本發(fā)明屬于疾病診斷技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及用于肺癌診斷的多分子標(biāo)志物組合。

背景技術(shù)：

肺癌已連續(xù)多年成為全球人群中癌癥相關(guān)死亡的首要原因，根據(jù)調(diào)查結(jié)果統(tǒng)計(jì)，在2015年中，中國(guó)有73,300例被確診為肺癌，610,200例人群死于肺癌。肺癌的5年生存率大概在17％左右，且近幾年總生存率并沒(méi)有明顯提高。由于缺乏早期診斷肺癌的有效方法，超過(guò)一半的患者在診斷時(shí)已經(jīng)是晚期，因此失去切除的機(jī)會(huì)。

臨床上，對(duì)肺癌的檢測(cè)仍依賴于CT、MR、PET等影像檢測(cè)儀器，但實(shí)際上這些影像手段一般只能發(fā)現(xiàn)1-2cm以上的腫瘤，而腫瘤從病變到生長(zhǎng)至1-2cm，一般要經(jīng)過(guò)2-5年甚至更長(zhǎng)的時(shí)間，因此，癌癥早期漏診率高達(dá)80-90％。目前，早期診斷肺癌的最簡(jiǎn)單的方法是通過(guò)驗(yàn)血尋找腫瘤標(biāo)志物，特別是其中的蛋白標(biāo)志。肺癌中常用的腫瘤標(biāo)志物有神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、癌胚抗原(CEA)、細(xì)胞角蛋白19片段(Cyfra21-1)以及前胃泌素釋放肽(ProGRP)等。

(1)神經(jīng)特異性烯醇化酶(NSE)：烯醇化酶是一種糖酵解酶，普遍存在于哺乳動(dòng)物的組織中，以系列同工酶二聚體的形式存在(αα、αβ、ββ、和γγ)。NSE為含γ亞基的同工酶，存在于神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞和神經(jīng)源性腫瘤中(如小細(xì)胞肺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、腸癌等)。小細(xì)胞肺癌(SCLC)是一種起源于神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的腫瘤，因此NSE與SCLC關(guān)系密切，是小細(xì)胞肺癌的標(biāo)記物。SCLC患者NSE陽(yáng)性率約為60-80％，非小細(xì)胞肺癌患者陽(yáng)性率<20％。因此，NSE有助于SCLC的診斷及其與NSCLC的鑒別診斷。NSE還是肺癌化療效果觀察和隨訪的有效指標(biāo)，對(duì)化療產(chǎn)生反應(yīng)后此酶水平會(huì)下降，病情完全緩解后其可達(dá)正常水平。

(2)細(xì)胞角蛋白19片段(CK19，Cyfra21-1)：Cyfra21-1是分子量約30kDa的上皮細(xì)胞角蛋白的可溶性成分之一，是一種非常好的鑒別肺良惡性疾病的標(biāo)志物，尤其對(duì)肺鱗癌的檢測(cè)效果更好。Cyfra21-1是相對(duì)較新的腫瘤標(biāo)志物，臨床上采用夾心酶聯(lián)免疫吸附法，聯(lián)合應(yīng)用兩種特異性單克隆抗體(ks19.1和bm19.21)檢測(cè)血清中的細(xì)胞角蛋白19片段。Cyfra21-1存在于上皮起源的腫瘤細(xì)胞的胞漿中，當(dāng)腫瘤細(xì)胞壞死后，可釋放到血清中。免疫組織化學(xué)研究表明，肺癌中富含細(xì)胞角蛋白19片段，Cyfra21-1是NSCLC最靈敏的腫瘤標(biāo)志物。因?yàn)镃yfra21-1只代表細(xì)胞角蛋白19一個(gè)片段，因此Cyfra21-1比組織多肽抗原(TPA)具有更高的特異性。研究表明，Cyfra21-1在肺鱗癌中的陽(yáng)性率可高達(dá)80％，而且對(duì)肺癌的診斷有較高的特異性，它在肺良性疾病和健康人群血中的濃度很低，與性別、年齡以及吸煙習(xí)慣無(wú)關(guān)。Cyfra21-1的敏感性與腫瘤的組織學(xué)類型存在著一定的相關(guān)性，如肺鱗癌的敏感性為最高達(dá)76.5％、腺癌為47.8％、小細(xì)胞肺癌僅為42.1％。血清中Cyfra21-1的含量與肺鱗癌患者的病程呈正相關(guān)，根據(jù)肺癌的TNM分期，Ⅰ～Ⅳ期患者的敏感性分別為60.0％、88.8％、80％和100％。

(3)前胃泌素釋放肽(ProGRP)：ProGRP是一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的激素胃泌素釋放肽(GRP)的前體。人類的GRP主要存在于胃腸道、呼吸道以中樞神經(jīng)系統(tǒng)中。一些研究認(rèn)為，小細(xì)胞肺癌的腫瘤細(xì)胞釋放GRP，并且GRP可能會(huì)刺激SCLC細(xì)胞生長(zhǎng)。ProGRP作為SCLC的標(biāo)志物，具有敏感性高(75.5％)、特異性強(qiáng)(97％)的特點(diǎn)。ProGRP水平和治療反應(yīng)也有較好的相關(guān)性，治療后腫瘤完全消失的病人，ProGRP降至正常值范圍，甚至測(cè)不出來(lái)長(zhǎng)達(dá)一個(gè)月以上。國(guó)內(nèi)外的研究表明，ProGRP對(duì)小細(xì)胞肺癌檢測(cè)的敏感性、特異性和可靠性方面均優(yōu)于NSE，敏感性和特異性高，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值在90％以上，對(duì)局限期病變的陽(yáng)性率也比NSE高，一定程度上提高了早期診斷可能性，而且對(duì)化療后反應(yīng)、療效的評(píng)價(jià)、病程中病情監(jiān)測(cè)和預(yù)后判定都提供了有價(jià)值的信息。

(4)癌胚抗原(CEA)：CEA是一種存在于多種腫瘤細(xì)胞中的腫瘤抗原，肺癌細(xì)胞能直接產(chǎn)生CEA。CEA是最早發(fā)現(xiàn)的肺癌腫瘤標(biāo)志物，也是目前肺癌診斷中最具代表性的腫瘤標(biāo)志物，在腺癌與鱗癌中升高較明顯。原發(fā)性肺癌患者血清CEA水平明顯升高，對(duì)肺癌的診斷陽(yáng)性率為40～60％，特別在肺腺癌中，陽(yáng)性率及特異性較高。另外，CEA在肺癌早期的病人中陽(yáng)性率較低，在腫瘤中晚期才有較顯著的升高，因此CEA水平的動(dòng)態(tài)變化能較好的反映患者對(duì)治療的反應(yīng)和預(yù)后。

雖然上述這些腫瘤標(biāo)志物已經(jīng)被應(yīng)用于臨床中肺癌的篩查工作，但是這些生物標(biāo)記的敏感度大約在40-60％，特別是早期癌癥的診斷率很低。肺部腫瘤異質(zhì)性的存在使得肺癌的診斷篩查難度增加，并且當(dāng)腫瘤發(fā)展到不同階段，不同病理分期的時(shí)候，腫瘤標(biāo)志物也會(huì)隨之改變，這也增加了診斷的難度。單一指標(biāo)缺乏準(zhǔn)確性，因此需要多項(xiàng)指標(biāo)共同檢測(cè)，從而提高診斷的特異性以及靈敏度。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供用于肺癌診斷的多分子標(biāo)志物組合，以及在此基礎(chǔ)上制備的用于診斷肺癌的芯片和試劑盒。

在本發(fā)明的第一方面，提供一種蛋白標(biāo)志物組合在制備診斷肺癌的試劑中的用途；所述的蛋白標(biāo)志物組合包括：肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、C反應(yīng)蛋白(CRP)、催乳素(Prolactin)、Wnt誘導(dǎo)信號(hào)通路蛋白1(WISP1)、印記位點(diǎn)結(jié)合因子(BORIS)、CA125、細(xì)胞角蛋白19片段(Cyfra21-1)以及癌胚抗原(CEA)。

在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的肺癌是I～I(xiàn)I期肺癌，或III～I(xiàn)V肺癌。

在另一優(yōu)選例中，所述的診斷肺癌包括：區(qū)分小細(xì)胞肺癌患者(SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)。

在另一優(yōu)選例中，所述的試劑還用于肺癌的治療療效的評(píng)估，較佳地以血清作為樣本。

在另一優(yōu)選例中，所述的試劑是特異性識(shí)別或結(jié)合肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、C反應(yīng)蛋白(CRP)、催乳素(Prolactin)、Wnt誘導(dǎo)信號(hào)通路蛋白1(WISP1)、印記位點(diǎn)結(jié)合因子(BORIS)、CA125、細(xì)胞角蛋白19片段(Cyfra21-1)、癌胚抗原(CEA)的抗體。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于診斷肺癌的芯片，所述的芯片包括：特異性識(shí)別或結(jié)合肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)的抗體、特異性識(shí)別或結(jié)合C反應(yīng)蛋白(CRP)的抗體、特異性識(shí)別或結(jié)合催乳素(Prolactin)的抗體、特異性識(shí)別或結(jié)合WISP1的抗體、特異性識(shí)別或結(jié)合BORIS的抗體、特異性識(shí)別或結(jié)合CA125的抗體、特異性識(shí)別或結(jié)合細(xì)胞角蛋白19片段(Cyfra21-1)的抗體、特異性識(shí)別或結(jié)合癌胚抗原(CEA)的抗體。

在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的芯片是液相芯片，所述的特異性識(shí)別或結(jié)合肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)的抗體、特異性識(shí)別或結(jié)合C反應(yīng)蛋白(CRP)的抗體、特異性識(shí)別或結(jié)合催乳素(Prolactin)的抗體、特異性識(shí)別或結(jié)合WISP1的抗體、特異性識(shí)別或結(jié)合BORIS的抗體、特異性識(shí)別或結(jié)合CA125的抗體、特異性識(shí)別或結(jié)合細(xì)胞角蛋白19片段(Cyfra21-1)的抗體、特異性識(shí)別或結(jié)合癌胚抗原(CEA)的抗體被分別包被于具有特定識(shí)別信號(hào)(如顏色不同或編號(hào)不同)的微球上。

在本發(fā)明的另一方面，提供所述的芯片的用途，用于制備診斷肺癌的試劑盒。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于診斷肺癌的試劑盒，所述試劑盒中包括下組的捕獲抗體：特異性識(shí)別或結(jié)合肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)的抗體、特異性識(shí)別或結(jié)合C反應(yīng)蛋白(CRP)的抗體、特異性識(shí)別或結(jié)合催乳素(Prolactin)的抗體、特異性識(shí)別或結(jié)合WISP1的抗體、特異性識(shí)別或結(jié)合BORIS的抗體、特異性識(shí)別或結(jié)合CA125的抗體、特異性識(shí)別或結(jié)合細(xì)胞角蛋白19片段(Cyfra21-1)的抗體、特異性識(shí)別或結(jié)合癌胚抗原(CEA)的抗體。

在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的抗體是單克隆抗體或多克隆抗體。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于診斷肺癌的試劑盒，所述試劑盒中包括：所述的芯片。

在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的試劑盒中還包括選自下組的至少一種試劑：

(1)質(zhì)控液，

(2)攜帶可檢測(cè)信號(hào)分子的檢測(cè)抗體(如生物素標(biāo)記檢測(cè)抗體)，

(3)顯色劑或熒光標(biāo)記物(如鏈親和素-藻紅蛋白)，

(4)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、C反應(yīng)蛋白(CRP)、催乳素(Prolactin)、Wnt誘導(dǎo)信號(hào)通路蛋白1(WISP1)、印記位點(diǎn)結(jié)合因子(BORIS)、CA125、細(xì)胞角蛋白19片段(Cyfra21-1)以及癌胚抗原(CEA)的標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

本發(fā)明的其它方面由于本文的公開(kāi)內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。

附圖說(shuō)明

圖1、本發(fā)明針對(duì)大樣本量患者及對(duì)照進(jìn)行篩選肺癌標(biāo)志物的測(cè)試、驗(yàn)證的流程示意圖。

圖2、CRP的輸出標(biāo)準(zhǔn)曲線，以及HGF的輸出標(biāo)準(zhǔn)曲線；

上圖：CRP的檢測(cè)曲線；

下圖：HGF的檢測(cè)曲線。

圖3、8種分子標(biāo)志物在肺癌患者和健康對(duì)照血清中表達(dá)情況的散點(diǎn)圖。其中，應(yīng)用的臨床樣本為：804個(gè)肺癌樣本，575個(gè)健康對(duì)照。

圖4、標(biāo)志物的聯(lián)合分析對(duì)于診斷肺癌的臨床意義；

A為在試驗(yàn)組中，8個(gè)標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)的ROC曲線；其中WISP1和BORIS顯著提高ROC曲線下面積；

B為在驗(yàn)證組中，8個(gè)標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)的ROC曲線；其中WISP1和BORIS顯著提高ROC曲線下面積；

C為在試驗(yàn)組中，針對(duì)早期肺癌患者和健康對(duì)照，應(yīng)用本發(fā)明的方法區(qū)分早期肺癌患者和健康對(duì)照；其中I-II表示早期肺癌；III-IV表示中晚期肺癌。

D為在驗(yàn)證組中，針對(duì)早期肺癌患者和健康對(duì)照，應(yīng)用本發(fā)明的方法區(qū)分早期肺癌患者和健康對(duì)照；其中I-II表示早期肺癌；III-IV表示中晚期肺癌。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明人致力于提高肺癌診斷準(zhǔn)確率以及早期診斷的研究，經(jīng)過(guò)深入的研究，揭示了一組肺癌聯(lián)合標(biāo)志物：肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、C反應(yīng)蛋白(CRP)、催乳素(Prolactin)、Wnt誘導(dǎo)信號(hào)通路蛋白1(WISP1)、印記位點(diǎn)結(jié)合因子(BORIS)、CA125、細(xì)胞角蛋白19片段(Cyfra21-1)以及癌胚抗原(CEA)。在肺癌患者的血清中，這些蛋白質(zhì)的表達(dá)顯著高于健康對(duì)照。因此，可應(yīng)用這些標(biāo)志物來(lái)制造可高效診斷肺癌的診斷芯片或診斷試劑盒。這些標(biāo)志物聯(lián)合應(yīng)用于臨床診斷，可以顯著提高診斷肺癌的準(zhǔn)確度，并且能夠檢出肺癌早期患者。

本發(fā)明人收集了大量的臨床病例，篩選肺癌標(biāo)志物，揭示了一組可以高準(zhǔn)確度地檢出與肺癌的標(biāo)志物：肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、C反應(yīng)蛋白、催乳素、WISP1、BORIS、CA125、細(xì)胞角蛋白19片段以及癌胚抗原。聯(lián)合應(yīng)用這些標(biāo)志物，檢出的準(zhǔn)確性顯著高于應(yīng)用單一標(biāo)志物的情形，也顯著高于聯(lián)合應(yīng)用其它多個(gè)標(biāo)志物的情形。并且WISP1、BORIS對(duì)于檢測(cè)的準(zhǔn)確性具有顯著的提高。

WISP1(Genbank：NM_003882.3)是高半胱氨酸蛋白61/結(jié)締組織生長(zhǎng)因子/腎母細(xì)胞瘤過(guò)度表達(dá)基因家族成員之一。WISP1具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、介導(dǎo)細(xì)胞黏附、刺激細(xì)胞轉(zhuǎn)移、促進(jìn)有絲分裂及細(xì)胞外基質(zhì)的形成等生物學(xué)功能。目前已發(fā)現(xiàn)WISP1在不同的腫瘤組織中發(fā)揮正向或負(fù)向調(diào)節(jié)作用，WISP1基因多態(tài)性與肺癌易感性及鉑類藥物化療敏感性有關(guān)，但是其對(duì)肺癌的臨床診斷意義目前還未見(jiàn)報(bào)道。

BORIS(Genbank：AF336042.1)是印記位點(diǎn)結(jié)合因子，最初在睪丸中發(fā)現(xiàn)的DNA結(jié)合蛋白。該蛋白與CCTCC結(jié)合因子(CTCF)同源，含有與CTCF相同的11鋅指DNA識(shí)別結(jié)構(gòu)域。BORIS與DNA的結(jié)合抑制CTCF識(shí)別相同的DNA區(qū)域，但它的N端與C端完全不同于CTCF。因此BORIS可能參與調(diào)控不同的細(xì)胞生物學(xué)事件。

BORIS定位于染色體20ql3區(qū)，研究發(fā)現(xiàn)該區(qū)域在多種腫瘤中發(fā)生擴(kuò)增，導(dǎo)致BORIS表達(dá)異?；钴S，包括乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肝癌、子宮內(nèi)膜癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、結(jié)腸和食管癌以及腎胚細(xì)胞瘤有關(guān)。BORIS在肺癌中的表達(dá)以及臨床意義目前未見(jiàn)報(bào)道。

基于本發(fā)明人的新發(fā)現(xiàn)，可以以肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、C反應(yīng)蛋白、催乳素、WISP1、BORIS、CA125、細(xì)胞角蛋白19片段以及癌胚抗原作為檢測(cè)(確定、鑒定或診斷)肺癌的標(biāo)志物(標(biāo)記物)。通過(guò)分析這些蛋白的表達(dá)情況(包括基因水平上或蛋白水平上)，從而得知受試者的是否罹患肺癌以及肺癌的嚴(yán)重程度，為疾病的診斷或預(yù)后提供依據(jù)，或可早期評(píng)估受試者罹患肺癌的可能性。

可采用各種技術(shù)來(lái)檢測(cè)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、C反應(yīng)蛋白、催乳素、WISP1、BORIS、CA125、細(xì)胞角蛋白19片段以及癌胚抗原的表達(dá)情況，這些技術(shù)均可包含在本發(fā)明中。所述的檢測(cè)可以針對(duì)蛋白，也可針對(duì)相應(yīng)的cDNA，或針對(duì)mRNA?？捎靡延械募夹g(shù)如(但不限于)：Western印跡、SDS-PAGE、原位雜交、酶聯(lián)免疫反應(yīng)、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、Southern印跡、蛋白序列分析、質(zhì)譜分析或DNA序列分析等。

較佳地，本發(fā)明以血清作為待測(cè)樣本(樣品)。

本發(fā)明還提供了用于在分析物中檢測(cè)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、C反應(yīng)蛋白、催乳素、WISP1、BORIS、CA125、細(xì)胞角蛋白19片段以及癌胚抗原的表達(dá)情況的試劑。所述的試劑例如是：特異性識(shí)別或結(jié)合這些蛋白的抗體。利用所述蛋白的特異性抗體來(lái)檢測(cè)所述蛋白的表達(dá)情況以及表達(dá)量，從而可作出判斷。較佳地，還設(shè)置正常的對(duì)照組，以確定所述蛋白在正常動(dòng)物體中的表達(dá)情況。較佳地，所述的特異性抗體上攜帶可識(shí)別信號(hào)，從而可方便、直觀地獲得檢測(cè)結(jié)果。

所述的抗體可以通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、C反應(yīng)蛋白、催乳素、WISP1、BORIS、CA125、細(xì)胞角蛋白19片段以及癌胚抗原，或其具有抗原性的片段，可被施用于動(dòng)物(如家兔，小鼠，大鼠等)以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生，多種佐劑可用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)，包括但不限于弗氏佐劑等。與之相似的，表達(dá)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、C反應(yīng)蛋白、催乳素、WISP1、BORIS、CA125、細(xì)胞角蛋白19片段以及癌胚抗原，或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來(lái)免疫動(dòng)物來(lái)生產(chǎn)抗體。所述的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來(lái)制備(見(jiàn)Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。

本發(fā)明還提供了一種用于診斷肺癌的芯片，所述的芯片包括：特異性識(shí)別或結(jié)合肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的抗體、特異性識(shí)別或結(jié)合C反應(yīng)蛋白的抗體、特異性識(shí)別或結(jié)合催乳素的抗體、特異性識(shí)別或結(jié)合WISP1的抗體、特異性識(shí)別或結(jié)合BORIS的抗體、特異性識(shí)別或結(jié)合CA125的抗體、特異性識(shí)別或結(jié)合細(xì)胞角蛋白19片段的抗體、特異性識(shí)別或結(jié)合癌胚抗原的抗體。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的芯片是液相芯片，較佳地，采用雙抗夾心法結(jié)合液相芯片技術(shù)。雙抗夾心法常規(guī)的做法是將捕獲抗體(又稱為第一抗體或一抗)固定于載體，然后捕獲抗體與蛋白抗原反應(yīng)，洗滌后再與帶標(biāo)記的檢測(cè)抗體(又稱為第二抗體或二抗)反應(yīng)，洗滌，最后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光或酶聯(lián)顯色反應(yīng)檢測(cè)信號(hào)。

本發(fā)明的優(yōu)選方式中，將所述的捕獲抗體固定于攜帶特定可檢測(cè)信號(hào)(分子)的微球上，制備液相蛋白芯片，通過(guò)采用液相蛋白芯片進(jìn)行檢測(cè)的原理是：使單個(gè)微球通過(guò)檢測(cè)通道，并使用兩種激光同時(shí)對(duì)微球上的微球識(shí)別信號(hào)和可檢測(cè)信號(hào)(分子)進(jìn)行檢測(cè)。一種激光激發(fā)的是微球上的微球識(shí)別信號(hào)，根據(jù)微球上的不同種識(shí)別信號(hào)，可以將微球分類，從而將各個(gè)不同的結(jié)合反應(yīng)區(qū)分開(kāi)來(lái)。另一種激光激發(fā)的是可檢測(cè)信號(hào)(分子)，目的是確定微球上結(jié)合的可檢測(cè)信號(hào)的數(shù)量，從而確定微球上結(jié)合的目的分子的數(shù)量。因此，通過(guò)兩種激光的同時(shí)檢測(cè)，可以確定被結(jié)合的檢測(cè)物的種類和數(shù)量。

所述的“微球識(shí)別信號(hào)”是指位于微球上的、用于區(qū)別不同的捕獲抗體的識(shí)別信號(hào)。為了方便起見(jiàn)，對(duì)于固定有同一種捕獲抗體的微球，微球識(shí)別信號(hào)優(yōu)選是相同的。優(yōu)選的，所述的微球識(shí)別信號(hào)是熒光信號(hào)，并且，對(duì)于固定有不同種捕獲抗體的微球，熒光的色彩是不同的，對(duì)于固定有同種捕獲抗體的微球，熒光的色彩優(yōu)選是相同的。

將捕獲抗體固定在微球上的詳細(xì)操作程序可用常規(guī)方法，例如按照Luminex公司的產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)或網(wǎng)站：www.luminexcorp.com中所述的方法進(jìn)行偶連，從而得到不同微球與相應(yīng)捕獲抗體形成的耦連物。

所述的不同的微球是具有不同微球識(shí)別信號(hào)的微球，由于帶有不同的微球識(shí)別信號(hào)，使不同微球之間可被區(qū)分。在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，所述的微球識(shí)別信號(hào)為熒光信號(hào)，并且，微球上的熒光信號(hào)因固定于微球上的相應(yīng)的捕獲抗體的不同而不同。

本發(fā)明所述的微球可以采用聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯等材料制成的。并且，所述的微球的平均直徑可以為1-100μm；更優(yōu)選的，所述的微球的平均直徑可以為2-50μm。

可選用多種可檢測(cè)信號(hào)(分子)來(lái)標(biāo)記所述的檢測(cè)抗體。比如，所述的可檢測(cè)信號(hào)選自：FITC、CY3、CY5、藻藍(lán)蛋白、Alexa Fluor Dyes、BODIPY Dyes、俄勒岡綠染料(Oregon Green Dyes)、得克薩斯紅染料(Texas Red Dye)，或若丹明(Rhodamine)。

對(duì)應(yīng)于可檢測(cè)信號(hào)(分子)的檢測(cè)物質(zhì)為能夠與可檢測(cè)信號(hào)(分子)相結(jié)合并能夠報(bào)告所述結(jié)合的分子(報(bào)告分子)。當(dāng)采用生物素來(lái)標(biāo)記檢測(cè)抗體時(shí)，可采用鏈親和素-藻紅蛋白作為報(bào)告分子。

在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，所述的可檢測(cè)信號(hào)(分子)是生物素，該生物素作為顯示標(biāo)志，當(dāng)與鏈霉菌親和素偶聯(lián)的藻紅蛋白(鏈親和素-藻紅蛋白，又稱為PE標(biāo)記的鏈親和素，SA-R-PE)結(jié)合后，通過(guò)激光激發(fā)產(chǎn)生熒光信號(hào)。生物素的標(biāo)記方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。

為了消除假陽(yáng)性和假陰性，宜在檢測(cè)過(guò)程中設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。此外，為了獲得定量結(jié)果，可以在檢測(cè)過(guò)程中設(shè)置含已知濃度的抗原蛋白(肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、C反應(yīng)蛋白、催乳素、WISP1、BORIS、CA125、細(xì)胞角蛋白19片段以及癌胚抗原)的標(biāo)準(zhǔn)品。對(duì)照或標(biāo)準(zhǔn)品的設(shè)置方法采用常規(guī)的方法。

本發(fā)明還提供了用于在分析物中檢測(cè)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、C反應(yīng)蛋白、催乳素、WISP1、BORIS、CA125、細(xì)胞角蛋白19片段以及癌胚抗原的表達(dá)情況，從而分析肺癌狀況的試劑盒，該試劑盒包括：容器，以及分別位于容器中的特異性識(shí)別結(jié)合肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、C反應(yīng)蛋白、催乳素、WISP1、BORIS、CA125、細(xì)胞角蛋白19片段以及癌胚抗原的抗體?；蛘?，所述的試劑盒包括：前面所述的芯片，特別是液相芯片。

所述的試劑盒中還可包括用于雜交或酶聯(lián)檢測(cè)等所需的其它各種試劑，包括但不限于：質(zhì)控液、標(biāo)準(zhǔn)品、酶、對(duì)照液、顯色液、洗液等。

此外，所述的試劑盒中還可包括使用說(shuō)明書(shū)等，以指導(dǎo)人們按照正確的流程、條件、劑量來(lái)實(shí)施檢測(cè)。

本發(fā)明通過(guò)大樣本量分析，在肺癌患者血清中確定了一組新的分子蛋白，并通過(guò)多家醫(yī)院采集的大樣本分析和測(cè)試，證明該分子標(biāo)志物組合敏感度高，重復(fù)性好且診斷準(zhǔn)確率高，能夠?qū)崿F(xiàn)肺癌的早期診斷?；诖耍_(kāi)發(fā)了通過(guò)分析血清中多種分子標(biāo)志物來(lái)檢測(cè)肺癌的平臺(tái)，可以有效的提高敏感性和特異性。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，液相芯片試劑盒的敏感度高，通過(guò)多個(gè)標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)，大大提高了肺癌早期診斷的準(zhǔn)確率，且檢測(cè)快速，穩(wěn)定性好，能夠?qū)崿F(xiàn)高通量檢測(cè)，且成本低廉。

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，科學(xué)出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

一、實(shí)驗(yàn)方法

1、研究人群

本發(fā)明研究之初，選擇人群的標(biāo)準(zhǔn)為：

1)病理學(xué)診斷為早期肺癌；

2)沒(méi)有進(jìn)行肺癌治療；

3)采樣的血清均在臨床干預(yù)之前；

4)無(wú)其他并發(fā)癥和相關(guān)自身免疫性疾病。

患者收集于2009年4月到2013年9月，來(lái)自杭州市第一人民醫(yī)院，杭州市腫瘤醫(yī)院和浙江省腫瘤醫(yī)院，嘉興第一人民醫(yī)院，溫州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，紹興人民醫(yī)院等6家三甲醫(yī)院。

健康對(duì)照組的血液樣本均來(lái)自于獻(xiàn)血人群，要求不曾患有相關(guān)肺部疾病。年齡和性別的選擇都與患者病例相對(duì)應(yīng)匹配。

研究樣本的采集獲得倫理審查委員會(huì)的批準(zhǔn)。按照委員會(huì)的規(guī)定，所有患者均簽署書(shū)面知情同意書(shū)。臨床資料的收集包括病史、診斷分期、組織學(xué)分期、吸煙狀態(tài)等臨床信息。

2、血清采集

血清樣本均在未經(jīng)任何干預(yù)的情況下收集。首先用離心管收集5ml外周血，采血過(guò)程均按照標(biāo)準(zhǔn)化過(guò)程，血液均不加抗凝試劑。血清分離收集后分裝并儲(chǔ)藏至-80℃。

3、腫瘤生物標(biāo)志物篩選和檢測(cè)

主要試劑：

1)抗體微球：含有分別包被了CRP、Prolactin、HGF、WISP1、BORIS、CA125、Cyfra21-1、CEA捕獲抗體的26#、37#、42#、45#、49#、52#、62#、79#微球；不同種包被微球的濃度均為1.2×10⁴個(gè)/μl。

2)生物素標(biāo)記檢測(cè)抗體：分別用生物素標(biāo)記的CRP、Prolactin、HGF、WISP1、BORIS、CA125、Cyfra21-1、CEA檢測(cè)抗體的混合液；

3)鏈霉親和素-PE；

4)質(zhì)控液(CRP標(biāo)準(zhǔn)蛋白、Prolactin標(biāo)準(zhǔn)蛋白、HGF標(biāo)準(zhǔn)蛋白、WISP1蛋白、BORIS蛋白、CA125標(biāo)準(zhǔn)蛋白、CEA標(biāo)準(zhǔn)蛋白、Cyfra21-1標(biāo)準(zhǔn)蛋白)；

其中，所述的捕獲抗體、檢測(cè)抗體能與其相應(yīng)的肺癌血清標(biāo)志物結(jié)合，所述的鏈霉親和素-PE能與生物素高度結(jié)合，通過(guò)luminex檢測(cè)，以紅色激光激發(fā)微球上的紅色分類熒光，依據(jù)微球的色彩不同確定反應(yīng)類型，以綠色激光激發(fā)藻紅蛋白，測(cè)定微球上結(jié)合的報(bào)告熒光分子的數(shù)量，用于間接確定微球上結(jié)合的肺癌血清標(biāo)志物的含量。

主要步驟：

(一)、液相芯片的制備(每種蛋白包被相應(yīng)的微球，制備方法相同)

1)取微球懸液(磁性微球，bio-rad)，分別渦旋和超聲約20s后，取200ul(約2.5×10⁶個(gè)微球)于干凈離心管(美國(guó)，Axygen)中，標(biāo)記上微球型號(hào)和蛋白名稱；

2)14000g，室溫(約25℃)，4min；小心吸去上清，為減少損失可殘留少量上清；

3)加入100ul ddH₂O，分別渦旋和超聲約20s；

4)14000g，室溫，4min；小心吸去上清，為減少損失可殘留少量上清，加入160ul pH 6.2，0.1M的NaH₂PO₄，分別渦旋和超聲約20s；

5)迅速加入20ul S-NHS，渦旋混勻；

6)迅速加入20ul EDC，分別渦旋和超聲約20s；

7)室溫，避光旋轉(zhuǎn)孵育20min(若發(fā)現(xiàn)微球不呈懸浮狀態(tài)，可每隔10min渦旋一次)；

8)14000g，室溫，4min；小心吸去上清，加入250μL 0.05M MES，pH 5.0，分別渦旋和超聲約20s；

9)14000g，室溫，4min；小心吸去上清，重復(fù)上述洗滌步驟一次；

10)小心吸去上清，用50ul pH 5.0，0.05M的MES重懸微球，分別渦旋和超聲約20s；

11)加25ug捕獲抗體于上述微球中，加入pH 5.0，0.05M的MES至終體積為500ul，分別渦旋和超聲約20s；

12)室溫，避光旋轉(zhuǎn)孵育2h；

13)14000g，室溫，4min；小心吸去上清，加入1mL 0.01％PBST，分別渦旋和超聲約20s；

14)14000g，室溫，4min；小心吸去上清，重復(fù)上述洗滌步驟一次；

15)加入1mL 1％PBSB，分別渦旋和超聲約20s；

16)室溫避光旋轉(zhuǎn)孵育30min，封閉微球表面殘余的活化羧基位點(diǎn)；

17)14000g，室溫，4min；小心吸去上清，加入1mL 1％PBSB，分別渦旋和超聲約20s；

18)小心吸去上清，加入1％PBSB至終體積為200ul，分別渦旋和超聲約20s；

19)取2ul于38ul 1％PBSB中，渦旋20s，超聲20s后，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，最終濃度(個(gè)/mL)＝(4大格總數(shù)/4)×(1×10⁴)×稀釋倍數(shù)；

20)在離心管上標(biāo)記微球濃度、偶連時(shí)間，然后放置4℃避光保存。

(二)、肺癌血清標(biāo)記物的檢測(cè)

使用前先取出液相芯片及相關(guān)試劑，放置平衡至室溫。

-80℃取出肺癌患者和健康人的血清，分別放置在冰上融化后，渦旋混勻，取V型96孔血凝板(96孔板)將血清稀釋20倍，槍頭上下混勻，盡量不產(chǎn)生氣泡。

準(zhǔn)備CRP、Prolactin、HGF、WISP1、BORIS、CA125、CEA、Cyfra21-1標(biāo)準(zhǔn)蛋白。各取8個(gè)EP管分別標(biāo)記上S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8，進(jìn)行2倍系列稀釋，每一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣本稀釋后都要渦旋混勻并更換槍頭，具體如表1。

表1

其中標(biāo)準(zhǔn)蛋白用1％PBSB作為稀釋液，且為2倍稀釋。

取制備好的液相芯片微球混合液，渦旋混勻20s，超聲20s，按每孔2500個(gè)微球加入到1％PBSB中，渦旋混勻20s，超聲20s，終體積為10ul/孔；

立即加入稀釋20倍的血清和系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)物(抗體的不同孔中加入血清或者不同稀釋倍數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)物)，各30ul/孔；

用鋁箔紙包好96孔板，室溫，震蕩孵育反應(yīng)60min；

0.1％PBST洗三次，Run5：MAGX3；

1％PBSB稀釋生物素標(biāo)記檢測(cè)抗體，50ul/孔；

用鋁箔紙包好96孔板，室溫，震蕩孵育反應(yīng)60min；

0.1％PBST洗三次，各種抗體的濃度均為0.1ug/ml，Run5：MAGX3；

1％PBSB稀釋鏈霉親和素-藻紅蛋白(1：500)，50ul/孔；

用鋁箔紙包好96孔板，室溫，震蕩孵育反應(yīng)60min；

0.1％PBST洗三次，Run5：MAGX3；

100ul/孔的1％PBSB重懸微球，室溫，震蕩3-5min；

于Luminex系列液相芯片分析儀上讀取結(jié)果，儀器可自動(dòng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算出待測(cè)樣本的測(cè)量值。

(三)結(jié)果分析

以CRP、HGF為例，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，CRP、HGF標(biāo)準(zhǔn)物的預(yù)測(cè)濃度、實(shí)測(cè)濃度和MFI值參見(jiàn)表2，CRP、HGF的檢測(cè)曲線如圖2所示；其中CRP的檢測(cè)曲線為圖2上圖，HGF的檢測(cè)曲線為圖2下圖。

表2、標(biāo)準(zhǔn)蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線

CRP和HGF的輸出標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2。

針對(duì)其它候選標(biāo)志物的標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作和分析與上述類似。

4、統(tǒng)計(jì)分析

健康人群和肺癌患者中不同的分子標(biāo)記物利用Mann-Whitney U進(jìn)行分析。

分子標(biāo)記物和臨床病例的關(guān)系通過(guò)方差進(jìn)行分析。

ROC曲線用來(lái)評(píng)價(jià)標(biāo)志物的敏感性和特異性。

生物標(biāo)記物的準(zhǔn)確性利用邏輯回歸進(jìn)行評(píng)估。

二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)施例1、標(biāo)志物的篩選

本發(fā)明人共收集了804例患者，其中試驗(yàn)組543例，驗(yàn)證組261例。健康組共有575例，其中試驗(yàn)組301例，驗(yàn)證組274例。另外，還包括70例其他良性肺部疾病，以及80例肺部小結(jié)節(jié)病人。

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，健康組和實(shí)驗(yàn)病例(試驗(yàn)組，驗(yàn)證組)組的患者在性別、吸煙狀態(tài)、年齡等因素上無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

受試者的臨床病例特點(diǎn)總結(jié)于表3中。

表3

P值為χ²檢驗(yàn).

實(shí)施例2、肺癌相關(guān)分子標(biāo)記物的篩選以及驗(yàn)證

本發(fā)明中，進(jìn)行肺癌標(biāo)志物的篩選流程如圖1。

本實(shí)施例的目的是篩選出可以區(qū)分健康者和肺癌患者的分子標(biāo)志物。將肺癌患者的血清樣本與健康者的血清樣本中表達(dá)的蛋白進(jìn)行大規(guī)模的比較，以期篩選出肺癌相關(guān)分子標(biāo)記物。

經(jīng)過(guò)大樣本量分析篩選，結(jié)果，本發(fā)明人共篩選出8個(gè)蛋白，其在肺癌患者中高表達(dá)，并且可以較好地將健康人群和肺癌患者區(qū)分出來(lái)，包括：C反應(yīng)蛋白(CRP)、催乳素(Prolactin)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、CEA、WIPS1、Cyfra21-1、CA125、BORIS(P＜0.01)。如圖3。

因此，本發(fā)明人共發(fā)現(xiàn)了8個(gè)有效的分子標(biāo)志物。

實(shí)施例3、診斷模型的建立以及ROC分析

本發(fā)明人進(jìn)一步利用邏輯回歸分析了8個(gè)標(biāo)記物對(duì)于肺癌的篩選和診斷的臨床價(jià)值。在試驗(yàn)組中，8個(gè)標(biāo)志物(8-markers)的聯(lián)合檢測(cè)準(zhǔn)確性達(dá)到了0.91(95％可信區(qū)間為0.89-0.93，其中敏感性為81.9％、特異性為83.7％)。在驗(yàn)證組中，聯(lián)合檢測(cè)準(zhǔn)確性達(dá)到了0.93(95％可信區(qū)間為0.91-0.95，其中敏感性為80.8％、特異性為90.5％)，如圖4。

為了探索該模型對(duì)于早期肺癌診斷的能力，本發(fā)明人在804例肺癌患者選取了171例早期肺癌患者，發(fā)現(xiàn)該方法可以顯著區(qū)分早期肺癌患者和健康對(duì)照(圖4)。

同樣的，該方法可以區(qū)分小細(xì)胞肺癌患者和非小細(xì)胞肺癌患者。具體的分析情況見(jiàn)表4。

表4

HC＝健康對(duì)照LC＝肺癌.SCLC＝小細(xì)胞肺癌.NSCLC＝非小細(xì)胞肺癌.

實(shí)施例4、WISP1以及BORIS作為標(biāo)記物的作用

通過(guò)本次大樣本量的篩選，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)全新的肺癌標(biāo)志物WISP1以及BORIS。

本發(fā)明人將8分子指標(biāo)中各分子的權(quán)重進(jìn)行分析表明，8分子指標(biāo)(8-Marker)中每一個(gè)分子均有利于提高檢測(cè)的準(zhǔn)確度。其中，WISP1以及BORIS對(duì)該診斷模型的貢獻(xiàn)非常顯著。以6分子指標(biāo)(6-marker：CRP、Prolactin、HGF、CA125、CEA、Cyfra21-1)與8分子指標(biāo)(8-marker：CRP、Prolactin、HGF、WISP1、BORIS、CA125、CEA、Cyfra21-1)分別檢測(cè)的檢測(cè)準(zhǔn)確度來(lái)評(píng)判，在試驗(yàn)組中，8分子指標(biāo)的檢測(cè)準(zhǔn)確度0.91(95％可信區(qū)間為0.89-0.93)；而若是去掉WISP1以及BORIS的6分子聯(lián)合檢測(cè)，其準(zhǔn)確度只有0.83(95％可信區(qū)間為0.80-0.89)。該準(zhǔn)確度的區(qū)別非常顯著(p<0.01)。同樣地，在驗(yàn)證組中，8分子指標(biāo)的檢測(cè)準(zhǔn)確度也顯著高于6分子標(biāo)志物，如圖4。

因此可見(jiàn)，8分子聯(lián)合應(yīng)用具有良好的診斷準(zhǔn)確性，其中WISP1以及BORIS作為標(biāo)記物對(duì)于檢測(cè)的準(zhǔn)確性非常關(guān)鍵。

實(shí)施例5、制備檢測(cè)試劑盒及臨床應(yīng)用

1、制備臨床用的檢測(cè)試劑盒

如前所述，制備8種抗體微球，分別包被了CRP、Prolactin、HGF、WISP1、BORIS、CA125、Cyfra21-1、CEA捕獲抗體的26#、37#、42#、45#、49#、52#、62#、79#微球。

將上述抗體微球分別置于不同的容器中，置于試劑盒中。同時(shí)，將生物素標(biāo)記的CRP、Prolactin、HGF、WISP1、BORIS、CA125、Cyfra21-1、CEA檢測(cè)抗體的混合液分別置于不同的容器中，置于試劑盒中。同時(shí)，將鏈霉親和素-PE液置于試劑盒中。

從而，獲得包含有應(yīng)用于臨床檢測(cè)的主要試劑的試劑盒，可直接應(yīng)用于臨床檢測(cè)。

2、臨床應(yīng)用

獲得2位臨床疑似患者的血清樣本，應(yīng)用所述的試劑盒，如前所述進(jìn)行CRP、Prolactin、HGF、WISP1、BORIS、CA125、Cyfra21-1、CEA的檢測(cè)。結(jié)果如下：

1位疑似患者測(cè)得結(jié)果：CRP表達(dá)20.39μg/ml、Prolactin表達(dá)2.56ng/ml、HGF表達(dá)0.76ng/ml、WISP1表達(dá)4.23ng/ml、BORIS表達(dá)2.49ngml、CA125表達(dá)4.83ng/ml、Cyfra21-1表達(dá)15.67ng/ml、CEA表達(dá)7.27ng/ml；利用這8個(gè)指標(biāo)分析發(fā)現(xiàn)該患者是肺癌可能性大于90％。進(jìn)一步臨床CT以及病理學(xué)確證該患者為肺癌早期。

另1位疑似患者測(cè)得結(jié)果：CRP表達(dá)0.12μg/ml、Prolactin表達(dá)0.67ng/ml、HGF表達(dá)0.19ng/ml、WISP1表達(dá)3.51ng/ml、BORIS表達(dá)1.01ng/ml、CA125表達(dá)0.43ng/ml、Cyfra21-1表達(dá)1.48ng/ml、CEA表達(dá)2.21ng/ml；利用這8個(gè)指標(biāo)分析發(fā)現(xiàn)該患者是肺癌可能性為9.8％。進(jìn)一步病理學(xué)發(fā)現(xiàn)該患者為良性肺部小結(jié)節(jié)。

在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。