本發(fā)明涉及農(nóng)產(chǎn)質(zhì)量安全檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是一種谷物中伏馬毒素的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
：伏馬毒素是由串珠鐮刀菌(Fusariummoniliforme)、輪枝鐮刀菌(Fusariumverticillioides)等在一定溫度和濕度條件下產(chǎn)生的，是一類由多氫醇與丙三羧酸組成的雙脂類化合物。主要分布在以小麥、玉米等農(nóng)作物中，可造成秧苗枯萎，根、莖、種子腐爛等農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)損失。截止目前為止，發(fā)現(xiàn)的伏馬毒素有FA1、FA2、FB1、FB2、FB3、FB4、FC1、FC2、FC3、FC4、FP1共11種，但其分布主要以FB1、FB2和FB3這3種形式存在，其中FB1是危害范圍最大和研究最廣的伏馬毒素。伏馬毒素一類水溶性次級(jí)代謝產(chǎn)物，與人或動(dòng)物機(jī)體內(nèi)神經(jīng)鞘氨醇結(jié)構(gòu)幾位相似，在神經(jīng)鞘脂代謝過(guò)程中能競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合神經(jīng)鞘氨醇N-2?；D(zhuǎn)移酶，從而抑制神經(jīng)鞘氨醇的生物合成、阻礙鞘脂類代謝，引發(fā)各種疾病。研究證實(shí)，伏馬毒素能引起馬大腦白質(zhì)軟化癥、豬肺水腫綜合征等，此外伏馬毒素還具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性及免疫毒性，與人類食道癌的放生密切相關(guān)。因此，國(guó)際癌癥研究中心將伏馬毒素列為2B級(jí)致癌物作為人類潛在的致癌物質(zhì)。農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)能力是衡量一個(gè)國(guó)家農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全水平的關(guān)鍵指標(biāo)，在農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全控制系統(tǒng)中處于優(yōu)先地位。目前農(nóng)產(chǎn)品中伏馬毒素檢測(cè)方法主要有、柱前衍生-高效液相色譜法免疫親和柱、薄層免疫法等，這些方法前處理復(fù)雜且靈敏度較低，且檢測(cè)成本較高，不能滿足大量樣品的快速衡量檢測(cè)的要求。目前尚缺乏能同時(shí)對(duì)不同谷物(小麥或玉米)中快速、靈敏且成本較低的衡量檢測(cè)伏馬毒素分析方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明提供一種伏馬毒素的檢測(cè)方法，即先對(duì)樣品進(jìn)行提取凈化，凈化液經(jīng)高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(LC/MS/MS)檢測(cè)，最后通過(guò)基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量測(cè)定樣品中伏馬毒素，本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：一種谷物中伏馬毒素的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法，具體步驟如下：(1)樣品提純將等體積的甲醇與水混合后，按照體積質(zhì)量比5:1(mL/g)加入谷物樣品粉末中，以180rpm振蕩30min后，2500rpm離心5min，收集上清液；取3mL上清液注入含有季胺基的固相萃取柱(CNWBONDSAXSPECartridge，500mg，6mL)，流速1d/s(滴/秒)，然后分別取甲醇和水各5mL淋洗固相萃取柱,流速2d/s(滴/秒)；再將甲醇與甲酸按體積比99:1混合后，取10mL加入固相萃取柱以洗脫伏馬毒素，流速2d/s(滴/秒)，收集洗脫液以氮?dú)獯蹈桑蹈珊蟮臍堅(jiān)芙庥隗w積比為50％的甲醇水溶液中，過(guò)0.22μm的濾膜，收集濾液，即為樣品提純液體；(2)取伏馬毒素標(biāo)準(zhǔn)品并配制成標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用50％(體積比)乙腈逐級(jí)稀釋，至少配制成5種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；對(duì)這些不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液進(jìn)行高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)，建立0.02μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL的伏馬毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線；(3)對(duì)步驟(1)獲得的樣品提純液體進(jìn)行高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果帶入步驟(2)獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，外標(biāo)法定量算出樣品中各伏馬毒素的濃度，再由公式(1)計(jì)算獲得樣品中伏馬毒素的含量；Xi=Ai×ci×VAsi×m---(1)]]>式(1)中：Xi——樣品中各伏馬毒素殘留含量，單位為毫克每千克(mg/kg)；Ai——樣品中各伏馬毒素的峰面積；Asi——伏馬毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液中各伏馬毒素的峰面積；ci——伏馬毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液中各伏馬毒素的濃度，單位為微克每毫升(μg/mL)；V——樣品中最終定容體積，單位為毫升(mL)；m——最終樣品代表的試樣量，單位為克(g)。進(jìn)一步，本發(fā)明所述谷物中伏馬毒素的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法中，所述高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)具體是指：(1)色譜條件：a)色譜柱：菲羅門Kinetex100A色譜柱(2.6uC18100×2.3mm)；b)進(jìn)樣量：2μL；c)柱溫：40℃；d)流速：0.5mL/min；e)流動(dòng)相和洗脫時(shí)間：流動(dòng)相A：0.385g/L的酸酸銨溶液；流動(dòng)相B：甲醇；洗脫時(shí)間0-1.6min，初始流動(dòng)相A從90％到60％，流動(dòng)相B從10％到40％；洗脫時(shí)間1.6-10min，流動(dòng)相A從60％到40％，流動(dòng)相B從40％到60％；洗脫時(shí)間10-11min，流動(dòng)相A從40％到90％，流動(dòng)相B從60％到10％；洗脫時(shí)間11-12min，流動(dòng)相A從90％到40％，流動(dòng)相B從10％到60％；洗脫時(shí)間12-15min，流動(dòng)相A維持90％，流動(dòng)相B維持10％。共運(yùn)行15min；(2)質(zhì)譜條件：電噴霧電離正離子模式，離子源溫度500℃，駐留時(shí)間100ms，霧化氣壓50psi，輔助氣壓50psi，噴霧電壓5500V，碰撞室射出電壓6V，通過(guò)MRM方式進(jìn)行定量。進(jìn)一步，本發(fā)明所述谷物中伏馬毒素的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法中，所述谷物為小麥或玉米。進(jìn)一步，本發(fā)明所述谷物中伏馬毒素的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法中，其特征在于，所述谷物樣品粉末是指過(guò)2.00mm孔篩后的谷物樣品粉末。本發(fā)明與其他檢測(cè)方法相比具有耗時(shí)短，靈敏準(zhǔn)確的特點(diǎn)，可適用于大批量樣品的檢測(cè)。同時(shí)本發(fā)明解決了傳統(tǒng)的伏馬毒素采用免疫親和柱檢測(cè)成本高或需要衍生化過(guò)程復(fù)雜的問(wèn)題。本方法的建立使小麥和玉米等植物中伏馬毒素的含量得以準(zhǔn)確測(cè)定，能為農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供準(zhǔn)確的分析方法。附圖說(shuō)明圖1伏馬毒素色譜圖。圖2不同樣品中伏馬毒素檢測(cè)色譜圖。具體實(shí)施方式下面通過(guò)實(shí)例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的描述，這些描述并不是對(duì)本
發(fā)明內(nèi)容進(jìn)一步的限定。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解，對(duì)本
發(fā)明內(nèi)容所做的等同替換或相應(yīng)的改進(jìn)，仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。實(shí)施例中所用的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜為日本島津20ADXR液相色譜系統(tǒng)串聯(lián)美國(guó)AB3500質(zhì)譜系統(tǒng)。實(shí)施例1建立標(biāo)準(zhǔn)曲線1、伏馬毒素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制：稱取FB1、FB2、FB3各10.0ng，分別用乙腈與水的混合液(體積比1:1)溶解并定容到100mL容量瓶中，F(xiàn)B1、FB2、FB3的濃度均為100μg/mL。伏馬毒素混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：取FB1、FB2、FB3的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各1mL，定容到10mL得到10μg/mL的FB1、FB2、FB3的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。2、樣品提純將等體積的甲醇與水混合后，按照體積質(zhì)量比5:1(mL/g)加入谷物樣品(分別為小麥和玉米)粉末中，以180rpm振蕩30min后，2500rpm離心5min，收集上清液；取3mL上清液注入含有季胺基的固相萃取柱，流速1d/s，然后分別取甲醇和水各5mL淋洗固相萃取柱,流速2d/s；再將甲醇與甲酸按體積比99:1混合后，取10mL加入固相萃取柱，流速2d/s，收集洗脫液以氮?dú)獯蹈桑蹈珊蟮臍堅(jiān)芙庥诩状既芤?甲醇與水體積比1:1)中，過(guò)0.22μm的濾膜，收集濾液，即為樣品提純液體(基質(zhì))；以上述方法對(duì)空白小麥和空白玉米樣品進(jìn)行提取并得到相應(yīng)的空白基質(zhì)(小麥和玉米空白樣品通過(guò)國(guó)標(biāo)方法GB5009.240-2016進(jìn)行檢測(cè)驗(yàn)證所得)，分別用上述用空白基質(zhì)稀釋伏馬毒素混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，配成20，100，500，1000，2000ng/mL的伏馬毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，再分別進(jìn)行高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)。高效液相色譜分離的條件為：色譜柱為菲羅門Kinetex100A色譜柱(C182.6u100×2.3mm)，進(jìn)樣量：2μL；柱溫：40℃，流動(dòng)相A：0.385g/L的酸酸銨溶液；流動(dòng)相B：甲醇；洗脫時(shí)間0-1.6min，初始流動(dòng)相A從90％到60％，流動(dòng)相B從10％到40％；洗脫時(shí)間1.6-10min，流動(dòng)相A從60％到40％，流動(dòng)相B從40％到60％；洗脫時(shí)間10-11min，流動(dòng)相A從40％到90％，流動(dòng)相B從60％到10％；洗脫時(shí)間11-12min，流動(dòng)相A從90％到40％，流動(dòng)相B從10％到60％；洗脫時(shí)間12-15min，流動(dòng)相A維持90％，流動(dòng)相B維持10％；共運(yùn)行15min。串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)條件為：離子化模式為電噴霧電離正離子模式(ESI+)，離子源溫度500℃，駐留時(shí)間100ms，霧化氣壓50psi，輔助氣壓50psi，噴霧電壓5500V，碰撞室射出電壓6V，通過(guò)MRM方式進(jìn)行定量(MRM參數(shù)見表1)。表1伏馬毒素的MRM參數(shù)名稱母離子定量離子碰撞電壓(v)定性離子碰撞電壓(v)FB1722.4352.450334.455FB2706.4336.452318.451FB3706.4236.448688.441檢測(cè)所得小麥和玉米的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線如表2、3所示，伏馬毒素色譜圖如圖1所示：表2：小麥基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線毒素名稱標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍(ng/mL)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程線性相關(guān)系數(shù)rFB120、100、500、1000、2000Y＝129.8X+257.70.99954FB220、100、500、1000、2000Y＝301.4X-8709.70.99665FB320、100、500、1000、2000Y＝217.3X-1329.30.99858表3：玉米基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線毒素名稱標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍(ng/mL)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程線性線性關(guān)系rFB120、100、500、1000、2000Y＝138.7X-5853.90.99509FB220、100、500、1000、2000Y＝304.8X-9224.20.99648FB320、100、500、1000、2000Y＝217.9X-7863.50.99639采用基質(zhì)加標(biāo)法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，在相應(yīng)的線性范圍內(nèi)，所有的真菌毒素在不同的基質(zhì)中均線性良好，線性相關(guān)系數(shù)r≥0.99。3、靈敏度：將標(biāo)準(zhǔn)品溶液用基質(zhì)梯度稀釋的方法測(cè)定方法的靈敏度，方法的定量限范圍為20ng/mL-2000ng/mL，檢出限為10ng/mL-20ng/mL。(定量限：信噪比等于10時(shí)對(duì)應(yīng)目標(biāo)物濃度；檢出限：信噪比等于3時(shí)對(duì)應(yīng)目標(biāo)物濃度)。4、回收率：采用基質(zhì)加標(biāo)法對(duì)方法的回收率進(jìn)行考察，高、中、低三個(gè)濃度3個(gè)平行的添加回收率范圍為76.1％-102.3％，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差2.5％-5.8％。5、精密度：伏馬毒素在小麥和玉米基質(zhì)中的日內(nèi)精密度范圍為1.2％-5.3％，日間精密度范圍為2.1％-8.2％。實(shí)施例2樣品檢測(cè)1、制備樣品提純液取市場(chǎng)采集的小麥和玉米樣品，分別按下述操作過(guò)程進(jìn)行分析檢測(cè)。(1)取小麥和玉米樣品按四分法縮分至1kg，全部磨碎并磨細(xì)，過(guò)2.00mm孔篩，置于-20℃冰箱內(nèi)保存待用。(2)將樣品取出恢復(fù)至室溫后，取5g樣品粉末置于50mL三角瓶中，加入25mL甲醇與水的混合溶液(體積比1:1)，搖床振蕩(180r/min)30min后，離心(6000r/min)5min，取上清。(3)準(zhǔn)確取5mL上清液通過(guò)含有季胺基的固相萃取柱，棄過(guò)柱液，分別取5mL甲醇和5mL水過(guò)柱淋洗，棄淋洗液；(4)將甲醇和甲酸按體積比99：1混合后，準(zhǔn)確取10mL混合液加入季胺基固相萃取柱(CNWBONDSAXSPECartridge,500mg,6mL)，收集富集在柱上的伏馬毒素，收集全部洗脫液于干凈的玻璃試管中，氮?dú)獯蹈伞?5)吹干后殘?jiān)?mL甲醇水溶液(甲醇與水的體積比為1:1)溶解，然后過(guò)0.22μm的濾膜后，即獲得樣品提純液。對(duì)本實(shí)施例中獲得的樣品提純液進(jìn)行液相色譜質(zhì)譜串聯(lián)檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如表4和圖2所示，圖2中，A-D分別為小麥樣品1、小麥樣品2、玉米樣品1和玉米樣品2，(a)為FB1，(b)為FB2，(c)為FB3。2，結(jié)果計(jì)算根據(jù)實(shí)施例1獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，外標(biāo)法定量算出樣品中各伏馬毒素的濃度，再由公式(1)計(jì)算獲得樣品中伏馬毒素的含量；Xi=Ai×ci×VAsi×m---(1)]]>式(1)中：Xi——試樣中各伏馬毒素殘留含量，單位為毫克每千克(mg/kg)；Ai——樣液中各伏馬毒素的峰面積；Asi——伏馬毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液中各伏馬毒素的峰面積；ci——伏馬毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液中各伏馬毒素的濃度，單位為微克每毫升(μg/mL)；V——樣液中最終定容體積，單位為毫升(mL)；m——最終樣液代表的試樣量，單位為克(g)。計(jì)算結(jié)果需扣除空白值：本實(shí)施例中伏馬毒素的檢測(cè)結(jié)果如表4所示，表4不同樣品中伏馬毒素的檢測(cè)結(jié)果同時(shí)，為了驗(yàn)證方法的精密度及準(zhǔn)確性，采用國(guó)標(biāo)GB/T5009.240-2016測(cè)定玉米中FB1、FB2和FB3，其結(jié)果通過(guò)本方法所得到的伏馬毒素含量與國(guó)標(biāo)方法得到的含量偏差小于等于10％，證明方法準(zhǔn)確可靠。并且本方法使用的季胺基固相萃取柱一次可以對(duì)三種伏馬毒素進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)價(jià)格遠(yuǎn)低于國(guó)標(biāo)方法的免疫親和柱，極大的節(jié)省了成本和時(shí)間。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3