本發(fā)明涉及食藥用菌分析檢測領(lǐng)域，具體涉及一種檢測羊肚菌中核苷類成分的方法，特別地是利用HPLC檢測羊肚菌中鳥苷、尿苷和腺苷3種核苷類成分。

背景技術(shù)：

羊肚菌(Morchella esculenta)，是一種名貴的食藥用真菌。傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為羊肚菌性平，味甘寒，無毒，具有消化助食、益腸胃、化痰理氣、補(bǔ)腎、壯陽、提神醒腦之功能，有較高的藥食用價值以及廣闊的開發(fā)前景。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，羊肚菌子實(shí)體中含有豐富的蛋白質(zhì)、核苷、脂肪酸、碳酸化合物、生物素、粗纖維等營養(yǎng)成分。但是，據(jù)調(diào)查，目前對羊肚菌活性成分的深入研究主要集中在對多糖的研究，而對羊肚菌中所含核苷類成分的檢測鮮見報道。前期很多學(xué)者對藥食用真菌中所含有的核苷類成分進(jìn)行了深入研究，并發(fā)現(xiàn)核苷類成分具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)、提高免疫力、促進(jìn)血液循環(huán)等藥理作用?？梢姡蚨蔷泻塑疹惓煞值臋z測對羊肚菌進(jìn)行全面質(zhì)量控制是非常重要的。

目前，尚未有關(guān)于羊肚菌中核苷類成分含量檢測的報道。關(guān)于核苷類成分的分析檢測在同類珍稀藥食用菌中有較多的研究，被廣泛作為真菌藥材的質(zhì)量和品質(zhì)評價指標(biāo)。如2015版《中國藥典》冬蟲夏草質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)以腺苷含量作為唯一的化學(xué)成分控制指標(biāo)。也有較多文獻(xiàn)對藥食用真菌中核苷類成分進(jìn)行了研究，但文獻(xiàn)報道的檢測核苷類成分的方法都不能直接應(yīng)用于羊肚菌中核苷的檢測，如將2015版《中國藥典》中百令膠囊腺苷和尿苷的高效液相色譜測定方法直接應(yīng)用于羊肚菌3種核苷類成分檢測存在峰形不對稱，基線漂移等問題；《高效液相色譜定量分析比較4種蟲草藥材的核苷類成分》采用0.5％磷酸溶液提取核苷類成分并測定了4種蟲草類藥材的尿苷、肌苷、鳥苷和腺苷含量，但是將該提取方法用于提取羊肚菌中的核苷類成分結(jié)果發(fā)現(xiàn)核苷含量非常低。其他很多文獻(xiàn)采用的10％甲醇提取方法應(yīng)用于羊肚菌核苷提取也存在含量很低的問題。同時，發(fā)明人在大量的實(shí)驗(yàn)研究過程中發(fā)現(xiàn)，上述分析檢測方法進(jìn)行方法學(xué)考察的過程中，存在穩(wěn)定性不好的問題，其RSD不能達(dá)到低于5％的檢測要求，可能是樣品中核苷類成分的提取和處理方法對其含量測定有很大的影響。前期文獻(xiàn)報道了真菌類物種中核苷類物質(zhì)測定時會互相轉(zhuǎn)化，如《Simultaneous determination of eleven nucleosides and related compounds in Cordyceps by capillary electrochromatography》文章中推測室溫浸漬提取所得腺苷含量較低可能是轉(zhuǎn)化成了其他化合物；《冬蟲夏草水提取過程中腺苷轉(zhuǎn)化途徑研究》結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同提取方法對冬蟲夏草腺苷含量具有顯著影響，如在室溫水提取條件下腺苷酸(三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、單磷酸腺苷)可以轉(zhuǎn)化為腺苷，腺苷可以轉(zhuǎn)化為肌苷。由此可見，樣品處理過程對于準(zhǔn)確測定藥食用真菌藥材中核苷類成分的含量起著非常關(guān)鍵的作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了同時檢測鳥苷、尿苷和腺苷3種核苷類成分，本發(fā)明提供了一種HPLC檢測條件，對羊肚菌中3種核苷成分能同時穩(wěn)定的、精密的測定；除此外，本發(fā)明還提供了提取羊肚菌中核苷的方法，這對于準(zhǔn)確測定藥食用真菌藥材中核苷類成分的含量是非常關(guān)鍵的。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：

(1)供試品溶液制備：取羊肚菌粉末，加入純水，超聲提取，取上清液經(jīng)水系濾頭濾過，靜置處理，即得待測定供試品溶液；

(2)核苷混合對照品溶液制備：分別精密稱取尿苷、鳥苷、腺苷適量，加入純水搖勻，制成尿苷、鳥苷和腺苷的混合對照品溶液；

(3)HPLC檢測：將上述步驟(1)和步驟(2)所得的供試品和對照品溶液，進(jìn)行高效液相色譜檢測，HPLC色譜條件為：采用ZORBAX SB-AQ150*4.6mm，5μm色譜柱，檢測波長為260nm，柱溫保持24～26℃之間，流速為0.8mL/min；采用梯度洗脫，流動相A為0.04M磷酸二氫鉀水溶液，流動相B為乙腈；按體積百分比計，所述梯度洗脫條件為：0～8min，流動相A為100％，流動相B為0％；8～45min，流動相A由100％勻速變?yōu)?5％；流動相B由0％勻速變?yōu)?5％。

在一些實(shí)施例中，所述步驟(1)中供試品溶液制備方法為：取過3號篩的羊肚菌粉末0.2g，用10mL純水超聲提取，取上清液經(jīng)水系濾頭濾過，靜置處理，即得待測定供試品溶液。

在一些實(shí)施例中，所述步驟(1)中供試品溶液制備方法中的超聲提取條件為：25～35℃超聲提取30min。

在一些實(shí)施例中，所述步驟(1)中供試品溶液制備方法中的靜置處理方法為：放置于6℃環(huán)境下16～28h。

在一些實(shí)施例中，所述步驟(2)中核苷混合對照品溶液制備方法為：分別精密稱取尿苷、鳥苷、腺苷適量至100mL容量瓶中，用純水溶解，加水并定容至刻度，搖勻，即得單一對照品溶液；分別精密吸取單一核苷對照品母液10.00mL于50mL容量瓶中，加入純水稀釋并定容至刻度，搖勻，制成尿苷、鳥苷和腺苷質(zhì)量濃度分別為9μg/mL、8μg/mL、9μg/mL的核苷混合對照品溶液。

本發(fā)明具有如下有益效果：

1.本發(fā)明的高效液相色譜檢測方法首次同時檢測了羊肚菌中腺苷、尿苷和鳥苷含量，所得色譜圖基線穩(wěn)定，峰形良好，分離度高，能夠?yàn)檠蚨蔷|(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

2.本發(fā)明采用純水在25-35℃下超聲30min提取羊肚菌中核苷的方法能夠準(zhǔn)確的測定其中腺苷、鳥苷和尿苷的含量，三種核苷的加樣回收率都在98～102％范圍內(nèi)，且RSD值在1.5％以內(nèi)，能夠很好的反映樣品中這三種核苷的真實(shí)含量。

3.本發(fā)明發(fā)現(xiàn)樣品提取之后，在6℃環(huán)境下靜置處理16～28h時具有很好的穩(wěn)定性，其RSD值在5％以內(nèi)，解決了羊肚菌核苷檢測方法的穩(wěn)定性問題。

附圖說明

以下，結(jié)合附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施方案，其中U、A、G分別為尿苷、腺苷和鳥苷：圖1為羊肚菌核苷類成分不同提取方法的核苷含量的結(jié)果圖，其中①～⑨分別為：

①水提取，30℃超聲提取30min，料液比1:50；

②0.5％H₃PO₃提取，30℃超聲提取30min，料液比1:50；

③20％甲醇提取，30℃超聲提取30min，料液比1:50；

④水提取，25℃超聲提取25min，料液比1:75；

⑤0.5％H₃PO₃提取，35℃超聲提取25min，料液比1:75；

⑥20％甲醇提取，35℃超聲提取25min，料液比1:75；

⑦水提取，浸漬提取50min，料液比1:100；

⑧0.5％H₃PO₃提取，浸漬提取50min，料液比1:100；

⑨20％甲醇提取，浸漬提取50min，料液比1:100。

圖2為羊肚菌不同提取溶劑的核苷含量的結(jié)果圖，其中，提取溶劑分別為10％甲醇，20％甲醇，40％甲醇，60％甲醇，80％甲醇，90％甲醇，100％甲醇，0.5％H₃PO₃，0.05M Na₂HPO₄，0.02M PBS(磷酸鹽緩沖液)，沸水。

圖3為羊肚菌核苷水提液在6℃環(huán)境下靜置36個小時之內(nèi)供試品樣品所含核苷類成分穩(wěn)定性變化趨勢結(jié)果圖。

圖4為羊肚菌水提液在圖3中16～28h之內(nèi)核苷類成分穩(wěn)定性變化的放大趨勢圖。

圖5為羊肚菌核苷20％甲醇提取液在6℃環(huán)境下靜置36個小時之內(nèi)供試品樣品所含核苷類成分穩(wěn)定性變化趨勢結(jié)果圖。

圖6為羊肚菌核苷水提液在室溫環(huán)境下靜置36個小時之內(nèi)供試品樣品所含核苷類成分穩(wěn)定性變化趨勢結(jié)果圖。

圖7為核苷混合物對照品和供試品溶液的HPLC色譜圖(從下往上分別為核苷混合對照品溶液，兩份平行樣品溶液)。

圖8為羊肚菌樣品系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)色譜圖。

圖9為羊肚菌樣品專屬性實(shí)驗(yàn)色譜圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡述本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1羊肚菌核苷類成分提取方法和提供溶劑的優(yōu)化

1.1儀器與試劑：

儀器：高效液相色譜儀型號為Agilent 1260，電子天平(萬分之一和十萬分之一)型號為Mettler Toledo，超聲清洗儀型號為KQ-500DB，超純水儀型號為MILLI-Q。

試劑：磷酸二氫鉀為分析級別，購于成都科龍；乙腈為HPLC級別，購于Spectrum；尿苷、鳥苷和腺苷(含測級)購于中國藥品生物制品檢定所。

羊肚菌培植凍干品來源于乳源南嶺好山好水食品有限公司的栽培基地。

1.2分析方法：

在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)不同提取方法以及不同提取溶劑對羊肚菌核苷類成分的含量都有影響，即羊肚菌核苷類成分存在穩(wěn)定性的問題。因此，分別考察了不同提取方法和不同提取溶劑對羊肚菌核苷類成分含量的影響，以下為9種提取羊肚菌核苷類成分的方法：

①取過3號篩的羊肚菌粉末0.2g，精密稱定于50mL三角瓶中，加入超純水10mL，在30℃下超聲提取30min，搖勻，取上清液經(jīng)0.45μm水系濾頭濾過后，靜置處理16h后即得。

②取過3號篩的羊肚菌粉末0.2g，精密稱定于50mL三角瓶中，加入0.5％磷酸提取液10mL，在30℃超聲提取30min，搖勻，取上清液經(jīng)0.45μm水系濾頭濾過后，靜置處理16h后即得。

③取過3號篩的羊肚菌粉末0.2g，精密稱定于50mL三角瓶中，加入20％甲醇提取液10mL，在30℃超聲提取30min，搖勻，取上清液經(jīng)0.45μm水系濾頭濾過后，靜置處理16h后即得。

④取過3號篩的羊肚菌粉末0.2g，精密稱定于50mL三角瓶中，加入超純水15mL，在25℃超聲提取25min，搖勻，取上清液經(jīng)0.45μm水系濾頭濾過后，靜置處理16h后即得。

⑤取過3號篩的羊肚菌粉末0.2g，精密稱定于50mL三角瓶中，加入0.5％磷酸提取液15mL，在35℃超聲提取25min，搖勻，取上清液經(jīng)0.45μm水系濾頭濾過后，靜置處理16h后即得。

⑥取過3號篩的羊肚菌粉末0.2g，精密稱定于50mL三角瓶中，加入20％甲醇提取液15mL，在35℃超聲提取25min，搖勻，取上清液經(jīng)0.45μm水系濾頭濾過后，靜置處理16h后即得。

⑦取過3號篩的羊肚菌粉末0.2g，精密稱定于50mL三角瓶中，加入超純水20mL，浸漬提取50min，搖勻，取上清液經(jīng)0.45μm水系濾頭濾過后，靜置處理16h后即得。

⑧取過3號篩的羊肚菌粉末0.2g，精密稱定于50mL三角瓶中，加0.5％H₃PO₃提取液20mL，浸漬提取50min，搖勻，取上清液經(jīng)0.45μm水系濾頭濾過后，靜置處理16h后即得。

⑨取過3號篩的羊肚菌粉末0.2g，精密稱定于50mL三角瓶中，加入20％甲醇提取液20mL，浸漬提取50min，搖勻，取上清液經(jīng)0.45μm水系濾頭濾過后，靜置處理16h后即得。

另外，在考察不同提取方法對羊肚菌核苷類成分含量影響時，發(fā)現(xiàn)提取溶劑的不同對核苷的含量和穩(wěn)定性也有影響，因此在提取條件為料液比1:50，超聲提取30min的情況下考察不同提取溶劑對核苷類成分含量的影響，按照提取方法①所述的方法制備供試品溶液，其中，提取溶劑分別為①10％甲醇，②20％甲醇，③40％甲醇，④60％甲醇，⑤80％甲醇，⑥90％甲醇，⑦100％甲醇，⑧0.5％H₃PO₃，⑨0.05M Na₂HPO₄，⑩0.02M PBS，沸水。

HPLC檢測：吸取上述不同提取方法和不同提取溶劑獲得的供試品溶液，注入到高效液相色譜儀中進(jìn)行檢測，記錄40min以內(nèi)的色譜圖；其中，HPLC色譜條件為：采用Agilent ZORBAX SB-AQ150*4.6mm，5μm色譜柱，檢測波長為260nm，柱溫保持24～26℃之間，流速為0.8mL/min，進(jìn)樣量10μL，進(jìn)樣盤溫度6℃；采用梯度洗脫，流動相A為0.04M磷酸二氫鉀水溶液，流動相B為乙腈；按體積百分比計，所述梯度洗滌條件為：0～8min，流動相A為100％，流動相B為0％；8～45min，流動相A由100％勻速變?yōu)?5％；流動相B由0％勻速變?yōu)?5％。

HPLC檢測結(jié)果：對HPLC檢測條件進(jìn)行優(yōu)化，得到了不同提取方法和不同提取溶劑的羊肚菌核苷類成分的HPLC色譜圖，并通過計算獲得各個條件下供試品溶液樣品所對應(yīng)的核苷類成分的含量。以核苷類成分含量為縱坐標(biāo)，提取方法為橫坐標(biāo)，得到如圖1所示的不同提取方法所對應(yīng)的核苷成分含量結(jié)果圖，其中圖1中橫坐標(biāo)表示9種不同的提取方法，依次對應(yīng)于實(shí)施例中所述的①～⑨種方法。同樣，以核苷類成分含量為縱坐標(biāo)，提取溶劑為橫坐標(biāo)，得到如圖2所示的不同提取溶劑所對應(yīng)的核苷成分含量結(jié)果圖，其中橫坐標(biāo)表示11種不同的提取溶劑，依次對應(yīng)實(shí)施例所提到的種溶劑?？梢姡ㄟ^比較不同提取溶劑、提取時間及料液比對羊肚菌核苷的提取效果，得出最佳的提取方式為：以純水作為溶劑，料液比設(shè)定為1:50，超聲提取30min。

實(shí)施例2羊肚菌核苷類成分提取液穩(wěn)定性變化趨勢的探討

在進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證的過程中，發(fā)現(xiàn)直接將獲得的供試品溶液放置不同時間后進(jìn)行HPLC檢測其精密度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)部分?jǐn)?shù)據(jù)不合格，即提取液穩(wěn)定性不好(不到4h)，故進(jìn)行了提取液穩(wěn)定性的考察，并分別考察了水提和20％醇提兩種方法的提取液穩(wěn)定性的變化趨勢。

根據(jù)實(shí)施例1羊肚菌核苷類成分提取方法中的①和③提取樣品，分別考察在6℃環(huán)境下放置36個小時每間隔1個小時供試品樣品所含核苷類成分含量的變化，同時，比較了羊肚菌核苷類成分水提液在室溫環(huán)境下放置36個小時每間隔1個小時對應(yīng)的供試品樣品所含核苷類成分含量的變化。

根據(jù)實(shí)施例1所述的色譜檢測條件對上述的供試品樣品分別進(jìn)行HPLC檢測。

HPLC檢測結(jié)果：通過實(shí)施例1的色譜檢測條件獲得了羊肚菌核苷水提液和醇提液在6℃環(huán)境下靜置36個小時之內(nèi)每間隔1個小時供試品溶液樣品的HPLC色譜圖，以及水提液在室溫環(huán)境下靜置36個小時之內(nèi)每間隔1個小時供試品溶液樣品的HPLC色譜圖。以放置時間為橫坐標(biāo)，核苷類成分的峰面積為縱坐標(biāo)，獲得水提液、20％甲醇提取液在6℃下和水提液在室溫環(huán)境下放置36h之內(nèi)所含核苷類成分穩(wěn)定性變化趨勢圖，如圖3、圖5和圖6所示。圖3為羊肚菌核苷水提液在6℃環(huán)境下放置36個小時每間隔1個小時所對應(yīng)的供試品溶液樣品中所含核苷類成分的峰面積值，圖4為羊肚菌核苷水提液在16～28h內(nèi)核苷類成分峰面積變化的放大圖，由圖可知在6℃環(huán)境下放置16h時開始出現(xiàn)平衡起點(diǎn)，在其后12h內(nèi)，能達(dá)到較好的穩(wěn)定性。圖5為羊肚菌核苷20％甲醇提取液在6℃環(huán)境下放置36個小時每間隔1個小時所對應(yīng)的供試品溶液樣品中所含核苷類成分的峰面積值，由圖可知20％甲醇提取液在36小時內(nèi)核苷類成分的峰面積在持續(xù)變化，即溶液穩(wěn)定性較差。圖6為羊肚菌核苷水提液在室溫環(huán)境下放置36個小時每間隔1個小時所對應(yīng)的供試品溶液樣品中所含核苷類成分的峰面積值，由圖6可知，水提液在室溫環(huán)境下放置時其核苷類成分的峰面積也在不停的變化，其穩(wěn)定性達(dá)不到檢測要求。

因此，通過這部分實(shí)驗(yàn)得出，羊肚菌核苷水提液在6℃環(huán)境下放置16h時出現(xiàn)平穩(wěn)起點(diǎn)，并在其后的12h之內(nèi)其所含的核苷類成分含量是穩(wěn)定的，適合準(zhǔn)確測定羊肚菌中核苷類成分并對其進(jìn)行方法學(xué)考察。

實(shí)施例3HPLC檢測羊肚菌中核苷類成分的方法建立

根據(jù)實(shí)施例1和2確定羊肚菌樣品提取最佳方法為：以純水作為溶劑，料液比設(shè)定為1:50，超聲提取30min，以及依據(jù)水提液在6℃環(huán)境下放置16～28h核苷類成分穩(wěn)定性建立其羊肚菌樣品的HPLC檢測方法。

供試品溶液制備：取過3號篩的羊肚菌粉末0.2g，精密稱定于50mL三角瓶中，加入超純水10mL，在30℃下超聲提取30min，搖勻，取上清液經(jīng)0.45μm水系濾頭濾過后，6℃環(huán)境下靜置16h，即得待測供試品溶液。

核苷混合對照品溶液制備：分別精密稱取尿苷，鳥苷，腺苷適量于100mL容量瓶中，用超純水溶解，加水并定容至刻度，搖勻，即得單一對照品溶液；分別精密吸取單一核苷對照品母液10.00mL于50mL容量瓶中，加入超純水稀釋并定容至刻度，搖勻，制成尿苷、鳥苷和腺苷質(zhì)量濃度分別為9μg/mL、8μg/mL、9μg/mL核苷混合對照品溶液。

HPLC檢測：吸取上述步驟所得供試品和對照品溶液，注入到高效液相色譜儀中進(jìn)行檢測，記錄40min以內(nèi)的色譜圖；其中，HPLC色譜條件為：采用Agilent ZORBAX SB-AQ150*4.6mm，5μm色譜柱，檢測波長為260nm，柱溫保持24～26℃之間，流速為0.8mL/min，進(jìn)樣量10μL，進(jìn)樣盤溫度6℃；采用梯度洗脫，流動相A為0.04M磷酸二氫鉀水溶液，流動相B為乙腈；按體積百分比計，所述梯度洗滌條件為：0～8min，流動相A為100％，流動相B為0％；8～45min，流動相A由100％勻速變?yōu)?5％；流動相B由0％勻速變?yōu)?5％。

HPLC檢測結(jié)果：如圖7所示為羊肚菌核苷混合對照品溶液和兩份平行供試品溶液(樣品溶液-1和樣品溶液-2)的HPLC色譜圖。由圖可知，優(yōu)化后的色譜檢測條件所獲得的色譜圖分離度和峰型都較好，并檢測到含有尿苷(Uridine)、鳥苷(Guanosine)、和腺苷(Adenosine)3種核苷類成分。

實(shí)施例4HPLC檢測羊肚菌中核苷類成分的方法學(xué)考察

對實(shí)施例3中所建立的HPLC檢測羊肚菌中核苷類成分的方法進(jìn)行以下方面的方法學(xué)考察。

4.1系統(tǒng)適應(yīng)性考察：

單個對照品溶液的制備：

腺苷對位溶液：稱取腺苷對照品約5mg于100mL容量瓶中，用空白溶液(超純水)溶解并定容至刻度，搖勻即得。

鳥苷對位溶液：稱取鳥苷對照品約5mg于100mL容量瓶中，用空白溶液(超純水)溶解并定容至刻度，搖勻即得。

尿苷對位溶液：稱取尿苷對照品約5mg于100mL容量瓶中，用空白溶液(超純水)溶解并定容至刻度，搖勻即得。

按照實(shí)施例3所述方法制備供試品和核苷混合對照品溶液。系統(tǒng)平衡后取空白溶液進(jìn)樣2針，對照品溶液進(jìn)樣6針，記錄色譜圖。計算對照品溶液中尿苷、鳥苷、腺苷與各自相鄰峰的分離度、對稱因子，計算尿苷、鳥苷、腺苷單個樣品連續(xù)進(jìn)樣6針各峰面積的RSD值。如圖8所示，為核苷混合對照品溶液6次進(jìn)樣的HPLC色譜圖。通過比較藥典標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)的色譜峰分離度良好，對照品溶液中各主峰與各自相鄰峰的分離度小于1.5，對稱因子在1.30～1.39之間，單個腺苷、鳥苷和尿苷對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6針的峰面積RSD值不超過5.0％。由此可知本實(shí)驗(yàn)的系統(tǒng)適用性檢測合格。

4.2專屬性考察

按照實(shí)施例3和實(shí)施例4.1所述方法制備供試品溶液、核苷混合對照品溶液和尿苷、鳥苷、腺苷對位溶液，并按照實(shí)施例3所述的HPLC色譜條件進(jìn)行檢測，記錄色譜圖。同時，記錄尿苷對位溶液、鳥苷對位溶液、腺苷對位溶液在各自色譜峰的保留時間；核苷混合對照品溶液和供試品溶液中各主峰的保留時間。

如圖9所示，從下往上依次為空白溶液、供試品樣品溶液、核苷混合對照品溶液、尿苷對位溶液、鳥苷對位溶液和腺苷對位溶液的HPLC色譜圖。其中，尿苷、鳥苷和腺苷三個對位溶液的保留時間分別為：8.013min，17.147min，30.393min。供試品溶液中尿苷、鳥苷和腺苷三個主峰的保留時間分別為：8.033min，17.127min，30.380min。核苷對照品溶液中尿苷、鳥苷和腺苷三個主峰的保留時間分別為：8.040min，17.087min，30.347min?？梢姡?種核苷類成分的保留時間在供試品溶液和核苷混合對照品溶液中的絕對值差小于0.2min，即實(shí)驗(yàn)的專屬性檢測結(jié)果是合格的。

4.3精密度考察

按照實(shí)施例3制備供試品溶液和核苷混合對照品溶液的方法。平行稱取6份供試品，制得6份供試品溶液。分別取供試品液各進(jìn)樣1針，按照實(shí)施例3所述的HPLC色譜分析條件進(jìn)行檢測，記錄色譜圖。以供試品前后附近2針對照品溶液計算6份供試品中尿苷、鳥苷、腺苷的含量，并記錄供試品液中的尿苷、鳥苷、腺苷的峰面積、含量以及計算含量的RSD值。結(jié)果計算得尿苷平均百分含量為0.158％，RSD為2.8％；鳥苷平均百分含量為0.104％，RSD為3.3％；腺苷平均百分含量為0.130％，RSD為4.3％。

4.4穩(wěn)定性考察

按照實(shí)施例3所述方法制備供試品溶液后在6℃環(huán)境下靜置16h，并將供試品溶液置于6℃進(jìn)樣盤中，在不關(guān)機(jī)的情況下，分別于0、2、4、6、8、10、12h(可根據(jù)實(shí)際操作更改時間)取樣，分別進(jìn)樣一針，記錄色譜圖。同時記錄各時間點(diǎn)供試品溶液中尿苷、鳥苷、腺苷的峰面積，以及各峰面積與0h對應(yīng)峰面積的比值。計算得尿苷峰面積RSD為0.77％，鳥苷峰面積RSD為1.07％，腺苷峰面積RSD為4.08％，可見樣品在放置16h后的12h內(nèi)是穩(wěn)定的。

4.5標(biāo)準(zhǔn)曲線、定量線和檢測線考察

按照實(shí)施例3所述的方法制備供試品和核苷混合對照品溶液。精密吸取配制的核苷混合對照品溶液1mL于100mL容量瓶中，用超純水稀釋并定容至刻度，搖勻即得稀釋100倍的混合對照品溶液。將稀釋100倍后的核苷混合對照品溶液用超純水逐級稀釋至一定濃度，取該稀釋液(平行3份)，各進(jìn)樣一針，進(jìn)樣量為10μL，按照實(shí)施例3所述的HPLC色譜條件進(jìn)行分析，記錄色譜圖。以信噪比(S/N)約為10時相應(yīng)濃度確定為最低定量限，信噪比(S/N)約為3時相應(yīng)濃度確定為最低檢測線。

取核苷混合對照品溶液，設(shè)置進(jìn)樣量分別為5μL、7.5μL、10μL、15μL，每個進(jìn)樣2針(最低濃度點(diǎn)以定量限實(shí)驗(yàn)中最后2針計)，按照實(shí)施例3所述的HPLC色譜條件進(jìn)行分析檢測。計算尿苷、鳥苷、腺苷的峰面積平均值，以尿苷、鳥苷、腺苷的峰面積平均值對其濃度進(jìn)行二元線性回歸，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，溶液濃度(X)為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸計算，得回歸方程、相關(guān)系數(shù)與線性關(guān)系(表1)。

表1 3種羊肚菌核苷類成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、定量限及檢測限

4.6加樣回收率考察

供試品溶液II制備：稱取供試品粉末約0.1g，精密稱定于50mL三角瓶中，精密加入實(shí)施例3項(xiàng)下的核苷混合對照品溶液5mL，再加入超純水5mL，超聲提取30min，搖勻，取上清液經(jīng)0.45μm水系濾膜濾過后，6℃環(huán)境下靜置16h即得，平行制備6份。

取實(shí)施例3項(xiàng)下供試品溶液2份，各進(jìn)樣一針；然后取各供試品溶液II，每份進(jìn)樣一針，按照實(shí)施例3所述的HPLC色譜條件進(jìn)行分析，記錄色譜圖。計算尿苷、鳥苷、腺苷的峰面積，以實(shí)施例3項(xiàng)下供試品溶液以及供試品溶液II前后附近2針對照品溶液計算各供試品溶液II中尿苷、鳥苷、腺苷實(shí)際測定值、理論值、單個回收率和回收率的RSD值，如表2所示。

表2 3種羊肚菌核苷類成分的加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

通過表3可知，尿苷、鳥苷和腺苷三種核苷類成分的平均回收率范圍為99.91％～100.0％，回收率RSD范圍為0.96％～1.1％，即三種核苷成分的加樣回收檢測符合藥典要求。