本發(fā)明屬于化學分析領域，具體涉及一種雨生紅球藻提取物中蝦青素的分離檢測方法。

背景技術(shù)：

蝦青素是一種氧化型類胡蘿卜素，天然來源有雨生紅球藻，酵母真菌，蝦殼和蟹殼，蝦青素也是一種酮式類胡蘿卜素，有與其他類胡蘿卜素一樣很長的共軛雙鍵，在末端有不飽和的酮基和羥基，羥基和酮基構(gòu)成α-羥基酮，天然產(chǎn)物多以酯的形式存在。

蝦青素在抗氧化，抗炎，提高免疫力，改善視力，降低血脂膽固醇等方面有益處，它能有效清除自由基，并抑制自由基的產(chǎn)生，避免細胞受到損傷，天然蝦青素也是一種超強的抗氧化劑，在類胡蘿卜素家族中有獨特的優(yōu)勢，淬滅單線態(tài)氧，結(jié)束過氧化鏈式反應，保護細胞免受氧化反應傷害，被譽為“超級維生素E”、“超級抗氧化劑”。

目前蝦青素的檢測方法主要有：

一、分光光度法：

夏三年等用紫外分光光度計檢測蝦青素的含量中：前處理方法為：用含醋酸的DMSO溶解樣品，定量方法為：在492nm波長下測定吸光度，并通過消光系數(shù)計算蝦青素的含量。該方法的不足之處在于：該波長范圍內(nèi)測量總類胡蘿卜素的含量，造成檢測結(jié)果偏高。

二、高效薄層色譜法：

黃萌等在南極磷蝦蝦青素的提取與純化研究中，用薄層色譜法對蝦青素分離純化和含量分析，前處理方法為：用正己烷和丙酮溶解萃取樣品，并進行皂化，定量方法為：外標法得到工作曲線，并計算蝦青素的含量。該方法的不足之處在于：皂化相對于酶解，操作復雜，轉(zhuǎn)化效率不高。

三、高效液相色譜法：

肖冬光等用高效液相色譜法檢測紅發(fā)夫酵母胞內(nèi)的蝦青素含量，該方法前處理為：用丙酮溶解提取樣品，甲醇和乙腈作為洗脫液進行上機分離，定量方法為：外標法制作工作曲線，并計算蝦青素的含量，該方法的不足之處為：未經(jīng)過酶解，造成檢測樣品中蝦青素的含量偏低，采用反相系統(tǒng)的上機條件，未能將各平面異構(gòu)體分出。

余孔捷等用高效液相色譜法測定動物源性食品如肉蛋奶動物內(nèi)臟中的蝦青素。該方法前處理為：用乙腈和正己烷溶解萃取樣品，反相系統(tǒng)上機條件，外標法制作工作曲線，并計算蝦青素的含量，該方法的不足之處為：未經(jīng)過酶解，造成檢測樣品中蝦青素的含量偏低，采用反相系統(tǒng)的上機條件，出峰時間偏長。

陳晉明等用反相高效液相色譜檢測雨生紅球藻粉的蝦青素含量，該方法前處理為：用甲醇和二氯甲烷溶解提取樣品，反相系統(tǒng)上機條件，外標法制作工作曲線，并計算蝦青素的含量，該方法的不足之處為：未經(jīng)過酶解，造成檢測樣品中蝦青素的含量偏低，采用反相系統(tǒng)的上機條件，未能將各平面異構(gòu)體分出。

在中國專利CN 103630626 A中，采用C18柱，流動相為二氯甲烷，甲醇，乙腈和水等反相上機條件，梯度洗脫，對上機條件要求較高，基線不易走穩(wěn)，未采用酶解，造成計算蝦青素的含量偏低，未能將各平面異構(gòu)體分開。

綜合分析現(xiàn)有的蝦青素檢測方法中，分光光度的方法，在最大吸收波長范圍內(nèi)還包括其他類胡蘿卜素的物質(zhì)，會造成檢測結(jié)果偏高，薄層色譜的方法，操作相對較為繁瑣，而大部分的檢測方法為高效液相方法為主，提取試劑多為有機試劑，乙腈，甲醇，丙酮，氯仿等，前處理步驟需要將酯化蝦青素轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x蝦青素，很多前處理用皂化的方式進行，皂化的時間長，轉(zhuǎn)化的效率不高；有的沒有采用將酯化蝦青素轉(zhuǎn)化為游離蝦青素的步驟，會造成蝦青素檢測含量的降低。在上機條件上大多數(shù)多采用乙腈(水)、甲醇等極性較高的溶液作為洗脫液，親水性溶劑與蝦青素的互溶性不高，提取率不高，反相系統(tǒng)洗脫時多采用梯度洗脫，對上機條件有較高的要求，基線不易走穩(wěn)，對定量會有一定的影響，目標峰的洗脫出峰時間多在15-30分鐘，出峰時間較長，不利于批量檢測含量，峰的分離度不高，不能把蝦青素的各種平面異構(gòu)體分離出來，其平面異構(gòu)體包括：反式蝦青素(trans astaxanthin)，雙順式蝦青素#1(Di-cisastaxanthin#1)，雙順式蝦青素#2(Di-cis astaxanthin#2)，9-順式蝦青素(9-cis astaxanthin)，13-順式蝦青素(13-cis astaxanthin)，15-順式蝦青素(15-cis astaxanthin)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對上述問題，本發(fā)明旨在提供一種快速簡單、準確度高、分離度高的雨生紅球藻中蝦青素的分離檢測方法。

本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下：

一種雨生紅球藻提取物中蝦青素的分離檢測方法，包括以下步驟：

步驟一，雨生紅球藻提取物中類胡蘿卜素的提?。喊凑沼晟t球藻提取物與丙酮質(zhì)量體積比1：20-200的比例將兩者混合均勻，離心去沉淀，留取上清液；

步驟二，類胡蘿卜素的酶解：向步驟一中的上清液中加入終濃度0.01-0.1M pH7.0的Tris-HCl緩沖液，混勻后加入膽固醇酯酶，加入量為20-350U/mg提取物，37℃酶解30-60分鐘；酶解完后向酶解液中加入0.5-2g無水硫酸鈉除水和1-2ml石油醚萃取，離心，收集石油醚層；重復萃取步驟，直至萃取完全，合并石油醚層，用氮氣或惰性氣體吹干，加入洗脫液溶解，并定容至與被酶解的上清液體積相同，得到待測液；所述洗脫液為正己烷與丙酮的混合液，正己烷：丙酮體積比＝75％:25％-90％:10％；

步驟三，正相高效液相分析法分離檢測蝦青素：液相上機條件為：檢測波長在474nm，色譜柱為Luna 3μSilica(2)，色譜柱溫度20-25℃，流速1-1.2ml/分鐘，流動相為正己烷：丙酮體積比＝75％:25％-90％:10％，等度洗脫；

分別運行樣品：反式蝦青素標準溶液，待測液；

運行反式蝦青素標準溶液后，計算峰值面積P_STA；

運行待測液后，分別計算雙順式蝦青素#1的峰值面積P_DCA1，雙順式蝦青素#2的峰值面積P_DCA2，反蝦青素的峰值面積P_TA，9-順式蝦青素的峰值面積P_9CA，13-順式蝦青素的峰值面積P_13CA，15-順式蝦青素的峰值面積P_15CA；

蝦青素的峰值面積率PAR_AX為：

PAR_AX＝(P_DCA1+P_DCA2+P_TA+1.133×P_9CA+1.60×P_13CA+P_15CA)÷P_STA

蝦青素含量百分比AXP為：

AXP＝(PAR_AX×C_STA×D×100)÷W

式中，C_STA為反式蝦青素標準溶液的濃度，W為步驟一中雨生紅球藻提取物的重量，D為步驟一中溶解雨生紅球藻提取物所用丙酮的體積。

所述雨生紅球藻提取物為雨生紅球藻來源的蝦青素油酯或蝦青素膠囊或雨生紅球藻破壁后的產(chǎn)物。

進一步地，所述方法中還可以增加分光光度法的步驟，以與高效液相色譜法的含量檢測做相互驗證，具體方法為：用分光光度計檢測步驟一上清液在474nm波長下的吸光度值A，計算類胡蘿卜素總量W_{類胡蘿卜素}和蝦青素百分比含量AXP；

W_{類胡蘿卜素}＝A×D/210，其中210為蝦青素在丙酮中的消光系數(shù)；

AXP＝W_{類胡蘿卜素}×85％/W，其中85％是全部類胡蘿卜素中的蝦青素含量百分數(shù)。

進一步地，所述方法中還可以增加計算回收率的步驟以驗證方法的可行性，具體方法為：

(1)稱取2mg反式-β-阿林胡蘿卜醛標準品，用3ml二氯甲烷溶解后，用丙酮定容到100ml，取其中1ml用洗脫液定容到10ml，此為反式-β-阿林胡蘿卜醛標準溶液，在上述步驟一的上清液中加入50μl反式-β-阿林胡蘿卜醛標準溶液，按蝦青素含量檢測的步驟依次往下進行至液相上機待測，此為待測液。

(2)反式-β-阿林胡蘿卜醛標準溶液在458nm檢測，計算峰值面積P_IS；

(3)待測液在458nm檢測，計算反式-β-阿林胡蘿卜醛的峰值面積P_ISS，并計算內(nèi)部標準的回收率PR_IS＝(PISS×100)÷P_IS；

進一步地，各步驟中的所有檢測均設置數(shù)個平行實驗，結(jié)果取平均值。

進一步地，步驟一中雨生紅球藻提取物在丙酮中的終濃度通過數(shù)次稀釋完成，一是避免體積過大，二是濃度更精確。

進一步地，步驟一中所述離心轉(zhuǎn)速為3800-4200轉(zhuǎn)/分鐘，時間2-5分鐘。

進一步地，步驟二中所述離心轉(zhuǎn)速為3800-4200轉(zhuǎn)/分鐘，時間0.5-1分鐘。

進一步地，步驟三中色譜柱配備色譜防護裝置。

進一步地，步驟三中反式蝦青素標準溶液的制備方法為：用洗脫液將反式蝦青素標準品稀釋成濃度為0.001-0.01mg/ml的標準溶液。

相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的方法具有以下優(yōu)勢：

(1)前處理效率高，提取試劑丙酮與蝦青素的互溶性好，酶解相對于皂化時間短，效率高。

(2)高效液相色譜上機條件好：等度洗脫，基線更易平穩(wěn)，峰形好，分離度高，可以分離更多的同分異構(gòu)體。

(3)出峰時間短，不易受外界光熱影響，更適合大批量檢測。

附圖說明

圖1實施例1回收率反式-β-阿林胡蘿卜醛標準溶液的正相色譜圖；

圖2實施例1待測液的正向高效液相色譜圖(458nm)；

圖3實施例1反式蝦青素標準溶液的正向高效液相色譜圖；

圖4實施例1待測液的正向高效液相色譜圖(474nm)；

圖5實施例2反式蝦青素標準溶液的正向高效液相色譜圖；

圖6實施例2待測液的正向高效液相色譜圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例及附圖對本發(fā)明做進一步詳細說明。

實施例1蝦青素油脂中蝦青素的分離檢測

反式-β-阿林胡蘿卜醛標準溶液的制備：稱取2mg反式-β-阿林胡蘿卜醛標準品，用3ml二氯甲烷溶解后，用丙酮定容到100ml，取其中1ml用洗脫液(正己烷：丙酮體積比＝82:18)定容到10ml，得到反式-β-阿林胡蘿卜醛標準溶液。

反式蝦青素標準溶液的制備：用洗脫液(正己烷：丙酮體積比＝82:18)將反式蝦青素標準品稀釋成濃度為0.00349mg/ml的標準溶液。

步驟一，蝦青素油脂中類胡蘿卜素的提取：

(1)精確稱量33.8mg蝦青素油脂至容量瓶中，加入丙酮定容至100ml，混勻后，4000rpm離心3min去沉淀，留取上清液，為第一次稀釋液。吸取1ml第一次稀釋液，用丙酮定容至10ml，得到提取液。本步驟中溶解33.8mg蝦青素油脂至上機濃度應用丙酮體積為1000ml(D)。

(2)用分光光度計檢測提取液在474nm波長下的吸光度值A＝0.4592，計算類胡蘿卜素總量W_{類胡蘿卜素}和蝦青素百分比含量AXP；

W_{類胡蘿卜素}＝A×D/210

AXP＝W_{類胡蘿卜素}×85％/W＝(A×D/210)×85％/W＝5.50％。

步驟二，類胡蘿卜素的酶解：

移取3ml提取液，加入50μl反式-β-阿林胡蘿卜醛標準溶液，加入2ml 0.05M的Tris-HCl緩沖液(pH7.0)，混勻后加入3U/ml的膽固醇酯酶1ml，37℃酶解40分鐘；酶解完后向酶解液中加入1g無水硫酸鈉和2ml石油醚萃取，4000rpm離心30秒，收集石油醚層；重復萃取步驟，直至水層無色，萃取完全，合并石油醚層，用氮氣吹干，加入洗脫液(正己烷：丙酮體積比＝82:18)溶解，并定容至3ml，得到待測液。

步驟三，正相高效液相分析法分離檢測蝦青素：

液相上機條件為：檢測波長在474nm或458nm，色譜柱為Luna 3μSilica(2)，100A 150×4.60mm Phenomenex(貨號P/N 00F-4162-E0)，帶色譜防護裝置(Phenomenex貨號P/N AJO 4348&KJO 4282)，色譜柱溫度25℃，固定流速1.2ml/分鐘，注射量1.2μl，流動相為正己烷：丙酮體積比＝82:18，等度洗脫；

分別運行樣品：反式-β-阿林胡蘿卜醛標準溶液(檢測波長在458nm)，待測液(檢測波長在458nm)，反式蝦青素標準溶液(檢測波長在474nm)，待測液(檢測波長在474nm)，色譜圖分別見圖1、2、3、4；

圖4所示，待測液中各蝦青素平面異構(gòu)體的出峰時間分別為：

可見，本實施例組份的出峰時間非常快，5.03分鐘時就已經(jīng)出峰，7.01分鐘時所有蝦青素的平面異構(gòu)體均出峰完畢。運行一次樣品僅需10分鐘，特別適用于大批量檢測，能有效提高檢測效率。且從圖中可以看出，各峰之間無重疊，分離度極高。

運行反式-β-阿林胡蘿卜醛標準溶液后，計算峰值面積P_IS＝113954

運行反式蝦青素標準溶液后，計算峰值面積P_STA＝772789；

474nm運行待測液后，分別計算雙順式蝦青素#1的峰值面積P_DCA1＝4507，雙順式蝦青素#2的峰值面積P_DCA2＝4691，反蝦青素的峰值面積P_TA＝300667，9-順式蝦青素的峰值面積P_9CA＝47002，13-順式蝦青素的峰值面積P_13CA＝24080，15-順式蝦青素的峰值面積P_15CA＝3904；458nm運行待測液后，反式-β-阿林胡蘿卜醛的峰值面積P_ISS＝112751；

蝦青素的峰值面積率PAR_AX為：

PAR_AX＝(P_DCA1+P_DCA2+P_TA+1.133×P_9CA+1.60×P_13CA+P_15CA)÷P_STA＝0.5289

蝦青素含量百分比AXP為：

AXP＝(PAR_AX×C_STA×D×100)÷W＝0.5289×0.00349×1000×100÷33.8＝5.46％

計算內(nèi)部標準的回收率PR_IS＝(P_ISS×100)÷P_IS＝98.9％。

回收率在90％-110％之間表明本發(fā)明方法具有可行性，分光光度結(jié)果比高效液相結(jié)果偏高表明正相高效液相的結(jié)果較之分光光度更加準確，同時也可將分光光度作為液相結(jié)果的先期驗證。

實施例2蝦青素膠囊中蝦青素的分離檢測

步驟一，蝦青素膠囊中類胡蘿卜素的提?。?/p>

(1)精確稱量500mg蝦青素膠囊內(nèi)容物至容量瓶中，加入丙酮定容至100ml，混勻后，4200rpm離心2min去沉淀，留取上清液，為第一次稀釋液。吸取0.5ml第一次稀釋液，用丙酮定容至10ml，得到提取液。本步驟中溶解500mg蝦青素膠囊內(nèi)容物至上機濃度應用丙酮體積為2000ml(D)。

(2)用分光光度計檢測提取液在474nm波長下的吸光度值A＝1.6256，計算類胡蘿卜素總量W_{類胡蘿卜素}和蝦青素含量W_蝦青素；

W_{類胡蘿卜素}＝A×D/210

W_蝦青素＝W_{類胡蘿卜素}×85％＝(A×D/210)×85％＝13.16mg。

步驟二，類胡蘿卜素的酶解：

移取3ml提取液，加入2ml 0.05M的Tris-HCl緩沖液(pH7.0)，混勻后加入3U/ml的膽固醇酯酶1ml，37℃酶解40分鐘；酶解完后向酶解液中加入2g無水硫酸鈉和1.5ml石油醚萃取，4200rpm離心30秒，收集石油醚層；重復萃取步驟，直至水層無色，萃取完全，合并石油醚層，用氮氣吹干，加入洗脫液(正己烷：丙酮體積比＝90:10)溶解，并定容至3ml，得到待測液。

步驟三，正相高效液相分析法分離檢測蝦青素：

液相上機條件為：檢測波長在474nm，色譜柱為Luna 3μSilica(2)，100A 150×4.60mmPhenomenex(貨號P/N 00F-4162-E0)，帶色譜防護裝置(Phenomenex貨號P/N AJO 4348&KJO4282)，色譜柱溫度25℃，固定流速1ml/分鐘，注射量20μl，流動相為正己烷：丙酮體積比＝90:10，等度洗脫；

制備反式蝦青素標準溶液：用洗脫液(正己烷：丙酮體積比＝90:10)將反式蝦青素標準品稀釋成濃度為0.00484mg/ml的標準溶液。

474nm運行反式蝦青素標準溶液，出峰時間7.108分鐘，如圖5所示，計算峰值面積P_STA＝1295.9；

474nm運行待測液，如圖6所示，分別計算雙順式蝦青素#1的峰值面積P_DCA1＝24.2(出峰時間6.582分鐘)，雙順式蝦青素#2的峰值面積P_DCA2＝23.6(出峰時間6.855分鐘)，反蝦青素的峰值面積P_TA＝1211.7(出峰時間7.175分鐘)，9-順式蝦青素的峰值面積P_9CA＝239.1(出峰時間8.247分鐘)，13-順式蝦青素的峰值面積P_13CA＝115.3(出峰時間8.683分鐘)，15-順式蝦青素的峰值面積P_15CA＝15.4(出峰時間9.196分鐘)。

蝦青素的峰值面積率PAR_AX為：

PAR_AX＝(P_DCA1+P_DCA2+P_TA+1.133×P_9CA+1.60×P_13CA+P_15CA)÷P_STA＝1.335

蝦青素重量W_蝦青素為：

W_蝦青素＝PAR_AX×C_STA×D＝1.335×0.00484×2000＝12.91mg

分光光度結(jié)果比高效液相結(jié)果偏高，表明正相高效液相的結(jié)果較之分光光度更加準確，同時也可將分光光度作為液相結(jié)果的先期驗證。