本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)絕對(duì)定量技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種非同位素標(biāo)記肽段加入法結(jié)合MRM的蛋白質(zhì)定量方法。
背景技術(shù)：
規(guī)?；牡鞍踪|(zhì)定量技術(shù)主要分為四大類：(1)基于雙向電泳光密度的定量；(2)基于穩(wěn)定同位素標(biāo)記與質(zhì)譜分析的定量；(3)基于質(zhì)譜分析的無標(biāo)記定量；(4)基于免疫印跡和蛋白質(zhì)芯片的定量，近年來質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)技術(shù)正逐步受到蛋白質(zhì)組學(xué)研究者們關(guān)注，成為定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的重要技術(shù)。
但現(xiàn)有技術(shù)中，相對(duì)定量分析只能比較各組蛋白質(zhì)之間量的變化，無法確定其真正的蛋白濃度，傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)絕對(duì)定量最常用酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定其抗體的種類有限且價(jià)格昂貴，并非所有蛋白都能進(jìn)行定量，而且該方法每次只能對(duì)一個(gè)蛋白進(jìn)行定量，難以適應(yīng)蛋白質(zhì)組學(xué)高通量分析的要求，同位素標(biāo)記法與MRM技術(shù)相結(jié)合的蛋白質(zhì)絕對(duì)定量需要合成昂貴的同位素標(biāo)記肽段，應(yīng)用前提是被選擇作為內(nèi)標(biāo)肽段模板的肽段是唯一肽段，且目標(biāo)蛋白的酶解要充分，對(duì)于多個(gè)的蛋白標(biāo)記物驗(yàn)證需要合成多個(gè)標(biāo)記肽段，其費(fèi)用也相對(duì)較高。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
基于背景技術(shù)存在的技術(shù)問題，本發(fā)明提出了一種非同位素標(biāo)記肽段加入法結(jié)合MRM的蛋白質(zhì)定量方法。
本發(fā)明提出的一種非同位素標(biāo)記肽段加入法結(jié)合MRM的蛋白質(zhì)定量方法，包括以下步驟：
S1：MRM-MS方法的建立與優(yōu)化；首先通過UNIPROT數(shù)據(jù)庫獲取蛋白的全部序列，然后通過Skyline軟件建立和優(yōu)化MRM質(zhì)譜方法；
S2：非同位素標(biāo)記肽段加入法結(jié)合MRM技術(shù)的絕對(duì)定量新方法建立；(1)標(biāo)準(zhǔn)肽段標(biāo)準(zhǔn)溶液制備：將蛋白的標(biāo)準(zhǔn)肽段干粉用十萬分之一電子天平精密稱量，然后用30-35％的乙腈、0.1-0.5％的甲酸和70-75％的水溶液溶解配置成為100-110pmol/L的儲(chǔ)備液；(2)血清樣本制備：首先取血清10-15μL，然后加入190-200μL的AgilentBuffeA，混勻，接著將其置于超濾管中，離心10-15min，將濾液加入至Hu-7HC小柱上，離心30-40s，收集濾液，再加入Agilent BuffeA，離心1-1.5min，收集濾液，計(jì)算濾液體積，合并后的濾液用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度，然后根據(jù)測(cè)得溶液的蛋白濃度吸取50-60μg的蛋白溶液，置于超濾管中，離心15-20min，接著加入200-210μL的Urea和100-110μL的DTT，在37-42℃下于混勻儀中攪拌60-70min，接著加入20-25μL的IAA，暗反應(yīng)30-35min，離心10-15min，濾去溶液，再加入NH4HCO3和胰酶，在37-42℃下酶切過夜，離心10-15min后凍干；3)分析方法驗(yàn)證；定量標(biāo)準(zhǔn)曲線：首先配制混合標(biāo)準(zhǔn)肽段血清樣品溶液：取10-15pmol/μL的混合同位素標(biāo)記肽段儲(chǔ)備液和10-15pmol/μL的混合非標(biāo)記肽段儲(chǔ)備液等體積混合，然后用流動(dòng)相A稀釋成標(biāo)準(zhǔn)肽段水溶液，接著加入等體積的1-3μg/μL的正常血清蛋白酶切液，分別配成標(biāo)準(zhǔn)肽段血清樣品溶液，在標(biāo)準(zhǔn)肽段血清樣品溶液中分別加入100-110fmol的β半乳糖苷酶酶切產(chǎn)物作為內(nèi)標(biāo)多肽，然后用建立的MRM-MS方法進(jìn)行測(cè)定；方法精密度：分別配制1-5、10-15和50-55fmol/μL的低中高三種濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)肽段血清樣品溶液，然后分別加入50-55fmol的β半乳糖苷酶酶切產(chǎn)物作為內(nèi)標(biāo)多肽，用建立的MRM-MS方法進(jìn)行測(cè)定，用內(nèi)標(biāo)多肽校正測(cè)得的血清中標(biāo)準(zhǔn)多肽的濃度，用外推法血清中標(biāo)準(zhǔn)多肽的濃度，并計(jì)算各濃度值的RSD值，考察方法的定量精密度；(4)用建立的MRM-MS方法對(duì)各樣品進(jìn)行液相色譜分離和質(zhì)譜分析,每份樣品均加入三種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)多肽和內(nèi)標(biāo)多肽β半乳糖苷酶酶切產(chǎn)物，加入的標(biāo)準(zhǔn)多肽濃度為樣品濃度的1、2、4倍。用內(nèi)標(biāo)多肽校正測(cè)得的血清中標(biāo)準(zhǔn)多肽的濃度。以測(cè)出的各標(biāo)準(zhǔn)多肽濃度匯制一條曲線，曲線外推至橫軸所得濃度即為樣本濃度。
優(yōu)選地，所述S1中，通過Skyline軟件建立和優(yōu)化MRM質(zhì)譜方法的步驟為：(1)多肽選擇初步建立MRM質(zhì)譜方法；(2)離子對(duì)選擇；(3)碰撞能量CE選擇；(4)DP選擇；(5)結(jié)合建立優(yōu)化后的MRM質(zhì)譜方法，并驗(yàn)證之。
優(yōu)選地，所述S2中，(1)標(biāo)準(zhǔn)肽段標(biāo)準(zhǔn)溶液制備：將蛋白的標(biāo)準(zhǔn)肽段干粉用十萬分之一電子天平精密稱量，然后用31-34％的乙腈、0.2-0.4％的甲酸和71-74％的水溶液溶解配置成為101-109pmol/L的儲(chǔ)備液。
優(yōu)選地，所述S2中，(2)血清樣本制備：首先取血清11-14μL，然后加入191-199μL的Agilent BuffeA，混勻，接著將其置于超濾管中，離心11-14min，將濾液加入至Hu-7HC小柱上，離心31-39s，收集濾液，再加入Agilent BuffeA，離心1.1-1.4min，收集濾液，計(jì)算濾液體積，合并后的濾液用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度，然后根據(jù)測(cè)得溶液的蛋白濃度吸取51-59μg的蛋白溶液，置于超濾管中，離心16-19min，接著加入201-209μL的Urea和101-109μL的DTT，在38-41℃下于混勻儀中攪拌61-69min，接著加入21-24μL的IAA，暗反應(yīng)31-34min，離心11-14min，濾去溶液，再加入NH4HCO3和胰酶，在38-41℃下酶切過夜，離心11-14min后凍干。
本發(fā)明中，該非同位素標(biāo)記肽段加入法結(jié)合MRM的蛋白質(zhì)定量方法能夠利用高靈敏度質(zhì)譜進(jìn)行目標(biāo)蛋白的特異性選擇而不需進(jìn)行特異性抗體的合成，簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、選擇性好、準(zhǔn)確度高，能有效地去除基質(zhì)的干擾。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步解說。
實(shí)施例一
本實(shí)施例提出的一種非同位素標(biāo)記肽段加入法結(jié)合MRM的蛋白質(zhì)定量方法，包括以下步驟：
S1：MRM-MS方法的建立與優(yōu)化；首先通過UNIPROT數(shù)據(jù)庫獲取蛋白的全部序列，然后通過Skyline軟件建立和優(yōu)化MRM質(zhì)譜方法；
S2：非同位素標(biāo)記肽段加入法結(jié)合MRM技術(shù)的絕對(duì)定量新方法建立；(1)標(biāo)準(zhǔn)肽段標(biāo)準(zhǔn)溶液制備：將蛋白的標(biāo)準(zhǔn)肽段干粉用十萬分之一電子天平精密稱量，然后用30％的乙腈、0.1％的甲酸和70％的水溶液溶解配置成為100pmol/L的儲(chǔ)備液；(2)血清樣本制備：首先取血清10μL，然后加入190μL的Agilent BuffeA，混勻，接著將其置于超濾管中，離心10min，將濾液加入至Hu-7HC小柱上，離心30s，收集濾液，再加入Agilent BuffeA，離心1min，收集濾液，計(jì)算濾液體積，合并后的濾液用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度，然后根據(jù)測(cè)得溶液的蛋白濃度吸取50μg的蛋白溶液，置于超濾管中，離心15min，接著加入200μL的Urea和100μL的DTT，在37℃下于混勻儀中攪拌60min，接著加入20μL的IAA，暗反應(yīng)30min，離心10min，濾去溶液，再加入NH4HCO3和胰酶，在37℃下酶切過夜，離心10min后凍干；(3)進(jìn)行液相色譜分離和質(zhì)譜分析；(4)分析方法驗(yàn)證；定量標(biāo)準(zhǔn)曲線：首先配制混合標(biāo)準(zhǔn)肽段血清樣品溶液：取10pmol/μL的混合同位素標(biāo)記肽段儲(chǔ)備液和10pmol/μL的混合非標(biāo)記肽段儲(chǔ)備液等體積混合，然后用流動(dòng)相A稀釋成標(biāo)準(zhǔn)肽段水溶液，接著加入等體積的1μg/μL的正常血清蛋白酶切液，分別配成標(biāo)準(zhǔn)肽段血清樣品溶液，在標(biāo)準(zhǔn)肽段血清樣品溶液中分別加入100fmol的β半乳糖苷酶酶切產(chǎn)物作為內(nèi)標(biāo)多肽，然后用建立的MRM-MS方法進(jìn)行測(cè)定；方法精密度：分別配制1、10和50fmol/μL的低中高三種濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)肽段血清樣品溶液，然后分別加入50fmol的β半乳糖苷酶酶切產(chǎn)物作為內(nèi)標(biāo)多肽，用建立的MRM-MS方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算各濃度值的RSD值，考察方法的定量精密度。
實(shí)施例二
本實(shí)施例提出的一種非同位素標(biāo)記肽段加入法結(jié)合MRM的蛋白質(zhì)定量方法，包括以下步驟：
S1：MRM-MS方法的建立與優(yōu)化；首先通過UNIPROT數(shù)據(jù)庫獲取蛋白的全部序列，然后通過Skyline軟件建立和優(yōu)化MRM質(zhì)譜方法；
S2：非同位素標(biāo)記肽段加入法結(jié)合MRM技術(shù)的絕對(duì)定量新方法建立；(1)標(biāo)準(zhǔn)肽段標(biāo)準(zhǔn)溶液制備：將蛋白的標(biāo)準(zhǔn)肽段干粉用十萬分之一電子天平精密稱量，然后用35％的乙腈、0.5％的甲酸和75％的水溶液溶解配置成為110pmol/L的儲(chǔ)備液；(2)血清樣本制備：首先取血清15μL，然后加入200μL的Agilent BuffeA，混勻，接著將其置于超濾管中，離心15min，將濾液加入至Hu-7HC小柱上，離心40s，收集濾液，再加入Agilent BuffeA，離心1.5min，收集濾液，計(jì)算濾液體積，合并后的濾液用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度，然后根據(jù)測(cè)得溶液的蛋白濃度吸取60μg的蛋白溶液，置于超濾管中，離心20min，接著加入210μL的Urea和110μL的DTT，在42℃下于混勻儀中攪拌70min，接著加入25μL的IAA，暗反應(yīng)35min，離心15min，濾去溶液，再加入NH4HCO3和胰酶，在42℃下酶切過夜，離心15min后凍干；(3)進(jìn)行液相色譜分離和質(zhì)譜分析；(4)分析方法驗(yàn)證；定量標(biāo)準(zhǔn)曲線：首先配制混合標(biāo)準(zhǔn)肽段血清樣品溶液：取15pmol/μL的混合同位素標(biāo)記肽段儲(chǔ)備液和15pmol/μL的混合非標(biāo)記肽段儲(chǔ)備液等體積混合，然后用流動(dòng)相A稀釋成標(biāo)準(zhǔn)肽段水溶液，接著加入等體積的3μg/μL的正常血清蛋白酶切液，分別配成標(biāo)準(zhǔn)肽段血清樣品溶液，在標(biāo)準(zhǔn)肽段血清樣品溶液中分別加入110fmol的β半乳糖苷酶酶切產(chǎn)物作為內(nèi)標(biāo)多肽，然后用建立的MRM-MS方法進(jìn)行測(cè)定；方法精密度：分別配制5、15和55fmol/μL的低中高三種濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)肽段血清樣品溶液，然后分別加入55fmol的β半乳糖苷酶酶切產(chǎn)物作為內(nèi)標(biāo)多肽，用建立的MRM-MS方法進(jìn)行測(cè)定，用內(nèi)標(biāo)多肽校正測(cè)得的血清中標(biāo)準(zhǔn)多肽的濃度，用外推法血清中標(biāo)準(zhǔn)多肽的濃度，并計(jì)算各濃度值的RSD值，考察方法的定量精密度。
以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。