。
【背景技術】
[0002] 自 1997年Halman提出化學發(fā)光免疫分析法（chemiluminescence immunoassay， CLIA)以來，該方法分析速度快、線性范圍寬、無散射光干擾、無放射性污染、儀器設備簡單、 標記物有效期長、重復性好，因此40年間在臨床診斷、生命分析等領域得到了廣泛應用。在 實際的應用中，常常需要檢測低豐度待測物樣品，因此，高靈敏的化學發(fā)光免疫分析法，是 近年來化學發(fā)光免疫分析方法發(fā)展的主要方向。為提高免疫分析的靈敏性，通常借用納米 材料作為信號放大的載體。
[0003] 細胞因子是一類能在細胞間傳遞信息、具有免疫調節(jié)和效應功能的蛋白質或小分 子多肽。分為干擾素、白細胞介素、腫瘤壞死因子、趨化因子、集落刺激因子、生長因子等。細 胞因子在體內通過自分泌、旁分泌或內分泌等方式發(fā)揮作用，具有重疊性、多效性、協(xié)同性、 拮抗性等多種生理特性，構成復雜的細胞因子調節(jié)網絡，參與機體多種重要的生理功能。今 年來化學發(fā)光免疫分析成為一種重要的臨床檢測手段，具有靈敏度高及特異性強等優(yōu)點， 對雞細胞因子的體外臨床檢測具有重要的應用價值。
[0004] 目前多組分免疫分析成像技術在免疫分析領域中引起了人們極大地研究興趣。即 在單個分析流程中可以同時或近同時實現(xiàn)多種組分的檢測，極大簡化操作過程，具有分析 通量高、所需時間短、樣品消耗少、分析成本低等顯著優(yōu)勢。通常多組分免疫檢測方法主要 可分為空間分辨和多標記物兩種模式。多標記物模式需要同時從不同標記處檢測不同信 號，因此會因信號干擾而不能準確定量，而且多標記物很難同時達到最優(yōu)條件。很多多標記 技術報道克服這一困難，但因受囿于標記物數(shù)量，對多種蛋白的檢測依然困難。因此一種基 于絲網印刷技術在硅烷化載玻片上印刷了4X12的免疫傳感陣列，與金納米粒子負載HRP標 記抗體信號放大策略結合，利用電感耦合CCD同時檢測不同細胞因子的化學發(fā)光信號，實現(xiàn) 對多種雞細胞因子的檢測，發(fā)展了一種檢測多種雞細胞因子化學發(fā)光成像免疫傳感器的制 備及分析方法

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種檢測多種雞細胞因子化學發(fā)光成像免疫傳感器的制備 及分析方法，其基本思路是：首先借助絲網印刷技術在硅烷化載玻片上印刷了 4X12的陣 列，然后將不同雞細胞因子的捕獲抗體共價鍵合免疫陣列的不同行，牛血清蛋白封閉后制 得多種雞細胞因子同時檢測的化學發(fā)光傳感器，其后在每個微孔中滴入相應的抗原樣品， 再滴入酶標記的相應的金納米粒子信號放大探針，形成捕獲抗體-抗原-酶標抗體三層夾心 免疫復合物，最后通入化學發(fā)光底物，利用電感耦合CCD同時檢測不同雞細胞因子的化學發(fā) 光信號，利用化學發(fā)光信號的增強和抗原濃度直接的線性關系，實現(xiàn)對抗原樣品的檢測。是 一種檢測多種雞細胞因子化學發(fā)光成像免疫分析方法
[0006] 為了達到上述目的，本發(fā)明技術方案如下：
[0007] 本發(fā)明構建了一種檢測多種雞細胞因子化學發(fā)光成像免疫傳感器的制備及分析 方法，其特征在于:在環(huán)氧硅烷化的載體片上制備化學發(fā)光免疫傳感陣列，其中，免疫傳感 陣列的制備是基于絲網印刷技術并借助模板在環(huán)氧硅烷層的載玻片表面制備反應陣列，所 述多種雞細胞因子化學發(fā)光免疫傳感器界面包括帶有氨基的不同雞細胞因子捕獲抗體和 殼聚糖包，括以下步驟：
[0008] 利用絲網印刷技術并借助模板在環(huán)氧硅烷化的載玻片表面制作反應陣列；
[0009] 取不同的雞細胞因子捕獲抗體分別滴涂在免疫陣列的不同行，室溫下反應后，再 放置在4°C下直至晾干，磷酸鹽緩沖溶液沖洗;繼續(xù)滴涂封閉緩沖液在4°C封閉，磷酸鹽緩沖 溶液沖洗后即得到該多種雞細胞因子的免疫傳感器；
[0010] 將不同的雞細胞因子抗原樣品滴入相應的免疫傳感陣列的微孔中，溫育后，再分 別滴入相應的納米金信號放大探針，夾心免疫反應后，通入發(fā)光底物后，利用電感耦合CCD 同時檢測不同細胞因子的化學發(fā)光信號。
[0011] 該免疫傳感陣列能同時檢測多種雞細胞因子，如:雞白介素2(ChIL-2)、雞白介素4 (ChIL-4)、雞γ干擾素(ChIFN-γ )、雞β干擾(ChIFN-β)等，具有高通量、高靈敏檢測多種雞 細胞因子的能力，可應用于禽類疾病的全面快速診斷。
[0012] 本發(fā)明還提供了一種制備檢測多種雞細胞因子化學發(fā)光成像免疫傳感器的方法。 其中，這種免疫傳感器通過簡單的絲網印刷技術在硅烷化載玻片上制作，可拋式陣列包含 48個檢測位點（4排X 12列），該免疫陣列能同時檢測多種細胞因子樣品，具有高通量、高靈 敏檢測多種雞細胞因子的能力，可應用于禽類疾病的全面快速診斷。其中，所采用的載玻片 為玻璃片。
[0013] 制備一種檢測多種雞細胞因子化學發(fā)光成像免疫傳感器的方法包括下述步驟：
[0014] (1)載玻片用水虎魚酸活化，使其表面帶有氨基，用水沖洗并用氮氣吹干后，用含 1 % GPTMS的甲苯溶液在室溫下浸泡過夜，使之硅烷化；
[0015] ⑵制備一層4排X 12列格式48孔的疏水性無光活性膜，形成的孔(活性位點）可以 盛裝免疫反應所需的抗體和試劑；
[0016] (3)將不同的雞細胞因子的捕獲抗體均勻滴在四排環(huán)氧硅烷化的位點，室溫下反 應后，再放置4°C下直至晾干，然后用磷酸緩沖溶液沖洗。
[0017] (4)將作為封閉液的牛血清白蛋白溶液，滴在步驟(3)中得到的載玻片表面，進行 封閉后，用磷酸鹽緩沖溶液沖洗，即得免疫傳感陣列。
[0018] 其中，步驟（1)中，載玻片用水虎魚溶液中￥〇4與30%!12〇2的體積比為7 :3，載玻片 用水虎魚溶液活化12小時;步驟(2)中，所述疏水性無光活性膜借助模板通過絲網印刷技術 印刷在硅烷化處理的載玻片上;所述疏水性無光活性膜內形成的孔直徑2mm，邊緣間距4mm。 如圖1所示，圖中載玻片灰色不過為印刷的具有疏水劑作用的絕緣油漆，白色部分為環(huán)氧硅 烷化的陣列微孔。
[0019] 其中，步驟(3)中可固定的多種雞細胞因子捕獲抗體，如:雞白介素2 (ChIL-2)、雞 白介素4(ChIL-4)、雞γ干擾素(ChIFN-γ )、雞β干擾(ChIFN-β)等，具有高通量、高靈敏檢測 多種雞細胞因子的能力，可應用于禽類疾病的全面快速診斷。
[0020] 其中，步驟(3)中，所述兩種不同雞細胞因子的捕獲抗體的濃度均是50yg/mL;在4 °C溫育過夜。
[0021] 其中，步驟(4)中，所述封閉液為質量分數(shù)為1.0-5.0%牛血清蛋白溶液，在4°C下 進行封閉。
[0022] 本發(fā)明還提供了一種檢測多種雞細胞因子化學發(fā)光成像免疫分析方法，包括如下 分析步驟：
[0023] (a)將不同的雞細胞因子抗原標準液分別用pH 7.4的0.01M PBS溶液稀釋至不同 濃度，加入到免疫傳感陣列的相應排不同的檢測位點，在線溫育；
[0024] (b)用PBST清洗載玻片并吹干后，加入不同雞細胞因子的納米金信號放大探針于 相應位點反應25min，后清洗吹干；
[0025] (c)將化學發(fā)光底物混合液加入檢測點觸發(fā)化學發(fā)光反應，利用電感耦合CCD同時 檢測不同細胞因子的化學發(fā)光信號。
[0026]采用下述分析步驟來驗證其實際應用價值。
[0027] (d)在通過測定回收率來考察本發(fā)明的準確性與實際應用價值?；厥章实臏y定是 通過分別加入0.01、0.02、0.04、0.08、0.1 Ong/mL雞細胞抗原樣品于血清樣品中來測定的。 [0028] 可選地，上述步驟(a)(b)(c)(d)中滴入反應位點的體積為5yL。
[0029] 可選地，上述步驟(b)中，納米金信號放大探針是通過將信號分子辣根過氧化物酶 (HRP)以高摩爾比與分別與不同的雞細胞因子標記抗體共同固定在金納米粒子上制備形成 相應的納米金信號放大探針，以實現(xiàn)信號放大。
[0030] 可選地，上述步驟(b)中酶標記不同細胞因子抗體的濃度均為lOOyg/mL，金納米粒 子濃度2nM。
[0031] 可選地，上述步驟(c)(d)中所得到的CCD照相機所收集的不同細胞因子的化學發(fā) 光信號由分析軟件(AlphaView SA)自動識別，直接讀出每個光斑的化學發(fā)光強度。
[0032]本發(fā)明達到了如下有益效果：
[0033] 本發(fā)明成功的構建了一種檢測多種雞細胞因子化學發(fā)光成像免疫傳感器及分析 方法，該發(fā)明首先借助簡單的絲網印刷技術在硅烷化載玻片上制作化學發(fā)光免疫傳感陣 列，通過載玻片上的環(huán)氧基和捕獲抗體帶有的氨基共價結合，將捕獲抗體修飾在載玻片上。 構建了一種能同時檢測多種雞細胞因子化學發(fā)光成像免疫傳感器。當通入抗原和酶標抗體 后，基于夾心免疫反應，每一個檢測位點捕捉到的HRP會觸發(fā)化學發(fā)光，利用電感耦合CCD同 時檢測不同細胞因子的化學發(fā)光信號，用于多種雞細胞因子的同時檢測。
[0034] (1)本發(fā)明采用絲網印刷技術在載玻片上制的可拋式化學發(fā)光免疫傳感器陣列， 修飾抗體后制得多種雞細胞因子的化學發(fā)光成像免疫傳感器，相比于平行多次單組分分 析，多組分免疫分析方法可以提高檢測通量，縮短檢測時間，減少樣品消耗和檢測成本。 [0035] (2)本發(fā)明利用化學發(fā)光成像免疫分析技術，借助捕獲抗體、抗原和酶標抗體形成 雙抗體夾心復合結構，結合電感耦合CCD檢測不同細胞因子的化學發(fā)光信號，構建了良好的 化學發(fā)光成像免疫分析系統(tǒng)，打破了禽類細胞因子傳統(tǒng)生物檢測法，具有高通量、低成本、 少消耗、易操作且對特定雞細胞因子的聯(lián)合檢測具有高靈敏性。
【附圖說明】
[0036] 圖1 一種檢測多種雞細胞因子化學發(fā)光成像免疫傳感器的制備和免疫分析示意 圖。
[0037] 圖2為本發(fā)明ChIL-4，ChIFN-y標準樣品檢測曲線。
【具體實施方式】
[0038]下面結合具體實施例對本發(fā)明進一步說明 [0039] 實施例1
[0040] -種檢測多種雞細胞因子化學發(fā)光成像免疫傳感器的制備及分析方法，首先采用 絲網印刷技術在硅烷化的載玻片上制作免疫傳感陣列，通過載玻片上的環(huán)氧基可以將帶有 氨基的不同雞細胞因子的捕獲抗體分別固定在不同行。接下來將抗原樣品滴入相應微孔 中，溫育后分別滴入相應的納米金信號放大探針，通過抗原抗體特異性識別形成夾心免疫 反應，通入發(fā)光底物后，傳感器上捕獲的大量酶可以催化發(fā)光，結合電感耦合CCD檢測不同 細胞因子的化學發(fā)光信號，利用化學發(fā)光信號的增強和抗原濃度直接的線性關系，實現(xiàn)對 抗原樣品的檢測。
[0041] 絲網印刷屬于孔版印刷，其原理是：采用紙膜版或其它版的版基上制作出可通過 油墨的孔眼為模版，在印刷時通過一定的壓力使油墨通過孔版的孔眼轉移到承印物紙張、 玻璃、陶瓷等上，形成圖象或文字，在本領域中，使用者都可以根據(jù)使用需求，通過調整模板 中孔眼參數(shù)，設計符合要求的模板。
[0042]本發(fā)明提供了的方法可用于檢測ChIL-4，ChIFN-y，免疫傳感陣列包括了4排X12 列格式共計48個檢測位點，每個位點直徑2111111。〇111^-4,〇11?^丫的捕獲抗體分別固定在不 同行。每一列可以用于同時檢測單個樣品的2種抗原，因此12列可以同時檢測12個樣品各自 所含有的2種細胞因子，可同時檢測24個樣品。其特征在于該ChIL-4，ChIFN-y多種雞細胞 因子化學發(fā)光成像免疫分析方法的實施包括以下步驟：
[0043] (1)將載玻片用水虎魚溶液(H2S〇4/30%H2〇2,7:3體積比）活化12小時使其表面帶 有羥基，用水沖洗并用氮氣吹干后，用GPTMS/甲苯溶液在室溫（25°C)處理過夜，使之硅烷 化。然后依次用甲苯和乙醇沖洗從表面除去物理吸附的硅烷，洗凈后氮氣吹干。
[0044] (2)-層4排X 12列格式48孔的疏水性無光活性膜(直徑2mm，邊緣間距4mm)，借助 模板通過絲網印刷技術印刷在處理過的載玻片上，形成的孔可以盛裝免疫反應所需的抗體 和其它試劑。
[0045] (3)取50yg/mL ChIL-4，ChIFN-y的捕獲抗體分別滴在四排環(huán)氧硅烷化的位點，4 °(：溫育過夜。玻片以沖洗緩沖液沖洗后，氮氣吹干。
[0046] (4)將1.0%牛血清蛋白溶液5yL加至各檢測位點反應過夜封閉未反應的環(huán)氧基。 最后，免疫傳感用沖洗緩沖液清洗，制的該檢測多種雞細胞因子的化學發(fā)光免疫傳感器。 [0047] 實施例2
[0048]對實施例1中所獲得的一種檢測多種雞細胞因子化學發(fā)光傳感器進行成像免疫分 析方法包括：
[0049] 1.制作線性關系的標準曲線
[0050] (1)將5yL ChIL-4和ChIFN-γ不同濃度的標準樣品加入到相應排不同的檢測位 點，在線溫育20-30min，清洗吹干。
[0051 ] (2) 5yL的酶標記的ChIL-4抗體，酶標記的ChIFN- γ抗體分別加入相應位點反應 20_30min，后清洗吹干·
[0052] (3)5yL化學發(fā)光底物混合液加入檢測點觸發(fā)化學發(fā)光反應;這些化學發(fā)光信號可 以同時被CCD照相機收集，動態(tài)積分方式曝光20min，所得到的發(fā)光點則由分析軟件 (AlphaView SA)自動識別，直接讀出每個光斑的化學發(fā)光強度。
[0053] 如圖2所示，測定不同濃度的Ch IL-4和Ch IFN- γ標準樣品，分別制得Ch IL-4和 ChIFN- γ標準樣品的線性曲線。
[0054 ] 2.對樣品進行測定
[0055] 為考察該方法的準確性與實際應用價值，通過分別加入0.01、0.02、0.04、0.08、 0.10ng/mL ChIL-4于血清樣品中來測定其回收率，回收率如表1在96.3%-108%(η = 5)之 間，結果表明該傳感器在實際樣品檢測中具有較好的準確性。
[0056] 表1 ChIL-4蛋白回收率測定
[0057]
[0058]以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，任何熟 悉本專業(yè)的技術人員，在不脫離本發(fā)明技術方案范圍內，依據(jù)本發(fā)明的技術實質，對以上實 施例所作的任何簡單的修改、等同替換與改進等，均仍屬于本發(fā)明技術方案的保護范圍之 內。
【主權項】
1. 一種檢測多種雞細胞因子化學發(fā)光成像免疫傳感器的制備及分析方法，其特征在于 以下步驟： (1) 利用絲網印刷技術并借助模板在環(huán)氧硅烷化的載玻片表面制作反應陣列； (2) 取不同的雞細胞因子捕獲抗體分別滴涂在免疫陣列的不同行，室溫下反應后，再放 置在4°C下直至晾干，磷酸鹽緩沖溶液沖洗;繼續(xù)滴涂封閉緩沖液在4°C封閉，磷酸鹽緩沖溶 液沖洗后即得到該多種雞細胞因子的免疫傳感器； (3) 將不同的雞細胞因子抗原樣品滴入相應的免疫傳感陣列的微孔中，溫育后，再分別 滴入相應的納米金信號放大探針，夾心免疫反應后，通入發(fā)光底物后，利用電感耦合CCD同 時檢測不同細胞因子的化學發(fā)光信號。2. 如權利要求1所述的能同時檢測多種雞細胞因子高通量陣列傳感器的制備和分析方 法，其特征在于，該免疫傳感陣列能同時檢測多種雞細胞因子，如:雞白介素2(ChIL-2)、雞 白介素4(ChIL-4)、雞γ干擾素(ChIFN-γ )、雞β干擾(ChIFN-β)等，具有高通量、高靈敏檢測 多種雞細胞因子的能力，可應用于禽類疾病的全面快速診斷。3. 如權利要求1所述的檢測多種雞細胞因子化學發(fā)光成像免疫傳感器的制備及分析方 法，其特征在于所述納米金信號放大探針是通過將信號分子辣根過氧化物酶(HRP)分別與 不同的雞細胞因子標記抗體共同固定在金納米粒子上制備形成相應的納米金信號放大探 針，以實現(xiàn)信號放大。4. 如權利要求1所述的檢測多種雞細胞因子化學發(fā)光成像免疫傳感器的制備及分析方 法，其特征在于，步驟（1)中，環(huán)氧硅烷化的載玻片通過以下步驟制備:將載玻片在水虎魚酸 中浸泡，7義虎魚酸為H2SO4: Η2〇2 = 7 :3，v/v;再用去離子水充分沖洗后，在氮氣氣氛中吹干； 再將載玻片置于含1%GPTMS的甲苯溶液中，室溫下浸泡，先后用甲苯和無水乙醇沖去物理 吸附的GPTMS并在氮氣氛圍中吹干。5. 如權利要求1所述的檢測多種雞細胞因子化學發(fā)光成像免疫傳感器的制備及分析方 法，其特征在于，步驟(1)中制備的傳感陣列擁有為4 X 12陣列微孔，微孔直徑為2mm，邊緣間 距為4mm 〇6. 如權利要求1所述的檢測多種雞細胞因子化學發(fā)光成像免疫傳感器的制備及分析方 法，其特征在于，步驟(2)中，所固定的不同雞細胞因子的捕獲抗體濃度均為50yg/mL。7. 如權利要求1所述的檢測多種雞細胞因子化學發(fā)光成像免疫傳感器的制備及分析方 法，其特征在于，步驟(2)中，封閉緩沖液為1%-5%牛血清蛋白的磷酸鹽緩沖溶液。8. 如權利要求3所述的檢測多種雞細胞因子化學發(fā)光成像免疫傳感器的制備及分析方 法，其特征在于所述納米金信號放大探針中酶標記不同雞細胞因子抗體的濃度均為l〇〇yg/ mL，金納米粒子濃度2nM。9. 如權利要求1所述的檢測多種雞細胞因子化學發(fā)光成像免疫傳感器的制備及分析方 法，其特征在于，步驟(3)中，滴入抗原樣品后的溫育時間為30min，滴入相應的納米金信號 放大探針后的溫育時間為25min。10. 如權利要求1所述的檢測多種雞細胞因子化學發(fā)光成像免疫傳感器的制備及分析 方法，其特征在于，步驟(3)中所得到的不同雞細胞因子的化學發(fā)光信號由電荷耦合器CCD 收集并通過分析軟件AlphaView SA自動識別，直接讀出每個光斑的化學發(fā)光強度。
【文檔編號】G01N33/552GK105866105SQ201610211811
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月6日
【發(fā)明人】楊占軍, 盧咪咪, 李娟
【申請人】揚州大學