相關(guān)申請的交叉引用本申請是2013年3月11日提交的美國申請No.13/794,277的部分繼續(xù)申請，并根據(jù)35U.S.C.§119(e)要求2012年4月25日提交的美國申請No.61/638,131的權(quán)益。本申請還要求2012年11月2日提交的PCT專利申請No.PCT/US2012/063286的優(yōu)先權(quán)，該PCT專利申請又根據(jù)35U.S.C.§119(e)要求2012年4月25日提交的美國臨時專利申請No.61/638,026的權(quán)益。上述申請為了所有目的通過引用并入本文。
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子檢測領(lǐng)域并且特別涉及蛋白質(zhì)檢測領(lǐng)域。具體地，本文提供了使用二次諧波產(chǎn)生(secondharmonicgeneration)技術(shù)鑒別和檢測靶蛋白的變構(gòu)調(diào)節(jié)劑的方法。
背景技術(shù)：
：隨著對癌癥基因組學(xué)的認識的進步，在癌癥生物學(xué)中潛在的治療靶標的數(shù)目在過去二十年呈指數(shù)式增長。然而，與此同時，獲準的針對最豐富地活化的癌癥相關(guān)基因的療法的數(shù)目僅略有增長。從化學(xué)的角度來看，許多從生物學(xué)角度來看具有吸引力的癌癥靶標被認為是難治性的(“不可成藥的(undruggable)”)。人們越來越認識到，這些蛋白質(zhì)靶標并不適于傳統(tǒng)的藥物發(fā)現(xiàn)方法，通常這是因為它們在與其他蛋白質(zhì)相互作用(即，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用或“PPI”)時具有相對較大的接觸面積，或者是由于它們具有極其緊密地與蛋白質(zhì)的活性位點結(jié)合的配體。后一種情況的實例在例如Ras的蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)，Ras以皮摩爾的親和力結(jié)合其配體GTP，使得與潛在藥物的競爭變得困難。據(jù)估計，全部現(xiàn)有靶標中的75-80％是傳統(tǒng)的小分子或生物(蛋白質(zhì))類治療劑所無法企及的，這些治療劑通常通過競爭性結(jié)合蛋白質(zhì)的活性位點來抑制蛋白質(zhì)功能，在這些靶標中有許多針對癌癥充分驗證的靶標。此類“不可成藥的”靶標的變構(gòu)調(diào)節(jié)劑提供了一種具有吸引力的治療方案。根據(jù)定義，變構(gòu)分子與除蛋白質(zhì)的活性位點以外的位點結(jié)合，從而改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象并伴隨有功能效應(yīng)(例如，受體的抑制、活化等)。此外，在其他優(yōu)勢中(1)，靶蛋白的變構(gòu)調(diào)節(jié)還具有以下額外的優(yōu)勢：不必依賴于對天然配體與蛋白質(zhì)結(jié)合的抑制或競爭，其可能導(dǎo)致不期望的臨床副作用。然而，難以通過當前可用的常規(guī)技術(shù)來鑒別變構(gòu)調(diào)節(jié)劑。例如，由X射線晶體學(xué)或NMR法獲得的結(jié)構(gòu)信息由于低通量、低靈敏度、非生理性條件、適于該技術(shù)的蛋白質(zhì)的大小以及許多其他因素而在用于藥物發(fā)現(xiàn)的目的時受到限制。因此，所需要的是能夠快速且以高通量的方式鑒別對靶蛋白的結(jié)構(gòu)進行變構(gòu)調(diào)節(jié)的試劑(agent)的技術(shù)。本文通過公開用于鑒別能夠與靶蛋白進行變構(gòu)結(jié)合從而改變其構(gòu)象結(jié)構(gòu)的試劑的方法而提供了這樣的技術(shù)。在整個說明書中，引用了多個專利、專利申請和其他類型的出版物(例如，期刊文章)。本文所引用的所有專利、專利申請和出版物的公開內(nèi)容為了所有目的通過引用整體并入本文。技術(shù)實現(xiàn)要素：本文提供的發(fā)明尤其公開了通過使用二次諧波產(chǎn)生技術(shù)來鑒別和檢測靶蛋白構(gòu)象狀態(tài)的變構(gòu)調(diào)節(jié)劑的方法。因此，在一些方面，本文提供了一種用于鑒別與靶蛋白上的變構(gòu)位點結(jié)合的試劑B的方法，該方法包括：(a)使靶蛋白與結(jié)合靶蛋白的活性位點的試劑A接觸；(b)使靶蛋白與試劑B接觸，其中靶蛋白采用在界面處具有凈取向的二次諧波活性部分(例如，標記物)進行標記，其中采用表面選擇性技術(shù)由二次諧波活性部分(例如，標記物)產(chǎn)生可檢測信號，并且其中所述可檢測信號指示在試劑B與靶蛋白上的變構(gòu)位點結(jié)合時所產(chǎn)生的靶蛋白結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化；以及(c)測定靶蛋白與試劑B接觸后所述可檢測信號的存在或不存在。在一些實施方案中，所述二次諧波活性部分(例如，標記物)選自PyMPO-MALEIMIDETM(1-(2-馬來酰亞胺基乙基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)噁唑-2-基)吡啶鎓甲磺酸鹽)、PyMPO-NHS、PyMPO-琥珀酰亞胺酯、BADANTM(6-溴乙?；?2-二甲基氨基萘)和ACRYLODANTM(6-丙烯?；?2-二甲基氨基萘)。在一些實施方案中，所述二次諧波活性部分(例如，標記物)通過靶蛋白表面上的一個或多個巰基基團與靶蛋白結(jié)合。在一些實施方案中，所述一個或多個巰基基團是天然的巰基基團。在一些實施方案中，所述一個或多個巰基基團是工程化的巰基基團。在一些實施方案中，所述一個或多個巰基基團位于已知與一個或多個配體接觸的靶蛋白氨基酸殘基上。在本文所述的任何實施方案中的一些實施方案中，所述二次諧波活性部分(例如，標記物)是PyMPO-MALEIMIDETM(1-(2-馬來酰亞胺基乙基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)噁唑-2-基)吡啶鎓甲磺酸鹽)。在一些實施方案中，所述二次諧波活性部分(例如，標記物)通過靶蛋白表面上的一個或多個胺基團與靶蛋白結(jié)合。在一些實施方案中，所述一個或多個胺基團是天然的胺基團。在一些實施方案中，所述一個或多個胺基團是工程化的胺基團。在本文所述的任何實施方案中的一些實施方案中，所述一個或多個胺基團位于已知與一個或多個配體接觸的靶蛋白氨基酸殘基上。在本文所述的任何實施方案中的一些實施方案中，所述二次諧波活性部分(例如，標記物)是PyMPO-琥珀酰亞胺酯。在本文所述的任何實施方案中的一些實施方案中，所述靶蛋白在與表面結(jié)合時被原位標記。在一些實施方案中，所述二次諧波活性部分(例如，標記物)是非天然氨基酸。在一些實施方案中，所述非天然氨基酸位于已知與一個或多個配體接觸的靶蛋白的區(qū)域內(nèi)。在一些實施方案中，所述非天然氨基酸是Aladan。在本文所述的任何實施方案中的一些實施方案中，所述配體為蛋白質(zhì)、核酸、磷脂、碳水化合物或輔因子中的一種或多種。在一些實施方案中，所述配體是激酶信號級聯(lián)的蛋白質(zhì)成員。在一些實施方案中，所述靶蛋白是G蛋白偶聯(lián)受體、類固醇激素受體或酪氨酸激酶受體。在本文所述的任何實施方案中的一些實施方案中，所述界面選自：玻璃表面、聚乙二醇表面、支持的脂雙層表面、脂質(zhì)類似物雙層表面、塑料表面、金屬表面、膠乳表面、橡膠表面、陶瓷表面、聚合物表面、聚丙烯表面、聚偏二氟乙烯表面、聚乙烯表面。在一些實施方案中，使用寡聚PEG(oligo-PEG)分子或脂質(zhì)對表面進行衍生化。在一些實施方案中，所述寡聚PEG分子或脂質(zhì)是帶有Ni-NTA的寡聚PEG分子或帶有Ni-NTA的脂質(zhì)。在一些實施方案中，所述表面是支持的脂雙層或脂質(zhì)類似物雙層。在本文所述的任何實施方案中的一些實施方案中，所述靶蛋白包含親和標簽。在本文所述的任何實施方案中的一些實施方案中，實時檢測靶蛋白結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化。在本文所述的任何實施方案中的一些實施方案中，試劑A和/或試劑B是小分子化學(xué)化合物、抗體、非抗體多肽、碳水化合物、抑制性核酸或它們的任意組合。在一些方面，本文提供了一種用于鑒別在與試劑結(jié)合時經(jīng)歷構(gòu)象變化的靶蛋白結(jié)構(gòu)中的特異性位點的方法，該方法包括：(a)使靶蛋白與試劑接觸，其中靶蛋白在第一氨基酸殘基處采用在界面處具有凈取向的二次諧波活性部分(例如，標記物)進行標記，其中，采用表面選擇性技術(shù)由二次諧波活性部分(例如，標記物)產(chǎn)生第一可檢測信號，并且其中第一可檢測信號指示在試劑與靶蛋白上的位點結(jié)合時所產(chǎn)生的靶蛋白結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化；(b)使靶蛋白與試劑接觸，其中靶蛋白在第二氨基酸殘基處采用在界面處具有凈取向的二次諧波活性部分(例如，標記物)進行標記，其中第二氨基酸殘基位于與第一氨基酸殘基的位置不同的靶蛋白區(qū)域內(nèi)，其中采用表面選擇性技術(shù)由二次諧波活性部分(例如，標記物)產(chǎn)生第二可檢測信號，并且其中第二可檢測信號指示在試劑與靶蛋白上的位點結(jié)合時所產(chǎn)生的靶蛋白結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化；以及(c)將第一可檢測信號與第二可檢測信號進行比較，其中單獨的在第一氨基酸殘基位點處的構(gòu)象變化指示所述試劑與靶蛋白結(jié)合并誘導(dǎo)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)在第一氨基酸殘基的位點處的構(gòu)象變化，并且其中單獨的在第二氨基酸殘基位點處的構(gòu)象變化指示所述試劑在第二氨基酸殘基的位點處與靶蛋白結(jié)合并誘導(dǎo)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)在第二氨基酸殘基的位點處的構(gòu)象變化。在另一方面，本文提供了一種用于鑒別在試劑與蛋白質(zhì)結(jié)合時該蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的位點特異性構(gòu)象變化的方法，該方法包括：(a)使靶蛋白與試劑接觸，其中靶蛋白在第一氨基酸殘基處采用在界面處具有凈取向的二次諧波活性部分進行標記，其中，采用表面選擇性技術(shù)由二次諧波活性部分產(chǎn)生第一可檢測信號，并且其中第一可檢測信號指示在試劑與靶蛋白上的位點結(jié)合時所產(chǎn)生的靶蛋白結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化；(b)使靶蛋白與試劑接觸，其中靶蛋白在第二氨基酸殘基處采用在界面處具有凈取向的二次諧波活性部分進行標記，其中第二氨基酸殘基位于與第一氨基酸殘基的位置不同的靶蛋白區(qū)域內(nèi)，其中采用表面選擇性技術(shù)由二次諧波活性部分產(chǎn)生第二可檢測信號，并且其中第二可檢測信號指示在試劑與靶蛋白上的位點結(jié)合時所產(chǎn)生的靶蛋白結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化；以及(c)將第一可檢測信號與第二可檢測信號進行比較，其中單獨的在第一氨基酸殘基位點處的構(gòu)象變化指示所述試劑誘導(dǎo)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)在第一氨基酸殘基的位點處的構(gòu)象變化，并且其中單獨的在第二氨基酸殘基位點處的構(gòu)象變化指示所述試劑誘導(dǎo)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)在第二氨基酸殘基的位點處的構(gòu)象變化。在一些實施方案中，該方法包括使靶蛋白與能夠結(jié)合靶蛋白的活性位點的試劑接觸的初始步驟。在一些實施方案中，該方法進一步包括重復(fù)步驟(b)和(c)，其中位于靶蛋白中的一個或多個不同位點處的一個或多個另外的氨基酸殘基采用在界面處具有凈取向的二次諧波活性部分(例如，標記物)進行標記，其中采用表面選擇性技術(shù)由二次諧波活性部分(例如標記物)產(chǎn)生一個或多個另外的可檢測信號，并且其中所述一個或多個另外的可檢測信號指示在試劑與靶蛋白上的位點結(jié)合時所產(chǎn)生的靶蛋白結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化。在本文所述的任何實施方案中的一些實施方案中，所述方法進一步包括確定所述試劑與靶蛋白上的變構(gòu)位點是特異性地結(jié)合還是非特異性地結(jié)合，其中如果所述試劑誘導(dǎo)靶蛋白結(jié)構(gòu)在一個經(jīng)二次諧波活性部分標記的氨基酸的位點處的構(gòu)象變化，但并不誘導(dǎo)靶蛋白結(jié)構(gòu)在一個或多個其他經(jīng)二次諧波部分標記的氨基酸的位點處的構(gòu)象變化，則所述試劑與靶蛋白上的變構(gòu)位點特異性地結(jié)合，并且其中如果所述試劑在全部二次諧波活性部分標記的氨基酸的位點處誘導(dǎo)靶蛋白結(jié)構(gòu)的相同的構(gòu)象變化，則所述試劑與靶蛋白上的變構(gòu)位點非特異性地結(jié)合。在本文所述的任何實施方案中的一些實施方案中，二次諧波活性部分(例如，標記物)選自PyMPO-MALEIMIDETM(1-(2-馬來酰亞胺基乙基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)噁唑-2-基)吡啶鎓甲磺酸鹽)、PyMPO-NHS、PyMPO-琥珀酰亞胺酯、BADANTM(6-溴乙?；?2-二甲基氨基萘)和ACRYLODANTM(6-丙烯?；?2-二甲基氨基萘)。在本文所述的任何實施方案中的一些實施方案中，二次諧波活性部分(例如，標記物)通過靶蛋白表面上的一個或多個巰基基團與靶蛋白結(jié)合。在一些實施方案中，所述一個或多個巰基基團是天然的巰基基團。在一些實施方案中，所述一個或多個巰基基團是工程化的巰基基團。在本文所述的任何實施方案中的一些實施方案中，所述一個或多個巰基基團位于已知與一個或多個配體接觸的靶蛋白氨基酸殘基上。在本文所述的任何實施方案中的一些實施方案中，二次諧波活性部分(例如，標記物)是PyMPO-MALEIMIDETM(1-(2-馬來酰亞胺基乙基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)噁唑-2-基)吡啶鎓甲磺酸鹽)。在本文所述的任何實施方案中的一些實施方案中，二次諧波活性部分(例如，標記物)通過靶蛋白表面上的一個或多個胺基團與靶蛋白結(jié)合。在一些實施方案中，所述一個或多個胺基團是天然的胺基團。在一些實施方案中，所述一個或多個胺基團是工程化的胺基團。在本文所述的任何實施方案中的一些實施方案中，所述一個或多個胺基團位于已知與一個或多個配體接觸的靶蛋白氨基酸殘基上。在一些實施方案中，二次諧波活性部分(例如，標記物)是PyMPO-琥珀酰亞胺酯。在本文所述的任何實施方案中的一些實施方案中，靶蛋白在與表面結(jié)合時被原位標記。在一些實施方案中，二次諧波活性部分(例如，標記物)是非天然氨基酸。在一些實施方案中，所述非天然氨基酸位于已知與一個或多個配體接觸的靶蛋白區(qū)域內(nèi)。在本文所述的任何實施方案中的一些實施方案中，所述非天然氨基酸是Aladan。在本文所述的任何實施方案中的一些實施方案中，所述配體為蛋白質(zhì)、核酸、磷脂、碳水化合物或輔因子中的一種或多種。在一些實施方案中，所述配體是激酶信號級聯(lián)的蛋白質(zhì)成員。在一些實施方案中，靶蛋白是G蛋白偶聯(lián)受體、類固醇激素受體或酪氨酸激酶受體。在本文所述的任何實施方案中的一些實施方案中，所述界面選自：玻璃表面、聚乙二醇表面、支持的脂雙層表面、脂質(zhì)類似物雙層表面、塑料表面、金屬表面、膠乳表面、橡膠表面、陶瓷表面、聚合物表面、聚丙烯表面、聚偏二氟乙烯表面、聚乙烯表面。在一些實施方案中，采用寡聚PEG分子或脂質(zhì)對表面進行衍生化。在一些實施方案中，該寡聚PEG分子或脂質(zhì)是帶有Ni-NTA的寡聚PEG分子或帶有Ni-NTA的脂質(zhì)。在一些實施方案中，所述表面是支持的脂雙層或脂質(zhì)類似物雙層。在本文所述的任何實施方案中的一些實施方案中，靶蛋白包含親和標簽。在本文所述的任何實施方案中的一些實施方案中，實時檢測靶蛋白結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化。在本文所述的任何實施方案中的一些實施方案中，所述試劑是小分子化學(xué)化合物、抗體、非抗體多肽、碳水化合物、抑制性核酸或它們的任意組合。在一些方面，本文提供了一種用于鑒別與G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)上的變構(gòu)位點結(jié)合的試劑的方法，該方法包括：(a)使GPCR與天然配體接觸，其中該天然配體采用二次諧波活性部分(例如，標記物)進行標記，其中該標記物在與GPCR結(jié)合后在界面處具有凈取向；(b)使GPCR與試劑接觸，其中采用表面選擇性技術(shù)由二次諧波活性部分(例如，標記物)產(chǎn)生可檢測信號，并且其中所述可檢測信號指示當試劑與GPCR上的變構(gòu)位點結(jié)合時所產(chǎn)生的GPCR結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化；以及(c)測定靶蛋白與試劑接觸后所述可檢測信號的存在或不存在。在一些實施方案中，GPCR位于生物細胞、脂質(zhì)體或合成生物膜的表面上。在其他方面，本文提供了用于鑒別與G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)上的變構(gòu)位點結(jié)合的試劑的方法，該方法包括：(a)使GPCR與已知配體接觸，其中已知該已知配體與GPCR結(jié)合，其中該已知配體采用二次諧波活性部分進行標記，并且其中標記的配體在與GPCR結(jié)合后在界面處具有凈取向；(b)使GPCR與試劑接觸，其中采用表面選擇性技術(shù)由二次諧波活性標記物產(chǎn)生可檢測信號，并且其中所述可檢測信號指示在試劑與GPCR上的位點結(jié)合時所產(chǎn)生的GPCR結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化；以及(c)測定靶蛋白與試劑接觸后所述可檢測信號的存在或不存在。在一些實施方案中，所述生物細胞天然地表達GPCR。在一些實施方案中，所述生物細胞包含編碼GPCR的異源核酸。在本文所述的任何實施方案中的一些實施方案中，GPCR選自：α-1腎上腺素能受體(αl-AR)，硬骨魚緊張肽(UT)受體，5-HT2和5-HT6血清素受體，下丘泌素(hypocretic)(食欲素)受體，組胺HI受體，緩激肽B1和B2受體，鈴蟾肽BB2受體，P2Y嘌呤能受體，乙酰膽堿受體，mGluR5谷氨酸受體，加壓素V2和VI受體，血管緊張素AGTR1受體，膽囊收縮素CCKAR和CCKBR受體，內(nèi)皮素ENDRA受體，生長素釋放肽GHSRla受體，褪黑激素MTNRlA受體，神經(jīng)降壓肽NTSR1受體，血小板活化因子PTAFR受體，催乳素釋放肽受體PRLHR受體，G-偶聯(lián)5-HT2、5-HT2A、5-HT6和5-HT7血清素受體，Gi-偶聯(lián)GABA-B，組胺H3以及mGluR2/4谷氨酸受體。在其他方面，本文提供了一種用于鑒別與靶蛋白上的變構(gòu)位點結(jié)合的試劑B的方法，該方法包括：(a)使靶蛋白與能夠結(jié)合靶蛋白的活性位點的試劑A接觸，其中試劑A采用在界面處具有凈取向的二次諧波活性部分(例如，標記物)進行標記，其中采用表面選擇性技術(shù)由二次諧波活性部分(例如，標記物)產(chǎn)生可檢測信號，并且其中所述可檢測信號指示在試劑B與靶蛋白上的變構(gòu)位點結(jié)合時所產(chǎn)生的靶蛋白結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化；(b)使靶蛋白與試劑B接觸；以及(c)測定靶蛋白與試劑B接觸后所述可檢測信號的存在或不存在。在一些方面，二次諧波活性部分(例如，標記物)選自PyMPO-MALEIMIDETM(1-(2-馬來酰亞胺基乙基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)噁唑-2-基)吡啶鎓甲磺酸鹽)、PyMPO-NHS、PyMPO-琥珀酰亞胺酯、BADANTM(6-溴乙?；?2-二甲基氨基萘)和ACRYLODANTM(6-丙烯?；?2-二甲基氨基萘)。在一些實施方案，二次諧波活性部分(例如，標記物)通過試劑A表面上的一個或多個巰基基團與試劑A結(jié)合。在一些實施方案中，所述一個或多個巰基基團是天然的巰基基團。在一些實施方案中，所述一個或多個巰基基團是工程化的巰基基團。在一些實施方案中，二次諧波活性部分(例如，標記物)是PyMPO-MALEIMIDETM(1-(2-馬來酰亞胺基乙基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)噁唑-2-基)吡啶鎓甲磺酸鹽)。在一些實施方案中，二次諧波活性部分(例如，標記物)通過試劑A表面上的一個或多個胺基團與試劑A結(jié)合。在一些實施方案中，所述一個或多個胺基團是天然的胺基團。在一些實施方案中，所述一個或多個胺基團是工程化的胺基團。在本文提供的任何實施方案中的一些實施方案中，二次諧波活性部分(例如，標記物)是PyMPO-琥珀酰亞胺酯。在一些實施方案中，二次諧波活性部分(例如，標記物)是非天然氨基酸。在本文提供的任何實施方案中的一些實施方案中，該非天然氨基酸是Aladan。在一些實施方案中，靶蛋白是G蛋白偶聯(lián)受體、類固醇激素受體或酪氨酸激酶受體。在本文提供的任何實施方案中的一些實施方案中，所述界面選自：玻璃表面、聚乙二醇表面、支持的脂雙層表面、脂質(zhì)類似物雙層表面、塑料表面、金屬表面、膠乳表面、橡膠表面、陶瓷表面、聚合物表面、聚丙烯表面、聚偏二氟乙烯表面、聚乙烯表面。在一些實施方案中，采用寡聚PEG分子或脂質(zhì)對表面進行衍生化。在一些實施方案中，其中寡聚PEG分子或脂質(zhì)是帶有Ni-NTA的寡聚PEG分子或帶有Ni-NTA的脂質(zhì)。在一些實施方案中，所述表面是支持的脂雙層或脂質(zhì)類似物雙層。在本文提供的任何實施方案中的一些實施方案中，靶蛋白包含親和標簽。在本文提供的任何實施方案中的一些實施方案中，試劑A或試劑B是小分子化學(xué)化合物、抗體、非抗體多肽、碳水化合物、抑制性核酸或它們的任意組合。本發(fā)明還提供了確定靶生物分子與候選結(jié)合配偶體之間的結(jié)合相互作用的特異性的方法，該方法包括：(a)使用第一二次諧波活性部分在第一位點處標記靶生物分子；使靶生物分子與候選結(jié)合配偶體接觸；并在靶生物分子與候選結(jié)合配偶體結(jié)合時檢測第一可檢測信號；(b)使用第二二次諧波活性部分在第二位點處標記靶生物分子；使靶生物分子與候選結(jié)合配偶體接觸；并在靶生物分子與候選結(jié)合配偶體結(jié)合時檢測第二可檢測信號。第一可檢測信號與第二可檢測信號之間的差異(例如，在噪聲水平以上1％、2％、3％、4％、5％)指示靶生物分子與候選結(jié)合配偶體之間的特異性結(jié)合相互作用。任選地，使用表面選擇性技術(shù)由二次諧波活性部分產(chǎn)生可檢測信號。任選地，該表面選擇性技術(shù)是二次諧波產(chǎn)生或和頻產(chǎn)生。本發(fā)明還提供了篩查靶向靶生物分子的藥物候選物的文庫的方法，該方法包括：(a)使用第一二次諧波活性部分在第一位點處標記靶生物分子；使靶生物分子與第一藥物候選物接觸；并在靶生物分子與候選結(jié)合配偶體結(jié)合時檢測第一可檢測信號；(b)使用第二二次諧波活性部分在第二位點處標記靶生物分子；使靶生物分子與第一藥物候選物接觸；并在靶生物分子與候選結(jié)合配偶體結(jié)合時檢測第二可檢測信號；(c)在第一可檢測信號與第二可檢測信號之間產(chǎn)生第一差異；(d)使用第一二次諧波活性部分在第一位點處標記靶生物分子；使靶生物分子與第二藥物候選物接觸；并在靶生物分子與候選結(jié)合配偶體結(jié)合時檢測第三可檢測信號；(e)使用第二二次諧波活性部分在第二位點處標記靶生物分子；使靶生物分子與第二藥物候選物接觸；并在靶生物分子與候選結(jié)合配偶體結(jié)合時檢測第四可檢測信號；(f)在第三可檢測信號與第四可檢測信號之間產(chǎn)生第二差異；(g)基于第一差異和第二差異選擇藥物。任選地，使用表面選擇性技術(shù)由二次諧波活性部分產(chǎn)生可檢測信號。任選地，該表面選擇技術(shù)是二次諧波產(chǎn)生或和頻產(chǎn)生。任選地，所述方法進一步包括在動物中篩選所選擇的藥物。所述可檢測信號可以是歸一化的二次諧波產(chǎn)生強度的變化。所述靶生物分子可以是蛋白質(zhì)、DNA、RNA或寡糖。任選地，所述候選結(jié)合配偶體是變構(gòu)調(diào)節(jié)劑。本發(fā)明還提供了測量靶蛋白在功能上相關(guān)的位點處的構(gòu)象變化的方法，該方法包括：(a)將靶蛋白與已知與該蛋白質(zhì)的活性位點結(jié)合的天然或合成配體進行預(yù)孵育；(b)使靶蛋白與候選變構(gòu)結(jié)合配偶體接觸；以及(c)采用表面選擇性技術(shù)測量靶蛋白在功能上相關(guān)的位點處的構(gòu)象變化。任選地，所述功能上相關(guān)的位點是與結(jié)合配偶體進行直接結(jié)構(gòu)接觸的位點。任選地，所述功能上相關(guān)的位點是與結(jié)合配偶體進行間接結(jié)構(gòu)接觸的位點。任選地，所述功能上相關(guān)的位點是非結(jié)構(gòu)性地影響結(jié)合分子的結(jié)合和/或調(diào)節(jié)結(jié)合分子的位點。任選地，所述功能上相關(guān)的位點用二次諧波活性部分進行標記。具體而言，本發(fā)明涉及：1.一種用于鑒別與靶蛋白上的變構(gòu)位點結(jié)合的試劑B的方法，該方法包括：a.使靶蛋白與試劑A接觸，試劑A與靶蛋白的活性位點結(jié)合，或者其中試劑A在被分離時與靶蛋白的活性位點天然結(jié)合；以及b.使靶蛋白與試劑B接觸，其中用在界面處具有凈取向的二次諧波活性部分標記靶蛋白，其中采用表面選擇性技術(shù)由二次諧波活性部分產(chǎn)生可檢測信號，并且其中所述可檢測信號指示在試劑B與靶蛋白上的變構(gòu)位點結(jié)合時所產(chǎn)生的靶蛋白結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化；以及c.測定靶蛋白與試劑B接觸后所述可檢測信號的存在或不存在。2.如段1所述的方法，其中所述二次諧波活性部分選自PyMPO-MALEIMIDETM(1-(2-馬來酰亞胺基乙基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)噁唑-2-基)吡啶鎓甲磺酸鹽)、PyMPO-NHS、PyMPO-琥珀酰亞胺酯、BADANTM(6-溴乙?；?2-二甲基氨基萘)和ACRYLODANTM(6-丙烯酰基-2-二甲基氨基萘)。3.如段1所述的方法，其中所述二次諧波活性部分通過靶蛋白表面上的一個或多個巰基基團與靶蛋白結(jié)合。4.如段3所述的方法，其中所述一個或多個巰基基團是天然的巰基基團。5.如段3所述的方法，其中所述一個或多個巰基基團是工程化的巰基基團。6.如段5所述的方法，其中所述一個或多個巰基基團位于已知與一個或多個配體接觸的靶蛋白氨基酸殘基上。7.如段2所述的方法，其中所述二次諧波活性部分是PyMPO-MALEIMIDETM(1-(2-馬來酰亞胺基乙基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)噁唑-2-基)吡啶鎓甲磺酸鹽)。8.如段2所述的方法，其中所述二次諧波活性部分通過靶蛋白表面上的一個或多個胺基團與靶蛋白結(jié)合。9.如段8所述的方法，其中所述一個或多個胺基團是天然的胺基團。10.如段8所述的方法，其中所述一個或多個胺基團是工程化的胺基團。11.如段10所述的方法，其中所述一個或多個胺基團位于已知與一個或多個配體接觸的靶蛋白氨基酸殘基上。12.如段11所述的方法，其中所述二次諧波活性部分是PyMPO-琥珀酰亞胺酯。13.如段12所述的方法，其中所述靶蛋白在與表面結(jié)合時被原位標記。14.如段1所述的方法，其中所述二次諧波活性部分是非天然氨基酸。15.如段14所述的方法，其中所述非天然氨基酸位于已知與一個或多個配體接觸的靶蛋白的區(qū)域內(nèi)。16.如段5所述的方法，其中所述非天然氨基酸是Aladan。17.如段6所述的方法，其中所述配體為蛋白質(zhì)、核酸、磷脂、碳水化合物或輔因子中的一種或多種。18.如段17所述的方法，其中所述配體是激酶信號級聯(lián)的蛋白質(zhì)成員。19.如段18所述的方法，其中所述靶蛋白是G蛋白偶聯(lián)受體、類固醇激素受體或酪氨酸激酶受體。20.如段19所述的方法，其中所述界面選自：玻璃表面、聚乙二醇表面、支持的脂雙層表面、脂質(zhì)類似物雙層表面、塑料表面、金屬表面、膠乳表面、橡膠表面、陶瓷表面、聚合物表面、聚丙烯表面、聚偏二氟乙烯表面、聚乙烯表面。21.如段20所述的方法，其中使用寡聚PEG分子或脂質(zhì)對所述表面進行衍生化。22.如段21所述的方法，其中所述寡聚PEG分子或脂質(zhì)是帶有Ni-NTA的寡聚PEG分子或帶有Ni-NTA的脂質(zhì)。23.如段20所述的方法，其中所述表面是支持的脂雙層或脂質(zhì)類似物雙層。24.如段23所述的方法，其中所述靶蛋白包含親和標簽。25.如段24所述的方法，其中實時檢測靶蛋白結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化。26.如段25所述的方法，其中所述試劑A是小分子化學(xué)化合物、抗體、非抗體多肽、碳水化合物、抑制性核酸或它們的任意組合。27.如段26所述的方法，其中所述試劑B是與靶蛋白活性位點特異性結(jié)合的小分子化學(xué)化合物、抗體、非抗體多肽、碳水化合物、抑制性核酸或它們的任意組合。28.一種用于鑒別在試劑與蛋白質(zhì)結(jié)合時該蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的位點特異性構(gòu)象變化的方法，該方法包括：a.使靶蛋白與所述試劑接觸，其中靶蛋白在第一氨基酸殘基處采用在界面處具有凈取向的二次諧波活性部分進行標記，其中，采用表面選擇性技術(shù)由二次諧波活性部分產(chǎn)生第一可檢測信號，并且其中所述第一可檢測信號指示在所述試劑與靶蛋白上的位點結(jié)合時所產(chǎn)生的靶蛋白結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化；b.使靶蛋白與所述試劑接觸，其中靶蛋白在第二氨基酸殘基處采用在界面處具有凈取向的二次諧波活性部分進行標記，其中第二氨基酸殘基位于與第一氨基酸殘基的位置不同的靶蛋白的區(qū)域內(nèi)，其中采用表面選擇性技術(shù)由二次諧波活性部分產(chǎn)生第二可檢測信號，并且其中所述第二可檢測信號指示在所述試劑與靶蛋白上的位點結(jié)合時所產(chǎn)生的靶蛋白結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化；以及c.將第一可檢測信號與第二可檢測信號進行比較，其中單獨的在第一氨基酸殘基位點處的構(gòu)象變化指示所述試劑誘導(dǎo)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)在第一氨基酸殘基的位點處的構(gòu)象變化，并且其中單獨的在第二氨基酸殘基位點處的構(gòu)象變化指示所述試劑誘導(dǎo)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)在第二氨基酸殘基的位點處的構(gòu)象變化。29.如段28所述的方法，其中所述方法包括使靶蛋白與能夠結(jié)合靶蛋白的活性位點的試劑接觸的初始步驟。30.如段28所述的方法，其進一步包括重復(fù)步驟(b)和(c)，其中位于靶蛋白中的一個或多個不同位點處的一個或多個另外的氨基酸殘基采用在界面處具有凈取向的二次諧波活性部分進行標記，其中采用表面選擇性技術(shù)由二次諧波活性部分產(chǎn)生一個或多個另外的可檢測信號，并且其中所述一個或多個另外的可檢測信號指示在試劑與靶蛋白上的位點結(jié)合時所產(chǎn)生的靶蛋白結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化。31.如段30所述的方法，其進一步包括確定所述試劑與靶蛋白上的變構(gòu)位點是特異性地結(jié)合還是非特異性地結(jié)合，其中如果所述試劑誘導(dǎo)靶蛋白結(jié)構(gòu)在一個二次諧波活性部分標記的氨基酸的位點處的構(gòu)象變化，但并不誘導(dǎo)靶蛋白結(jié)構(gòu)在一個或多個其他二次諧波活性部分標記的氨基酸的位點處的構(gòu)象變化，則所述試劑與靶蛋白上的變構(gòu)位點特異性地結(jié)合，并且其中如果所述試劑在全部二次諧波活性部分標記的氨基酸的位點處誘導(dǎo)靶蛋白結(jié)構(gòu)的相同的構(gòu)象變化，則所述試劑與靶蛋白上的變構(gòu)位點非特異性地結(jié)合。32.如段31所述的方法，其中所述二次諧波活性部分選自PyMPO-MALEIMIDETM(1-(2-馬來酰亞胺基乙基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)噁唑-2-基)吡啶鎓甲磺酸鹽)、PyMPO-NHS、PyMPO-琥珀酰亞胺酯、BADANTM(6-溴乙?；?2-二甲基氨基萘)和ACRYLODANTM(6-丙烯?；?2-二甲基氨基萘)。33.如段28所述的方法，其中所述二次諧波活性部分通過靶蛋白表面上的一個或多個巰基基團與靶蛋白結(jié)合。34.如段33所述的方法，其中所述一個或多個巰基基團是天然的巰基基團。35.如段33所述的方法，其中所述一個或多個巰基基團是工程化的巰基基團。36.如段33所述的方法，其中所述一個或多個巰基基團位于已知與一個或多個配體接觸的靶蛋白氨基酸殘基上。37.如段33所述的方法，其中所述二次諧波活性部分是PyMPO-MALEIMIDETM(1-(2-馬來酰亞胺基乙基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)噁唑-2-基)吡啶鎓甲磺酸鹽)。38.如段28所述的方法，其中所述二次諧波活性部分通過靶蛋白表面上的一個或多個胺基團與靶蛋白結(jié)合。39.如段38所述的方法，其中所述一個或多個胺基團是天然的胺基團。40.如段38所述的方法，其中所述一個或多個胺基團是工程化的胺基團。41.如段38所述的方法，其中，所述一個或多個胺基團位于已知與一個或多個配體接觸的靶蛋白氨基酸殘基上。42.如段38所述的方法，其中所述二次諧波活性部分是PyMPO-琥珀酰亞胺酯。43.如段28所述的方法，其中所述靶蛋白在與表面結(jié)合時被原位標記。44.如段28所述的方法，其中所述二次諧波活性部分是非天然氨基酸。45.如段44所述的方法，其中所述非天然氨基酸位于已知與一個或多個配體接觸的靶蛋白的區(qū)域內(nèi)。46.如段44所述的方法，其中所述非天然氨基酸是Aladan。47.如段36所述的方法，其中所述配體為蛋白質(zhì)、核酸、磷脂、碳水化合物或輔因子中的一種或多種。48.如段47所述的方法，其中所述配體是激酶信號級聯(lián)的蛋白質(zhì)成員。49.如段48所述的方法，其中所述靶蛋白是G蛋白偶聯(lián)受體、類固醇激素受體或酪氨酸激酶受體。50.如段49所述的方法，其中所述界面選自：玻璃表面、聚乙二醇表面、支持的脂雙層表面、脂質(zhì)類似物雙層表面、塑料表面、金屬表面、膠乳表面、橡膠表面、陶瓷表面、聚合物表面、聚丙烯表面、聚偏二氟乙烯表面、聚乙烯表面。51.如段50所述的方法，其中采用寡聚PEG分子或脂質(zhì)對所述表面進行衍生化。52.如段51所述的方法，其中所述寡聚PEG分子或脂質(zhì)是帶有Ni-NTA的寡聚PEG分子或帶有Ni-NTA的脂質(zhì)。53.如段50所述的方法，其中所述表面是支持的脂雙層或脂質(zhì)類似物雙層。54.如段53所述的方法，其中所述靶蛋白包含親和標簽。55.如段54所述的方法，其中實時檢測靶蛋白結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化。56.如段55所述的方法，其中試劑A是小分子化學(xué)化合物、抗體、非抗體多肽、碳水化合物、抑制性核酸或它們的任意組合。57.一種用于鑒別與G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)上的變構(gòu)位點結(jié)合的試劑的方法，該方法包括：a.使GPCR與已知配體接觸，其中已知該已知配體與GPCR結(jié)合，其中該已知配體采用二次諧波活性部分進行標記，并且其中標記的配體在與GPCR結(jié)合后在界面處具有凈取向；b.使GPCR與試劑接觸，其中采用表面選擇性技術(shù)由二次諧波活性標記物產(chǎn)生可檢測信號，并且其中所述可檢測信號指示在該試劑與GPCR上的位點結(jié)合時所產(chǎn)生的GPCR結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化；以及c.在靶蛋白已與所述試劑接觸后測定所述可檢測信號的存在或不存在。58.如段57所述的方法，其中所述GPCR位于生物細胞、脂質(zhì)體或合成生物膜的表面上。59.如段57所述的方法，其中所述生物細胞自然地表達GPCR。60.如段57所述的方法，其中所述生物細胞包含編碼GPCR的異源核酸。61.如段57所述的方法，其中所述GPCR選自：α-1腎上腺素能受體(αl-AR)，硬骨魚緊張肽(UT)受體，5-HT2和5-HT6血清素受體，下丘泌素(食欲素)受體，組胺HI受體，緩激肽B1和B2受體，鈴蟾肽BB2受體，P2Y嘌呤能受體，乙酰膽堿受體，mGluR5谷氨酸受體，加壓素V2和VI受體，血管緊張素AGTR1受體，膽囊收縮素CCKAR和CCKBR受體，內(nèi)皮素ENDRA受體，生長素釋放肽GHSRla受體，褪黑激素MTNRlA受體，神經(jīng)降壓肽NTSR1受體，血小板活化因子PTAFR受體，催乳素釋放肽受體PRLHR受體，G-偶聯(lián)5-HT2、5-HT2A、5-HT6和5-HT7血清素受體，Gi-偶聯(lián)GABA-B，組胺H3，和mGluR2/4谷氨酸受體。62.一種用于鑒別與靶蛋白上的變構(gòu)位點結(jié)合的試劑B的方法，該方法包括：a.使靶蛋白與結(jié)合靶蛋白的活性位點的試劑A接觸，其中所述試劑A采用在界面處具有凈取向的二次諧波活性部分進行標記，其中采用表面選擇性技術(shù)由二次諧波活性部分產(chǎn)生可檢測信號，并且其中所述可檢測信號指示在試劑B與靶蛋白上的變構(gòu)位點結(jié)合時所產(chǎn)生的靶蛋白結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化；以及b.使靶蛋白與試劑B接觸；以及c.測定靶蛋白與試劑B接觸后所述可檢測信號的存在或不存在。63.如段62所述的方法，其中所述二次諧波活性部分通過試劑A表面上的一個或多個巰基基團與試劑A結(jié)合。64.如段63所述的方法，其中所述一個或多個巰基基團是天然的巰基基團。65.如段63所述的方法，其中所述一個或多個巰基基團是工程化的巰基基團。66.如段62所述的方法，其中所述二次諧波活性部分是PyMPO-MALEIMIDETM(1-(2-馬來酰亞胺基乙基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)噁唑-2-基)吡啶鎓甲磺酸鹽)。67.如段62所述的方法，其中所述二次諧波活性部分通過試劑A表面上的一個或多個胺基團與試劑A結(jié)合。68.如段67所述的方法，其中所述一個或多個胺基團是天然的胺基團。69.如段67所述的方法，其中所述一個或多個胺基團是工程化的胺基團。70.如段67所述的方法，其中所述二次諧波活性部分是PyMPO-琥珀酰亞胺酯。71.如段62所述的方法，其中所述二次諧波活性部分是非天然氨基酸。72.如段71所述的方法，其中所述非天然氨基酸是Aladan。73.如段62所述的方法，其中所述靶蛋白是G蛋白偶聯(lián)受體、類固醇激素受體或酪氨酸激酶受體。74.如段73所述的方法，其中所述界面選自：玻璃表面、聚乙二醇表面、支持的脂雙層表面、脂質(zhì)類似物雙層表面、塑料表面、金屬表面、膠乳表面、橡膠表面、陶瓷表面、聚合物表面、聚丙烯表面、聚偏二氟乙烯表面、聚乙烯表面。75.如段74所述的方法，其中使用寡聚PEG分子或脂質(zhì)對所述表面進行衍生化。76.如段75所述的方法，其中所述寡聚PEG分子或脂質(zhì)是帶有Ni-NTA的寡聚PEG分子或帶有Ni-NTA的脂質(zhì)。77.如段62所述的方法，其中所述表面是支持的脂雙層或脂質(zhì)類似物雙層。78.如段77所述的方法，其中所述靶蛋白包含親和標簽。79.如段78所述的方法，其中所述試劑A或試劑B是小分子化學(xué)化合物、抗體、非抗體多肽、碳水化合物、抑制性核酸或它們的任意組合。80.一種試劑盒，其包含以下中的一種或多種：a.用于綴合至靶蛋白上的一種或多種SHG或SFG活性標記物；b.用于使用SHG或SFG活性標記物標記蛋白質(zhì)的一種或多種試劑；c.一個或多個用于結(jié)合靶蛋白的表面；d.一個或多個與用于檢測靶蛋白-變構(gòu)調(diào)節(jié)劑相互作用的設(shè)備一起使用的信號外圍設(shè)備；e.一種或多種對于靶蛋白功能性而言所必需的輔因子；f.已知與一種或多種靶蛋白結(jié)合的一種或多種肽和/或蛋白質(zhì)；g.已知與一種或多種靶蛋白結(jié)合的一種或多種抗體；以及h.用于將SHG或SFG活性非天然氨基酸(UAA)標記物引入蛋白質(zhì)中的一種或多種組分。81.如段80所述的試劑盒，其中所述一種或多種SHG或SFG活性標記物選自馬來酰亞胺標記物、PyMPO-NHS、噁唑標記物、BADANTM(6-溴乙?；?2-二甲基氨基萘)、ACRYLODANTM(6-丙烯?；?2-二甲基氨基萘)以及基于香豆素的染料。82.如段80所述的試劑盒，其中所述用于結(jié)合靶蛋白的表面選自玻璃、塑料、金屬、膠乳、橡膠、陶瓷和聚合物。83.如段81所述的試劑盒，其中所述聚合物是聚丙烯、聚偏二氟乙烯、聚苯乙烯或聚乙烯。84.如段80所述的試劑盒，其中所述用于結(jié)合靶蛋白的表面包含至少一個預(yù)先形成的表面特征。85.如段84所述的試劑盒，其中所述至少一個預(yù)先形成的表面特征是溝槽、V形槽、臺面結(jié)構(gòu)和/或孔。86.如段80所述的試劑盒，其中所述用于結(jié)合靶蛋白的表面預(yù)先涂覆有一種或多種分子，所述分子提供適于連接至靶蛋白的表面化學(xué)反應(yīng)。87.如段86所述的試劑盒，其中所述一種或多種分子是醛硅烷、BSA-NHS或寡聚聚乙二醇。88.如段87所述的試劑盒，其中所述寡聚聚乙二醇是鎳-寡聚聚乙二醇。89.如段80所述的試劑盒，其中所述用于結(jié)合靶蛋白的表面預(yù)先涂覆有支持的脂雙層或支持的脂質(zhì)類似物雙層。90.如段80所述的試劑盒，其中所述與用于檢測靶蛋白-變構(gòu)調(diào)節(jié)劑相互作用的設(shè)備一起使用的信號外圍設(shè)備是通濾波器、濾色器、干涉濾波器、偏振光學(xué)器件或一個或多個用于引導(dǎo)和聚焦光束的鏡子或透鏡。91.如段80所述的試劑盒，其中所述對于靶蛋白功能性而言所必需的輔因子是焦磷酸硫胺素、NAD+、NADP+、磷酸吡哆醛、硫辛酰胺、甲基鈷胺素、鈷胺素、生物素、輔酶A、四氫葉酸、甲萘醌、抗壞血酸、黃素單核苷酸、黃素腺嘌呤二核苷酸、輔酶F420、三磷酸腺苷(ATP)、三磷酸鳥苷(GTP)、S-腺苷甲硫氨酸、輔酶B、輔酶M、輔酶Q、三磷酸胞苷、谷胱甘肽、血紅素、核苷酸糖、吡咯并喹啉、醌或四氫生物蝶呤。92.一種用于使用二次諧波產(chǎn)生(SHG)和/或和頻產(chǎn)生(SFG)來篩選和鑒別結(jié)合和/或調(diào)節(jié)靶蛋白上的變構(gòu)位點的試劑的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括：a.采用SFG或SHG活性部分標記的靶蛋白；b.用于檢測靶蛋白-試劑相互作用的設(shè)備，該設(shè)備包括：i)基本光的光源；ii)包含用SFG或SHG活性部分標記的靶蛋白的基底；和iii)用于測量二次諧波或其他非線性光束的強度的檢測器，其中通過所述設(shè)備來檢測試劑與蛋白質(zhì)上的變構(gòu)位點的結(jié)合，并且將所述檢測器所記錄的數(shù)據(jù)記錄在固定的或數(shù)據(jù)存儲介質(zhì)上，該存儲介質(zhì)是通過用于讀取存儲介質(zhì)的系統(tǒng)可訪問的。93.一種確定靶生物分子與候選結(jié)合配偶體之間的結(jié)合相互作用的特異性的方法，該方法包括：a.使用第一二次諧波活性部分在第一位點處標記靶生物分子；使靶生物分子與候選結(jié)合配偶體接觸；并在靶生物分子與候選結(jié)合配偶體結(jié)合時檢測第一可檢測信號；以及b.使用第二二次諧波活性部分在第二位點處標記靶生物分子；使靶生物分子與候選結(jié)合配偶體接觸；并在靶生物分子與候選結(jié)合配偶體結(jié)合時檢測第二可檢測信號；其中使用表面選擇性技術(shù)由二次諧波活性部分產(chǎn)生所述可檢測信號；其中，所述第一可檢測信號與第二可檢測信號之間的差異指示靶生物分子與候選結(jié)合配偶體之間的特異性結(jié)合相互作用。94.如段93所述的方法，其中所述差異在噪聲水平以上2％。95.如段93所述的方法，其中所述差異在噪聲水平以上5％。96.一種篩查靶向靶生物分子的藥物候選物的文庫的方法，該方法包括：a.使用第一二次諧波活性部分在第一位點處標記靶生物分子；使靶生物分子與第一藥物候選物接觸；并在靶生物分子與候選結(jié)合配偶體結(jié)合時檢測第一可檢測信號；b.使用第二二次諧波活性部分在第二位點處標記靶生物分子；使靶生物分子與第一藥物候選物接觸；并在靶生物分子與候選結(jié)合配偶體結(jié)合時檢測第二可檢測信號；c.在第一可檢測信號與第二可檢測信號之間產(chǎn)生第一差異；d.使用第一二次諧波活性部分在第一位點處標記靶生物分子；使靶生物分子與第二藥物候選物接觸；并在靶生物分子與候選結(jié)合配偶體結(jié)合時檢測第三可檢測信號；e.使用第二二次諧波活性部分在第二位點處標記靶生物分子；使靶生物分子與第二藥物候選物接觸；并在靶生物分子與候選結(jié)合配偶體結(jié)合時檢測第四可檢測信號；f.在第三可檢測信號與第四可檢測信號之間產(chǎn)生第二差異；以及g.基于所述第一差異和所述第二差異選擇藥物，其中使用表面選擇性技術(shù)由二次諧波活性部分產(chǎn)生所述可檢測信號。97.如段94所述的方法，其進一步包括在動物中篩選所選擇的藥物。98.如段93或94所述的方法，其中所述可檢測信號是歸一化的二次諧波產(chǎn)生強度的變化。99.如段93或94所述的方法，其中所述表面選擇性技術(shù)是二次諧波產(chǎn)生或和頻產(chǎn)生。100.如段93或94所述的方法，其中所述靶生物分子是蛋白質(zhì)。101.如段93或94所述的方法，其中所述靶生物分子是DNA。102.如段93或94所述的方法，其中所述候選結(jié)合配偶體是變構(gòu)調(diào)節(jié)劑。103.一種測量靶蛋白在功能上相關(guān)的位點處的構(gòu)象變化的方法，該方法包括：a.將靶蛋白與已知與該蛋白質(zhì)的活性位點結(jié)合的天然或合成配體進行預(yù)孵育；b.使靶蛋白與候選變構(gòu)結(jié)合配偶體接觸；以及c.采用表面選擇性技術(shù)測量靶蛋白在功能上相關(guān)的位點處的構(gòu)象變化。104.如段101所述的方法，其中所述功能上相關(guān)的位點是與結(jié)合配偶體進行直接的結(jié)構(gòu)接觸的位點。105.如段101所述的方法，其中所述功能上相關(guān)的位點是與結(jié)合配偶體進行間接的結(jié)構(gòu)接觸的位點。106.如段101所述的方法，其中所述功能上相關(guān)的位點是非結(jié)構(gòu)性地影響結(jié)合分子的結(jié)合和/或調(diào)節(jié)結(jié)合分子的位點。107.如段101所述的方法，其中所述功能上相關(guān)的位點用二次諧波活性部分進行標記。附圖說明圖1示出了用于檢測蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化的檢測方法的示意圖。入射的紅光照射到表面上，并通過全內(nèi)反射產(chǎn)生倏逝波，該倏逝波垂直于該表面的平面而偏振并且從該表面僅行進短距離(左)。標記的蛋白質(zhì)與表面結(jié)合，基線信號依賴于染料相對于該法線的位置(中)。使標記物朝向倏逝波的法線的構(gòu)象變化導(dǎo)致信號增加(左)。圖2示出了采用SHG技術(shù)測量在野生型和K419C突變體Abl激酶與GNF2(一種已知的變構(gòu)結(jié)合物)相互作用時所誘導(dǎo)的構(gòu)象變化的實驗結(jié)果。圖3示出了SHG數(shù)據(jù)，其表明標記的Ras蛋白在支持的脂雙層(SLB)上通過SHG可檢測到。圖4示出了三種化合物與胺標記(溶液標記)的Ras靶蛋白結(jié)合的SHG數(shù)據(jù)，其中A)示出了歸一化的SHG強度，B)示出了變化百分比(percentshift)。在以20μM的2X濃度手動注入每種化合物之前，采集基線SHG測量結(jié)果約5秒的時間。注入后實時監(jiān)測構(gòu)象變化約60秒的一段時間。圖5示出了三種化合物與半胱氨酸標記的Ras靶蛋白結(jié)合的SHG數(shù)據(jù)，其中A)示出了歸一化的SHG強度，B)示出了變化百分比。在以20μM的2X濃度手動注入每種化合物之前，采集基線SHG測量結(jié)果約5秒的時間。注入后實時監(jiān)測構(gòu)象變化約60秒的一段時間。發(fā)明詳述本發(fā)明尤其公開了使用SHG活性部分、標記物或探針標記靶蛋白，以用于通過二次諧波產(chǎn)生或和頻產(chǎn)生進行檢測，以便鑒別與靶蛋白上的變構(gòu)位點結(jié)合從而改變其結(jié)構(gòu)構(gòu)象的試劑的方法。基于結(jié)構(gòu)的藥物篩選以及生物分子機制的基礎(chǔ)研究的目標需要能夠在生物分子與配體、藥物或其他結(jié)合配偶體結(jié)合時測量該生物分子的結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)變化的工具。現(xiàn)有的用于確定結(jié)構(gòu)變化的技術(shù)主要局限于NMR(核磁共振)和X-射線晶體學(xué)。這些技術(shù)均不適于實時測量結(jié)構(gòu)變化。此外，這些技術(shù)耗時耗力，并且不適于在藥物篩選中大規(guī)模使用。此外，存在許多難以結(jié)晶的蛋白質(zhì)(例如，膜蛋白)，使得許多這樣的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)尚未確定。二次諧波產(chǎn)生(SHG)對連接至蛋白質(zhì)上的SHG活性染料探針的結(jié)構(gòu)變化高度敏感。目的蛋白在胺或巰基位點(例如，賴氨酸或半胱氨酸殘基)處用SHG活性染料探針共價地標記。SHG活性染料探針通常是熒光探針；關(guān)鍵之處是需要大差異偶極矩和非中心對稱結(jié)構(gòu)。通過將標記的蛋白質(zhì)與表面結(jié)合并使其暴露于來自超快激光器的脈沖紅光來進行SHG測量。在光照下，染料探針將一小部分入射紅光轉(zhuǎn)變?yōu)樗{光，即“二次諧波”信號。這一現(xiàn)象并不涉及光的吸收，而是依賴于類似于反射的機制，僅當存在標記物的凈平均取向時發(fā)生；在溶液中隨機取向的標記的分子并不產(chǎn)生二次諧波光(圖1)。理論上，蛋白質(zhì)群體(其中一半標記物指向表面而另一半標記物背向表面，它們是沿著同一軸)將不產(chǎn)生二次諧波光。實際上，總是存在凈平均取向。當標記物的平均取向由于配體結(jié)合和伴隨的構(gòu)象變化而發(fā)生改變時，二次諧波光的強度會發(fā)生變化，這即是SHG能夠檢測構(gòu)象變化的依據(jù)。本發(fā)明使用二次諧波產(chǎn)生技術(shù)來篩選和鑒別靶蛋白的變構(gòu)調(diào)節(jié)劑。尤其是，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，在候選變構(gòu)調(diào)節(jié)劑的SHG篩選之前將靶蛋白與已知與靶蛋白的活性位點結(jié)合的試劑或配體進行預(yù)孵育或者使用與蛋白質(zhì)的活性位點結(jié)合的天然配體來分離該蛋白質(zhì)增加了以下可能性，即通過SHG檢測到的靶蛋白構(gòu)象變化是由于候選調(diào)節(jié)劑在靶蛋白上的變構(gòu)位點處的相互作用，而不是在活性位點處的相互作用。因此，相對于先前已在本領(lǐng)域中實施的方法，本申請的方法代表了一種改進，因為使用本文所述的方法對蛋白質(zhì)構(gòu)象和行為的變構(gòu)調(diào)節(jié)劑的鑒別可作為高通量測定法實時地進行，這與傳統(tǒng)方法形成對比，傳統(tǒng)方法通常需要很長時間來獲得結(jié)果，并且最多僅提供蛋白質(zhì)在與配體結(jié)合時的構(gòu)象動力學(xué)的快照。I.一般技術(shù)除非另有說明，本發(fā)明的實施將采用分子生物學(xué)(包括重組技術(shù))、微生物學(xué)、細胞生物學(xué)、生物化學(xué)、非線性光學(xué)檢測和測量以及免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，這些技術(shù)均在本領(lǐng)域的技術(shù)范圍內(nèi)。這些技術(shù)在下列文獻中有充分闡述：“MolecularCloning:ALaboratoryManual”，第二版(Sambrook等，1989)；“OligonucleotideSynthesis”(M.J.Gait編著，1984)；“AnimalCellCulture”(R.I.Freshney編著，1987)；“MethodsinEnzymology”(AcademicPress,Inc.)；“CurrentProtocolsinMolecularBiology”(F.M.Ausubel等編著，1987，以及定期更新)；“PCR:ThePolymeraseChainReaction”(Mullis等編著，1994)。Singleton等,DictionaryofMicrobiologyandMolecularBiology,第2版,J.Wiley&Sons(NewYork,N.Y.1994)；March,“AdvancedOrganicChemistryReactions,MechanismsandStructure”,第4版,JohnWiley&Sons(NewYork,N.Y.1992)；“BioconjugateTechniques”,Elsevier(G.T.Hermanson2008)；“Second-ordernonlinearopticaleffectsatsurfacesandinterfaces”,于NonlinearSurfaceElectromagneticPhenomena,Elsevier(H.Ponath和G.I.Stegeman編著，1991)；以及“NeuronalCalciumSensorProteins”,NOVAPublishers(Philippov和Koch編著，2006)為本領(lǐng)域技術(shù)人員提供了針對在本申請中使用的許多術(shù)語的一般指導(dǎo)。II.定義如本文使用的“二次諧波”是指兩倍于基本光束的頻率的光頻率。如本文所使用的，如果空間中存在一個點(“中心”或“反轉(zhuǎn)中心”)，通過該點對所有原子進行反轉(zhuǎn)(x，y，z)—>>(-x，-y，-z)使得分子或物質(zhì)不發(fā)生改變，則該分子或物質(zhì)相是“中心對稱的”。非中心對稱的分子或物質(zhì)缺少這種反轉(zhuǎn)中心。例如，如果分子具有均勻的組成且形狀為球形或立方體，則它是中心對稱的。中心對稱的分子或物質(zhì)沒有非線性磁化性(susceptibility)或超極化性，這兩者對于二次諧波、和頻以及差頻的產(chǎn)生是必要的。如本文所使用的，“表面選擇性技術(shù)”指非線性光學(xué)技術(shù)，例如二次諧波產(chǎn)生或者和頻/差頻產(chǎn)生，或者本領(lǐng)域已知的其他表面特異性技術(shù)。如本文所使用的，“和頻產(chǎn)生”(SFG)是一種非線性光學(xué)技術(shù)，通過該技術(shù)，一個頻率(Ω1)的光與另一頻率(Ω2)的光混合，以產(chǎn)生在和頻(Ω1+Ω2)處的響應(yīng)(Shen,1984,1989)。例如，SFG尤其可用于通過分子的特征性振動躍遷來檢測表面處的分子，在這種情況下，SFG本質(zhì)上是一種在可見光和紅外線頻率具有Ω1和Ω2的表面選擇性紅外光譜法。當術(shù)語“SHG”或“二次諧波產(chǎn)生”在本文中使用時，可以理解，“SFG”與“和頻產(chǎn)生”可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法替換SHG，以及代替SHG使用。如本文所使用的“非線性活性部分”是具有超極化性的物質(zhì)。如本文所使用的“二次諧波活性部分”或“二次諧波活性部分”是指非線性活性部分、粒子或分子，其可(共價或非共價地)連接至分子(例如，蛋白質(zhì)，如酶)、粒子或相(例如，脂雙層)，從而使其具有更高的非線性光學(xué)活性。如本文所使用的“變構(gòu)”、“變構(gòu)調(diào)節(jié)劑”或“變構(gòu)候選物”是指這樣的分子、部分或物質(zhì)：其主要與活性位點以外的位點結(jié)合并引起如通過SHG或SFG確定的構(gòu)象變化，從而通過變構(gòu)作用機制發(fā)揮其作用。如本文所使用的“活性位點”或“活性結(jié)合位點”是指這樣的靶蛋白區(qū)域，由于其形狀和電荷電勢，該區(qū)域有利地通過各種共價和/或非共價結(jié)合力與另一試劑(包括但不限于配體、蛋白質(zhì)、多肽、肽、核酸(包括DNA或RNA)、分子、化合物、抗生素或藥物、分子、部分、底物、產(chǎn)物、類似物或抑制劑)相互作用或相關(guān)聯(lián)，并且在其中行使該蛋白質(zhì)的功能，例如但不限于催化、信號傳導(dǎo)和/或效應(yīng)子活化。如本文所使用的“超極化性”或“非線性磁化性”是指允許產(chǎn)生非線性光的分子、粒子、界面或相的特性。術(shù)語“超極化性”、“二階非線性極化性”和“非線性磁化性”有時可互換使用。如本文所提到的，本文定義的參與結(jié)合配偶體事件的“功能上相關(guān)的”位點包括與結(jié)合配偶體(例如，效應(yīng)子分子)進行直接或間接的結(jié)構(gòu)接觸的任何位點，如通過例如X-射線晶體法、NMR或SHG的結(jié)構(gòu)技術(shù)所確定的。直接的結(jié)構(gòu)接觸被定義為其某部分在結(jié)合配偶體分子的某部分的2nm之內(nèi)的任何殘基。間接的結(jié)構(gòu)接觸被定義為其某部分在與結(jié)合配偶體(例如，效應(yīng)子分子)或結(jié)合配偶體模擬物或類似物結(jié)合時，相對于其在不存在結(jié)合配偶體、模擬物或類似物時的取向、構(gòu)象或相對坐標而改變其取向、構(gòu)象或相對坐標的任何殘基，如通過例如X射線、NMR或SHG的結(jié)構(gòu)技術(shù)所見的。術(shù)語“功能上相關(guān)的”也包括通過非結(jié)構(gòu)手段(例如，表明特定殘基對于結(jié)合配偶體的結(jié)合或調(diào)節(jié)而言重要的誘變或生化數(shù)據(jù))已知在結(jié)合分子的結(jié)合或調(diào)節(jié)(例如，活化、抑制、調(diào)節(jié)等)中重要的殘基。如本文所定義的，術(shù)語“配體”包括與另一分子結(jié)合的任何分子，例如但不限于，與另一蛋白質(zhì)結(jié)合的一種蛋白質(zhì)、與蛋白質(zhì)結(jié)合的碳水化合物或者與蛋白質(zhì)結(jié)合的小分子。如本文所使用的，“非線性”是指能夠轉(zhuǎn)變?nèi)肷涔馐?也稱為基本光束)的頻率的光學(xué)技術(shù)。非線性光束是由這樣的轉(zhuǎn)變所產(chǎn)生的更高階頻率的光束，例如二次諧波。在二次諧波、和頻或差頻產(chǎn)生中，非線性光束相干地(coherently)產(chǎn)生。在二次諧波產(chǎn)生(SHG)中，基本光束(fundamentalbeam)的兩個光子幾乎被界面散射，從而產(chǎn)生二次諧波的一個光子。在本文中也稱為“非線性光學(xué)的”或“表面選擇性非線性的”。如本文所使用的術(shù)語“非線性活性的”或“非線性地活性的”也指分子、粒子、界面或相在受到一個或多個入射輻射束驅(qū)動時產(chǎn)生非線性光輻射的能力的一般性質(zhì)。當本文中提及非線性光學(xué)方法時，“檢測”是指這樣的技術(shù)，通過該技術(shù)，表面選擇性非線性光輻射的性質(zhì)可用于檢測、測量探針-靶標相互作用(例如蛋白質(zhì)與候選調(diào)節(jié)劑化合物之間的相互作用)的性質(zhì)或該相互作用的效應(yīng)，或?qū)⒃撔再|(zhì)或效應(yīng)與非線性光學(xué)光的性質(zhì)(例如，強度、波長、偏振或其他與電磁輻射所共有的性質(zhì))相關(guān)聯(lián)。如本文所使用的，術(shù)語“構(gòu)象變化”指生物物質(zhì)(例如，蛋白質(zhì)，如酶)的結(jié)構(gòu)構(gòu)象的改變。如本文所使用的，術(shù)語“蛋白質(zhì)”包括多肽、肽、多肽的片段和融合多肽。如本文所使用的，術(shù)語“調(diào)節(jié)劑”是指改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象(如通過SHG所檢測到的)的任何物質(zhì)(例如，小分子化合物、肽、蛋白質(zhì)等)。如本文所使用的，“界面”是產(chǎn)生非線性光信號的區(qū)域，或者其中存在具有凈取向的經(jīng)二次諧波活性部分標記的靶標的表面附近的區(qū)域。界面也可由兩個表面、與不同介質(zhì)接觸的表面(例如，與水溶液接觸的玻璃表面、與緩沖液接觸的細胞表面)或者兩個具有不同物理或化學(xué)性質(zhì)的介質(zhì)之間的接觸區(qū)附近的區(qū)域所組成。除非本文中另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的相同的含義。除非上下文另有明確說明，如本文所使用的單數(shù)術(shù)語“一種”、“一個”和“所述(該)”包括復(fù)數(shù)指代。在整個說明書中給出的每一最大數(shù)值限值意在包括每個低于其的數(shù)值限值，如同所述低于其的數(shù)值限值在此明確地寫出。在整個說明書中給出的每一最小數(shù)值限值包括每個高于其的數(shù)值限值，如同所述高于其的數(shù)值限值在此明確地寫出。整個說明書中給出的每一數(shù)值范圍將包括每一個落在該較寬數(shù)值范圍內(nèi)的更窄的數(shù)值范圍，如同所述更窄的數(shù)值范圍均在此明確地寫出。III.組成A.用于所公開的方法的靶蛋白用于本文所述的任何方法的靶蛋白可以是來自任何天然來源的天然存在的物質(zhì)，或其亞單位或結(jié)構(gòu)域，包括病毒、微生物(包括細菌、真菌、藻類和原生動物)、無脊椎動物(包括昆蟲和蠕蟲)、動物的正常或病理性細胞、脊椎動物(例如，哺乳動物、禽類或魚類，以及在哺乳動物中，例如人、猿、猴、牛、豬、山羊、羊駝、綿羊、大鼠、小鼠、兔、豚鼠、貓和狗)或者正常的或病理性的植物細胞?；蛘撸械鞍卓梢允且呀?jīng)在體外產(chǎn)生或者經(jīng)修飾(例如通過突變、嵌合蛋白或人工蛋白質(zhì))的非天然存在的蛋白質(zhì)。靶蛋白可以是糖蛋白、脂蛋白、磷蛋白或金屬蛋白。靶蛋白可以是核蛋白質(zhì)、細胞質(zhì)蛋白質(zhì)、膜相關(guān)蛋白質(zhì)或者分泌的蛋白質(zhì)。靶蛋白并不需要是單個大分子。例如，靶蛋白可以是大分子的同質(zhì)或異質(zhì)多聚體(例如但不限于二聚體、三聚體或四聚體)。此外，靶蛋白可能需要一個或多個配體來行使生理功能，例如其他蛋白質(zhì)、寡肽或多肽、核酸、碳水化合物、脂質(zhì)或有機或無機小分子或離子。其他的實例包括輔因子、核糖體、多核糖體和染色質(zhì)?？捎糜诒疚墓_的任何方法的靶蛋白的生物學(xué)活性并不限于特定的活性，例如受體或酶活性。靶蛋白的非限制性實例包括核受體、孤兒核受體、酪氨酸激酶受體、內(nèi)皮素、促紅細胞生成素受體、FAS配體受體、蛋白激酶(例如，蛋白激酶C、酪氨酸激酶、絲氨酸激酶、蘇氨酸激酶、核苷酸激酶或多核苷酸激酶)、蛋白磷酸酶(絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶、酪氨酸磷酸酶、核苷酸磷酸酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶或焦磷酸酶)、細胞周期調(diào)節(jié)劑(細胞周期蛋白cdk2、CDC2、CDC25、P53、RB)、GTP酶、Rac、Rho、Rab、Ras、內(nèi)切蛋白酶、外切蛋白酶(exoprotease)、金屬蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、核酸酶、聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、整合酶、離子通道、伴侶蛋白(即，熱休克蛋白)、脫氨酶、核酸酶(例如脫氧核糖核酸酶、核糖核酸酶、內(nèi)切核酸酶、外切核酸酶)、端粒酶、引發(fā)酶、解旋酶、脫氫酶、轉(zhuǎn)移酶(肽基轉(zhuǎn)移酶、轉(zhuǎn)氨酶、糖基轉(zhuǎn)移酶、核糖基轉(zhuǎn)移酶(ribosyltransferases)、乙酰基轉(zhuǎn)移酶、鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶或甲基轉(zhuǎn)移酶)、水解酶、羧化酶、異構(gòu)酶、糖苷酶、脫氨酶、脂肪酶、酯酶、硫酸酯酶、纖維素酶、裂合酶、還原酶、連接酶或細胞泛素化途徑的加工酶(如E1、E2或E3酶或去泛素化酶)。在一些實施方案中，可用于本文公開的任何方法的靶蛋白可以是選自病毒蛋白質(zhì)、細菌蛋白質(zhì)、植物蛋白質(zhì)、動物蛋白質(zhì)和人蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，靶蛋白可以是病毒蛋白質(zhì)，例如但不限于流感病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、禽流感病毒、埃博拉(Ebola)病毒、SARS病毒、漢坦病毒或東方馬腦炎病毒的蛋白質(zhì)。在本文提供的任何方法的一些方面，靶蛋白是受體。術(shù)語“受體”包括表面和細胞內(nèi)受體。在一些實施方案中，靶蛋白是核受體。核受體是一類配體激活的轉(zhuǎn)錄激活物。這些受體被組織成為用于配體結(jié)合、二聚化、反式激活和DNA結(jié)合的獨特結(jié)構(gòu)域。類固醇受體家族是由糖皮質(zhì)激素、鹽皮質(zhì)激素、雄激素、孕激素和雌激素的受體組成的大家族。當配體結(jié)合時發(fā)生受體激活，其誘導(dǎo)構(gòu)象變化，從而允許受體二聚化和輔激活蛋白的結(jié)合。這些輔激活物轉(zhuǎn)而又促進受體與DNA的結(jié)合以及后續(xù)的靶基因的轉(zhuǎn)錄激活。除了輔激活蛋白的募集，配體的結(jié)合也被認為將受體置于替換或阻止作為受體功能的協(xié)阻抑物的蛋白質(zhì)的結(jié)合的構(gòu)象中。如果配體是藥理學(xué)激動劑，則新的構(gòu)象是與生物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的其他組分例如轉(zhuǎn)錄因子相互作用從而在靶組織中引起生物響應(yīng)的構(gòu)象。如果配體是藥理學(xué)拮抗劑，則新的構(gòu)象是其中受體不能被一種或多種激動劑激活(在其他情況下，該激動劑能夠激活該受體)的構(gòu)象。NR的非詳盡清單描述于國際專利申請公開號2006/046134中，該申請的公開內(nèi)容通過引用并入本文(參見第14和15頁以及圖1)。在一些實施方案中，可用于本文公開的任何方法的NR可選自雌激素受體、雄激素受體、糖皮質(zhì)激素受體、視黃酸受體α(RARG)、視黃酸X受體(RXR)、過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)、肝X受體α(LXRG)或孕酮受體。在一些方面，可用于本文所述的任何方法的靶蛋白是G蛋白偶聯(lián)受體(也稱為七跨膜域受體)?！癎蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)”是指通過與G蛋白偶聯(lián)而介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的受體的超家族的任何成員。GPCR包括跨膜受體蛋白的大家族(占人類總基因組的約5％)，這些蛋白質(zhì)與在細胞外環(huán)境中存在的分子相結(jié)合并且能夠在細胞內(nèi)觸發(fā)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)并最終引發(fā)細胞應(yīng)答。GPCR僅發(fā)現(xiàn)于真核生物中，包括酵母、領(lǐng)鞭蟲類和動物。結(jié)合并激活這些受體的分子包括但不限于光敏化合物、氣味、信息素、激素以及神經(jīng)遞質(zhì)，并且其大小從小分子到肽直至大的蛋白質(zhì)不等。影響胞質(zhì)鈣水平的一類GPCR的一個實例通過Gq類型的G蛋白發(fā)揮作用，該Gq類型的G蛋白激活磷脂酶C(PLC)途徑，導(dǎo)致磷酸肌醇的水解以產(chǎn)生兩類不同的第二信使，即，二?；视秃图〈剂姿?。二酰基甘油轉(zhuǎn)而激活某些蛋白酶C(PKC)，而肌醇磷酸(例如但不限于IP3)刺激鈣從細胞內(nèi)儲庫(store)如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、肌漿網(wǎng)(對于肌細胞)和/或線粒體的運動。GPCR僅發(fā)現(xiàn)于真核生物中，這包括酵母、領(lǐng)鞭蟲類和動物。結(jié)合并激活這些受體的分子包括但不限于光敏化合物、氣味、信息素、激素以及神經(jīng)傳遞質(zhì)，并且其大小從小分子到肽直至大的蛋白質(zhì)不等。可用于本文公開的方法的GPCR包括但不限于：Gq蛋白或Gq/11、α-1腎上腺素能受體(α1-AR)、硬骨魚緊張肽(UT)受體、5-HT2和5-HT6血清素受體、下丘泌素(食欲素)受體、組胺HI受體、緩激肽B1和B2受體、鈴蟾肽BB2受體、P2Y嘌呤能受體、乙酰膽堿受體(例如，M1、M3和M5)、mGluR5谷氨酸受體、加壓素V2和VI受體、血管緊張素AGTR1受體、膽囊收縮素CCKAR和CCKBR受體、內(nèi)皮素ENDRA受體、生長素釋放肽GHSRla受體、褪黑激素MTNR1A受體、神經(jīng)降壓肽NTSR1受體、血小板活化因子PTAFR受體、促黃體激素受體(LHR)、促卵泡激素受體(FSHR)、促性腺激素釋放激素受體(GnRHR)和催乳素釋放肽受體PRLHR受體。在一些實施方案中，GPCR在表達鈣傳感蛋白的細胞中內(nèi)源性表達。在其他實施方案中，GPCR在表達鈣傳感蛋白的細胞中異源性表達。在其他方面中，可用于本發(fā)明的方法的靶蛋白可以是激酶。激酶是將磷酸基團從高能供體分子如ATP轉(zhuǎn)移到特定底物的一類酶，這一過程被稱為磷酸化。最大的激酶群體之一是蛋白激酶，其作用于并改變特定蛋白質(zhì)的活性。激酶廣泛地用于傳送信號并控制細胞中的復(fù)雜過程。在人類中已經(jīng)鑒別了超過500種不同的激酶。它們的龐大的多樣性及其在信號傳導(dǎo)中的作用使得它們成為尤其針對以異常激酶表達或調(diào)節(jié)為特征的疾病狀態(tài)的研究的對象。蛋白激酶含有大的柔性環(huán)，稱為激活環(huán)或A-環(huán)，其構(gòu)象被認為是調(diào)節(jié)激酶活性。在許多激酶中，A-環(huán)的構(gòu)象由該區(qū)域內(nèi)的特定殘基的磷酸化來控制(Johnson1996)。激活環(huán)通常開始于保守的AspPheGly序列并終止于保守的AlaProGlu。在失活激酶的結(jié)構(gòu)中，該環(huán)通常阻斷底物或ATP結(jié)合位點(Hubbard1994；Mohammadi1996；和McTigue1999)。酪氨酸激酶通常在環(huán)內(nèi)具有一個或兩個酪氨酸，MAPK激酶具有在T和Y上都被磷酸化的T[DE]Y基序，而大多數(shù)其他激酶在環(huán)內(nèi)具有蘇氨酸。可用于本發(fā)明的方法的靶蛋白廣泛地適用于任何蛋白激酶。其可以包括蛋白質(zhì)酪氨酸激酶和蛋白質(zhì)絲氨酸激酶。蛋白質(zhì)酪氨酸激酶的非限制性實例是pp60c-src、p56lck、ZAP激酶、血小板衍生生長因子受體酪氨酸激酶、Bcr-Abl、VEGF(血管內(nèi)皮生長因子)受體酪氨酸激酶和表皮生長因子受體酪氨酸激酶和表皮生長因子受體樣酪氨酸激酶。適用于本發(fā)明的絲氨酸蛋白激酶的非限制性實例包括MAP(促分裂原活化蛋白)激酶、蛋白激酶C、蛋白激酶A、Akt和CDK(細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶)。在哺乳動物生物學(xué)中，屬于促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族的蛋白激酶在多種與ras基因的突變和生長因子受體的失調(diào)相關(guān)的增殖性細胞疾病(例如，癌癥)中被不當?shù)丶せ?Magnuson等,SeminarsinCancerBiology,5:247-252(1994))。MAP激酶在本領(lǐng)域中是已知的，并且此類激酶的部分非限制性清單包括abl、Aurora-A、Aurora-B、Aurora-C、ATK、bcr-abl、Blk、Brk、Btk、c-Kit、c-Met、c-Src、CDK1、CDK2、CDK4、CDK6、cRafl、CSF1R、CSK、EGFR、ErbB2、ErbB3、ErbB4、ERK、Fak、fes、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FGFR5、Fgr、FLK-4、Flt-1、Fms、Fps、Frk、Fyn、Hck、IGF-1R、INS-R、Jak、KDR、Lck、Lyn、MEK、p38、PDGFR、PIK、PKC、PYK2、Ros、Tiel、Tie2、Trk、Yes和Zap70。在本文所述方法的一些實施方案中，所述激酶是abl激酶。對于激酶，已知幾種類型的化合物調(diào)節(jié)激酶的功能。例如，I型激酶抑制劑識別激酶的活性構(gòu)象。它們通過呈現(xiàn)模擬由ATP通常形成的氫鍵的一至三個氫鍵而與ATP結(jié)合位點結(jié)合。不受限于理論，據(jù)認為，與I型激酶抑制劑相反，II型激酶抑制劑識別激酶的非活性構(gòu)象，并且能夠通過占據(jù)直接與ATP結(jié)合位點相鄰的疏水口袋而間接地與ATP競爭。該疏水口袋是由激活環(huán)的獨特DFG-外(DFG-out)構(gòu)象創(chuàng)建的。某些II型抑制劑能夠直接與ATP結(jié)合位點形成氫鍵，但這不是功能性所必需的(Gotink和Verheul,Angiogenesis,2010,13(1):1–14)。在另一方面，III型激酶抑制劑是非ATP競爭性激酶抑制劑，其通過與激活環(huán)以外的位點結(jié)合(即通過與激酶上的變構(gòu)位點結(jié)合)來調(diào)節(jié)激酶活性。由于III型化合物與激酶上的保守性較低的位點結(jié)合，它們是高度選擇性的并且在研究和藥物發(fā)現(xiàn)團體中受到越來越多的關(guān)注。也預(yù)計在本發(fā)明的方法的范圍內(nèi)使用的是靶蛋白的突變形式。如本文中所用的“突變”包括在定義的一級氨基酸序列如靶蛋白的一級氨基酸序列中的至少一個氨基酸殘基的氨基酸殘基缺失、氨基酸殘基插入和/或氨基酸殘基置換。氨基酸“置換”意指定義的一級氨基酸序列的至少一個氨基酸組分被另一個氨基酸(例如，半胱氨酸殘基或賴氨酸殘基)替換。通過標準技術(shù)將突變或置換工程化至靶蛋白的一級氨基酸序列內(nèi)的方法在本領(lǐng)域中是公知的。可用于本文描述的方法的靶蛋白可包括保守置換。保守置換在下面的“氨基酸置換表”中的“優(yōu)選置換”標題下示出。如果置換導(dǎo)致生物學(xué)活性的改變，則可以引入更多的實質(zhì)性改變，在下表中命名為“示例性置換”，或者如下文針對氨基酸類別進一步描述的。潛在的氨基酸置換原殘基示例性置換優(yōu)選置換Ala(A)Val；Leu；IleValArg(R)Lys；Gln；AsnLysAsn(N)Gln；His；Asp,Lys；ArgGlnAsp(D)Glu；AsnGluCys(C)Ser；AlaSerGln(Q)Asn；GluAsnGlu(E)Asp；GlnAspGly(G)AlaAlaHis(H)Asn；Gln；Lys；ArgArgIle(I)Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸LeuLeu(L)正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；PheIleLys(K)Arg；Gln；AsnArgMet(M)Leu；Phe；IleLeuPhe(F)Trp；Leu；Val；Ile；Ala；TyrTyrPro(P)AlaAlaSer(S)ThrThrThr(T)Val；SerSerTrp(W)Tyr；PheTyrTyr(Y)Trp；Phe；Thr；SerPheVal(V)Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸Leu靶蛋白的生物學(xué)性質(zhì)的實質(zhì)性改變通過選擇置換來完成，該置換在其對維持以下方面的作用上顯著不同：(a)在置換區(qū)域中的多肽骨架的結(jié)構(gòu)，例如作為片層或螺旋構(gòu)象，(b)分子在靶位點處的電荷或疏水性，或(c)側(cè)鏈的體積(bulk)。非保守置換將需要將這些類別之一的成員更換成另一類別的成員。在其他實施方案中，可用于本文公開的任何方法的突變體靶蛋白可包含一個或多個非天然存在的或修飾的氨基酸?！胺翘烊淮嬖诘陌被釟埢笔侵赋衔牧谐龅哪切┨烊淮嬖诘陌被釟埢獾臍埢?，其能夠共價結(jié)合多肽鏈中的鄰近氨基酸殘基。非天然氨基酸包括但不限于高賴氨酸、高精氨酸、高絲氨酸、氮雜環(huán)丁烷羧酸、2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、β-丙氨酸、氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基異丁酸、3-氨基異丁酸、2-氨基庚二酸、叔丁基甘氨酸、2,4-二氨基異丁酸、鎖鏈素、2,2'-二氨基庚二酸、2,3-二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、高脯氨酸、羥賴氨酸、別羥基賴氨酸、3-羥基脯氨酸、4-羥基脯氨酸、異鎖鏈素、別異亮氨酸、N-甲基丙氨酸、N-甲基甘氨酸、N-甲基異亮氨酸、N-甲基戊基甘氨酸、N-甲基纈氨酸、萘丙氨酸(naphthalanine)、正纈氨酸、正亮氨酸、鳥氨酸、瓜氨酸、戊基甘氨酸、六氫吡啶羧酸和硫代脯氨酸。修飾的氨基酸包括天然的和非天然的氨基酸，其被可逆地或不可逆地化學(xué)阻斷，或在其N-末端氨基或其側(cè)鏈基團上被修飾，例如，N-甲基化的D和L氨基酸，側(cè)鏈官能團被化學(xué)修飾成另一個官能團。例如，修飾的氨基酸包括甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸砜、天冬氨酸-(β-甲酯)(其為天冬氨酸的修飾的氨基酸)、N-乙基甘氨酸(其為甘氨酸的修飾的氨基酸)，或丙氨酸羧酰胺，和丙氨酸的修飾的氨基酸。另外的非天然和修飾的氨基酸以及將其摻入至蛋白質(zhì)和肽中的方法在本領(lǐng)域中是已知的(參見，例如Sandberg等,(1998)J.Med.Chem.41:2481-91；Xie和Schultz(2005)Curr.Opin.Chem.Biol.9:548-554；Hodgson和Sanderson(2004)Chem.Soc.Rev.33:422-430)。在一些實施方案中，可用于本文描述的方法的突變靶蛋白可以通過適當?shù)募兓桨甘褂脴藴实鞍踪|(zhì)純化技術(shù)從細胞(如癌細胞)中分離。在另一實施方案中，可用于本文描述的方法的突變靶蛋白通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生。作為重組表達的替代，供本文所述方法使用的突變靶蛋白可以使用標準肽合成技術(shù)進行化學(xué)合成。B.供鑒別靶蛋白的變構(gòu)調(diào)節(jié)劑的方法使用的試劑在一些方面，可用于本文所述的方法的試劑可以是靶蛋白的未知候選變構(gòu)調(diào)節(jié)劑?？捎糜诒疚乃龅姆椒ǖ脑噭┛梢允侨魏涡》肿踊瘜W(xué)化合物、抗體、非抗體多肽、碳水化合物、抑制性核酸或它們的任意組合。在一些實施方案中，該試劑是抗體(如人源化抗體)或其片段?；蛘?，該試劑可以是小分子化合物。在其他實施方案中，該試劑可以是非抗體多肽(如分離的非抗體多肽)。在一些實施方案中，該試劑是肽(例如，分離的肽)。1.非抗體結(jié)合性多肽在一些方面，可用于本文所述的方法的試劑是非抗體結(jié)合性多肽。結(jié)合性多肽是與靶蛋白(如本文所述的任何靶蛋白)結(jié)合(優(yōu)選特異性結(jié)合)的多肽。結(jié)合性多肽可以使用已知的多肽合成方法進行化學(xué)合成，或者可以使用重組技術(shù)進行制備及純化。結(jié)合性多肽通常是至少約5個氨基酸的長度，或者至少約6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100個氨基酸的長度或更長，其中這樣的結(jié)合性多肽能夠與野生型或突變型靶蛋白結(jié)合(優(yōu)選特異性地結(jié)合)。使用公知的技術(shù)無需進行過度實驗即可鑒別結(jié)合性多肽。在這方面，應(yīng)當指出，針對能夠與多肽靶標結(jié)合的結(jié)合性多肽篩查多肽文庫的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的(參見，例如，美國專利第5,556,762號、第5,750,373號、第4,708,871號、第4,833,092號、第5,223,409號、第5,403,484號、第5,571,689號、第5,663,143號；PCT公開號WO84/03506和WO84/03564；Geysen等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81:3998-4002(1984)；Geysen等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,82:178-182(1985)；Geysen等,于SyntheticPeptidesasAntigens,130-149(1986)；Geysen等,J.Immunol.Meth.,102:259-274(1987)；Schoofs等,J.Immunol.,140:611-616(1988)；Cwirla,S.E.等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:6378；Lowman,H.B.等(1991)Biochemistry,30:10832；Clackson,T.等,(1991)Nature,352:624；Marks,J.D.等(1991),J.Mol.Biol.,222:581；Kang,A.S.等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:8363；和Smith,G.P.(1991)CurrentOpin.Biotechnol.,2:668)。噬菌體(phage)展示是一種公知技術(shù)，其允許篩查大的多肽文庫以鑒別這些文庫中能夠與靶多肽(如可用于本文公開的方法的野生型或突變型靶蛋白)結(jié)合的成員。噬菌體展示是這樣一種技術(shù)：通過該技術(shù)使變體多肽在噬菌體顆粒表面上展示為與外殼蛋白的融合蛋白(Scott,J.K.和Smith,G.P.(1990)Science,249:386)。噬菌體展示的應(yīng)用性在于以下事實：能夠針對那些與靶分子高親和力結(jié)合的序列，快速而高效地分選選擇性隨機化的蛋白質(zhì)變體(或隨機克隆的cDNA)的大型文庫。肽(Cwirla,S.E.等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:6378)或蛋白質(zhì)(Lowman,H.B.等(1991)Biochemistry,30:10832；Clackson,T.等(1991)Nature,352:624；Marks,J.D.等(1991),J.Mol.Biol.,222:581；Kang,A.S.等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:8363)文庫在噬菌體上的展示已經(jīng)用于在數(shù)百萬種多肽或寡肽中篩選那些具有特定結(jié)合性質(zhì)的多肽或寡肽(Smith,G.P.(1991)CurrentOpin.Biotechnol.,2:668)。對隨機突變體的噬菌體文庫的分選需要用于構(gòu)建和繁殖大量變體的策略、使用靶受體進行親和純化的程序和評價結(jié)合富集結(jié)果的手段。參見美國專利第5,223,409號、第5,403,484號、第5,571,689號和第5,663,143號。盡管大多數(shù)噬菌體展示方法使用了絲狀噬菌體，但是λ形噬菌體展示系統(tǒng)(WO95/34683；U.S.5,627,024)、T4噬菌體展示系統(tǒng)(Ren等,Gene,215:439(1998)；Zhu等,CancerResearch,58(15):3209-3214(1998)；Jiang等,Infection&Immunity,65(11):4770-4777(1997)；Ren等,Gene,195(2):303-311(1997)；Ren,ProteinSci.,5:1833(1996)；Efimov等,VirusGenes,10:173(1995))和T7噬菌體展示系統(tǒng)(Smith和Scott,MethodsinEnzymology,217:228-257(1993)；U.S.5,766,905)也是已知的。額外的改進提高了展示系統(tǒng)針對與選定的靶分子的結(jié)合來篩查肽文庫和展示功能性蛋白質(zhì)的能力，其具有針對所需性質(zhì)篩選這些蛋白質(zhì)的潛力。已開發(fā)了用于噬菌體展示反應(yīng)的組合反應(yīng)裝置(WO98/14277)，并且噬菌體展示文庫已經(jīng)用于分析和控制生物分子相互作用(WO98/20169；WO98/20159)和受約束的螺旋肽的性質(zhì)(WO98/20036)。WO97/35196描述了分離親和配體的方法，其中噬菌體展示文庫與一種溶液(其中的配體將與靶分子結(jié)合)和第二溶液(其中的親和配體將不會與靶分子結(jié)合)接觸，以選擇性地分離結(jié)合配體。WO97/46251描述了這樣一種方法：用親和純化的抗體對隨機噬菌體展示文庫進行生物淘選，然后分離結(jié)合噬菌體，隨后是使用微孔板孔來分離高親和力結(jié)合噬菌體的微淘選過程。金黃色葡萄球菌蛋白A作為親和標簽的應(yīng)用也已經(jīng)被報道(Li等(1998)MolBiotech.,9:187)。WO97/47314描述了使用底物消減文庫來區(qū)別酶特異性，其中使用組合文庫，該組合文庫可以是噬菌體展示文庫。WO97/09446中描述了一種利用噬菌體展示來選擇適用于去污劑中的酶的方法。美國專利第5,498,538號、第5,432,018號和WO98/15833中描述了其他選擇特異性結(jié)合蛋白質(zhì)的方法。美國專利第5,723,286號、第5,432,018號、第5,580,717號、第5,427,908號、第5,498,530號、第5,770,434號、第5,734,018號、第5,698,426號、第5,763,192號和第5,723,323號中也公開了產(chǎn)生肽文庫和篩查這些文庫的方法?？梢孕揎椊Y(jié)合性多肽以增強其抑制效果(包括，例如，增強的親和力，改善的藥代動力學(xué)性質(zhì)，例如半衰期、穩(wěn)定性和清除率，降低的毒性等)。這樣的修飾包括，例如，糖基化、聚乙二醇化、用非天然存在的但是在功能上等同的氨基酸置換、連接基團等。2.小分子在一些方面，可用于本文所述的方法的試劑是小分子化學(xué)化合物。該小分子優(yōu)選為除本文定義的結(jié)合性多肽或抗體以外的有機分子，其與野生型或突變型靶蛋白結(jié)合(優(yōu)選特異性地結(jié)合)。有機小分子可以使用已知的方法進行鑒別和化學(xué)合成(參見，例如，PCT公開號WO00/00823和WO00/39585)。有機小分子通常是小于約2000道爾頓的大小，或者小于約1500、750、500、250或200道爾頓的大小，其中能夠與野生型或突變型靶蛋白結(jié)合(優(yōu)選特異性結(jié)合)的此類有機小分子可以使用公知的技術(shù)進行鑒別而無需過度實驗。在這方面，應(yīng)當指出，針對能夠與多肽靶標結(jié)合的分子篩查有機小分子文庫的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的(參見，例如PCT公開號WO00/00823和WO00/39585)。有機小分子可以是，例如，醛、酮、肟、腙、縮氨基脲、卡巴肼、伯胺、仲胺、叔胺、N-取代的酰肼、酰肼、醇、醚、硫醇、硫醚、二硫化物、羧酸、酯、酰胺、脲、氨基甲酸酯、碳酸酯、縮酮、硫縮酮、縮醛、硫縮醛、芳基鹵化物、芳基磺酸酯、烷基鹵化物、烷基磺酸酯、芳族化合物、雜環(huán)化合物、苯胺、烯烴、炔烴、二醇、氨基醇、噁唑烷、噁唑啉、噻唑烷、噻唑啉、烯胺、磺酰胺、環(huán)氧化物、氮丙啶、異氰酸酯、磺酰氯、重氮化合物、?；鹊?。在一些方面，小分子化學(xué)化合物是組合化學(xué)文庫的組分。組合化學(xué)文庫是多個種類的由較小亞單位或單體組成的化學(xué)化合物的集合。組合文庫有多種大小，從數(shù)百到成百上千種不同的化學(xué)化合物種類不等。也存在多種文庫類型，包括由化合物(例如碳水化合物、寡核苷酸和有機小分子等)組成的低聚和多聚文庫。此類文庫具有多種用途，例如化學(xué)化合物的固定和色譜分離，以及用于識別和表征能夠結(jié)合受體分子(如c-met蛋白質(zhì))或能夠介導(dǎo)目的生物活性(例如但不限于細胞增殖的抑制)的配體的用途。用于在固相載體上合成化合物文庫的各種技術(shù)在本領(lǐng)域中是已知的。固相載體通常是具有表面的聚合物體，該表面被官能化以與亞單位或單體結(jié)合從而形成文庫的化合物。一個文庫的合成通常涉及大量的固相載體。為制備組合文庫，固相載體與化合物的一個或多個亞單位反應(yīng)并以仔細控制的、預(yù)定的化學(xué)反應(yīng)順序與一個或多個數(shù)目的試劑反應(yīng)。換句話說，文庫亞單位在固相載體上“生長”。文庫越大，所需的反應(yīng)數(shù)目越大，從而使追蹤組成文庫的多個種類的化合物的化學(xué)組成的任務(wù)變得復(fù)雜。在一些實施方案中，小分子是小于約2000道爾頓的大小，或者小于約1500、750、500、250或200道爾頓的大小。在本文任何方面所述的小分子試劑可源自能夠在固相載體上進行的任何類型的化學(xué)反應(yīng)。此類化學(xué)反應(yīng)包括但不限于，包括丁二烯的捕獲的2+2環(huán)加成；包括異噁唑啉、呋喃和修飾肽的合成的[2+3]環(huán)加成；包括二醇、醛和酮的固定化的乙縮醛形成；包括醛衍生化、丙二醇合成的醛醇縮合；包括醛衍生化的安息香縮合；包括苯二氮和乙內(nèi)酰脲、噻唑烷、轉(zhuǎn)角(turn)模擬物、卟啉、酞菁的環(huán)縮合；包括二酯環(huán)化的Dieckmann環(huán)化；包括丙烯酸衍生化的Diels-Alder反應(yīng)；包括醇加成到烯烴上的親電加成；包括醛衍生化的格氏反應(yīng)(Grignardreaction)；包括二取代烯烴合成的Heck反應(yīng)；包括原位合成氧化腈(見2+3環(huán)加成)的Henry反應(yīng)；包括信息素和肽合成的催化氫化(烯烴的氫化)；包括硫酮、雙環(huán)[2.2.2]辛烷合成的邁克爾反應(yīng)(Michaelreaction)；包括芳基醚、肽基膦酸酯和硫醚合成的光延反應(yīng)(Mitsunobureaction)；包括喹諾酮合成的親核芳香族取代；包括醛和酮合成的氧化；包括用戊炔醇環(huán)化降冰片二烯的Pausen-Khand環(huán)加成；包括螺烯合成的光化學(xué)環(huán)化；包括醛和酰氯的衍生化的與有機金屬化合物的反應(yīng)；以復(fù)合氫化物和錫化合物的還原，包括羰基、羧酸、酯和硝基的還原；包括羧基還原的Soai反應(yīng)；包括聯(lián)苯基衍生物合成的Stille反應(yīng)；包括取代環(huán)己酮合成的Stork反應(yīng)；包括喹諾酮合成的還原胺化；包括苯乙酸衍生物合成的Suzuki反應(yīng)；和包括醛、信息素和硫酮的反應(yīng)的Wittig-Horner反應(yīng)。公開了化學(xué)文庫的合成以及這些文庫的單個化合物向單個固相載體上訊號簡化(deconvolution)的參考文獻可見于美國專利申請第2009/0032592號；Needels等(1993),Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:10700-10704；以及WO97/15390。3.抗體在一些方面，可用于本文所述的方法的試劑是抗體?？贵w是與靶蛋白結(jié)合(優(yōu)選特異性地結(jié)合)的蛋白質(zhì)。抗體的變體可根據(jù)本領(lǐng)域中已知的信息而制備，而基本不影響抗體的活性。例如，抗體變體可以在抗體分子中有至少一個氨基酸殘基被不同的殘基所替代。對于抗體，對置換誘變來說最感興趣的位點通常包括高變區(qū)，但也考慮框架區(qū)(FR)的改變。對于抗體，一種類型的置換變體涉及置換親本抗體(例如人源化抗體或人抗體)中的一個或多個高變區(qū)殘基。通常，所得到的選擇用于進一步開發(fā)的變體相對于產(chǎn)生該變體的親本抗體具有改進的生物學(xué)性質(zhì)。用于生成此類置換變體的適宜的方式涉及使用噬菌體展示的親和力成熟。簡言之，對數(shù)個高變區(qū)位點(例如6-7個位點)進行突變，以在每個位點處產(chǎn)生所有可能的氨基酸置換。這樣產(chǎn)生的抗體由絲狀噬菌體顆粒展示為包裝在每個顆粒內(nèi)的與M13基因III產(chǎn)物的融合體。隨后根據(jù)如本文所公開的生物學(xué)活性(例如結(jié)合親和力)篩選噬菌體展示的變體。為了鑒別用于修飾的候選高變區(qū)位點，可以進行丙氨酸掃描誘變，以鑒別明顯有助于抗原結(jié)合的高變區(qū)殘基?？蓚溥x地或額外地，分析抗原-抗體復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)以鑒別抗體與抗原之間的接觸點可能是有益的。此類接觸殘基及鄰近殘基是按照本文詳述的技術(shù)進行置換的候選殘基。一旦產(chǎn)生這樣的變體，就如本文所述對這組變體進行篩選，并且可以選擇在一個或多個相關(guān)試驗中具有優(yōu)異性質(zhì)的抗體用于進一步開發(fā)。編碼抗體的氨基酸序列變體的核酸分子通過多種本領(lǐng)域已知的方法制備。這些方法包括但不限于，從天然來源分離(在天然存在的氨基酸序列變體的情況下)，或者通過對先前制備的抗體的變體或非變體形式進行寡核苷酸介導(dǎo)的(或定點)誘變、PCR誘變和盒式誘變而制備?？赡苄枰诒景l(fā)明的免疫球蛋白多肽的Fc區(qū)內(nèi)引入一個或多個氨基酸修飾，由此生成Fc區(qū)變體。Fc區(qū)變體可包含人Fc區(qū)序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc區(qū))，該Fc區(qū)序列在包括鉸鏈半胱氨酸在內(nèi)的一個或多個氨基酸位置處包含氨基酸修飾(例如置換)。在一個實施方案中，F(xiàn)c區(qū)變體可表現(xiàn)出改變的新生Fc受體(FcRn)結(jié)合親和力。這樣的變體Fc區(qū)可在Fc區(qū)的氨基酸位置238、252、253、254、255、256、265、272、286、288、303、305、307、309、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、386、388、400、413、415、424、433、434、435、436、439或447中的任意一個或多個位置處包含氨基酸修飾，其中Fc區(qū)中的殘基的編號是如Kabat中的EU索引的編號。與FcRn的結(jié)合降低的Fc區(qū)變體可在Fc區(qū)的氨基酸位置252、253、254、255、288、309、386、388、400、415、433、435、436、439或447中的任意一個或多個位置處包含氨基酸修飾，其中Fc區(qū)中的殘基的編號是如Kabat中的EU索引的編號?；蛘?，上述Fc區(qū)變體可以表現(xiàn)出增加的與FcRn的結(jié)合，并且在Fc區(qū)的氨基酸位置238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434中的任意一個或多個位置處包含氨基酸修飾，其中Fc區(qū)中的殘基的編號是如Kabat中的EU索引的編號。與FcR的結(jié)合降低的Fc區(qū)變體可以在Fc區(qū)的氨基酸位置238、239、248、249、252、254、265、268、269、270、272、278、289、292、293、294、295、296、298、301、303、322、324、327、329、333、335、338、340、373、376、382、388、389、414、416、419、434、435、437、438或439中的任意一個或多個位置處包含氨基酸修飾，其中Fc區(qū)中的殘基的編號是如Kabat中的EU索引的編號。例如，F(xiàn)c區(qū)變體可表現(xiàn)出降低的與FcRI的結(jié)合，并且在Fc區(qū)的氨基酸位置238、265、269、270、327或329中的任意一個或多個位置處包含氨基酸修飾，其中Fc區(qū)中的殘基的編號是如Kabat中的EU索引的編號。Fc區(qū)變體可表現(xiàn)出降低的與FcRII的結(jié)合，并且在Fc區(qū)的氨基酸位置238、265、269、270、292、294、295、298、303、324、327、329、333、335、338、373、376、414、416、419、435、438或439中的任意一個或多個位置處包含氨基酸修飾，其中Fc區(qū)中的殘基的編號是如Kabat中的EU索引的編號。Fc區(qū)變體可表現(xiàn)出降低的與FcRIII的結(jié)合，并且在Fc區(qū)的氨基酸位置238、239、248、249、252、254、265、268、269、270、272、278、289、293、294、295、296、301、303、322、327、329、338、340、373、376、382、388、389、416、434、435或437中的一個或多個位置處包含氨基酸修飾，其中Fc區(qū)中的殘基的編號是如Kabat中的EU索引的編號。具有改變的(即改善或削弱的)C1q結(jié)合和/或補體依賴性細胞毒性(CDC)的Fc區(qū)變體在國際專利申請?zhí)朩O99/51642中描述。這樣的變體可以在Fc區(qū)的氨基酸位置270、322、326、327、329、331、333或334中的一個或多個位置處包含氨基酸置換。關(guān)于Fc區(qū)變體，還可參見Duncan和Winter,Nature322:738-40(1988)；美國專利第5,648,260號；美國專利第5,624,821號；以及國際專利申請?zhí)朩O94/29351。C.二次諧波活性部分(例如，標記物)在本文所提供的任何方法的一些方面，用二次諧波活性部分或標記物(又稱作SHG-部分或SHG-標記物)標記野生型或突變型靶蛋白。二次諧波活性部分(例如，標記物)可以共價地或非共價地與靶蛋白結(jié)合，以使獲得的靶蛋白對二次諧波產(chǎn)生敏感并且適于使用表面選擇性技術(shù)進行界面研究。然后可以通過例如二次諧波產(chǎn)生或和頻產(chǎn)生的表面選擇性技術(shù)研究標記的靶蛋白。外源性部分(例如，標記物)可以預(yù)先連接到靶蛋白上，并且在進行測量前從標記的實體上分離任何未結(jié)合的或未反應(yīng)的標記物。在一個實施方案中，二次諧波活性部分(例如，標記物)在體外連接到靶蛋白上。用二次諧波活性部分(例如，標記物)標記靶蛋白允許直接的、光學(xué)手段，該手段在結(jié)合反應(yīng)(例如，能夠?qū)械鞍追€(wěn)定為活性或非活性構(gòu)象的試劑的結(jié)合)導(dǎo)致標記物的取向或構(gòu)象變化的情況下，使用表面選擇性非線性光學(xué)技術(shù)檢測靶蛋白的構(gòu)象變化。與使用熒光標記物的檢測不同，SHG-標記物具有重要的優(yōu)點，即僅有處于界面和具有凈取向的標記的靶蛋白產(chǎn)生二次諧波信號；不能連接到表面上的標記的靶蛋白不產(chǎn)生信號。因此，用于檢測SHG標記的靶蛋白分子在試劑結(jié)合時的構(gòu)象變化的信噪比總是不變地且一致性地高。在一些實施方案中，用SHG-活性部分(例如，標記物)原位(即，在連接到表面上之后)標記靶蛋白。在其他實施方案中，靶蛋白在連接到支持的脂雙層表面或支持的脂質(zhì)類似物雙層表面之后，用SHG-活性部分(例如，標記物)進行標記。在本發(fā)明的備選方面，可以使用至少兩種可區(qū)別的二次諧波活性部分(例如，標記物)。然后選擇連接的兩種或更多種可區(qū)別的標記物的取向以便有助于發(fā)出的相干非線性光束的明確定義的方向。所述兩種或更多種可區(qū)別的標記物能夠在如下的試驗中使用，在該試驗中，使用相對于樣品以一個或多個偏振方向入射的、處于一個或多個頻率的多個基本光束，得到至少兩個非線性光束的發(fā)射。在一個實施方案中，二次諧波活性部分(例如，標記物)包含多個單獨的二次諧波活性部分(例如，標記物)，其中每一個都具有非線性磁化性并且相對于彼此以固定和確定的方向結(jié)合在一起，以增加二次諧波活性部分(例如，標記物)的總非線性磁化性。1.二次諧波活性染料在本文所述方法的一些方面，二次諧波活性部分(例如，標記物)是染料。靶蛋白可用染料通過特異性標記或非特異性標記進行標記。二次諧波活性部分可通過特異性標記，例如通過共價鍵或氫鍵連接到靶蛋白上。例如，二次諧波活性部分(例如，標記物)可以共價地或非共價地連接到待檢測的靶蛋白的一級氨基酸序列中的胺基團、賴氨酸基團或巰基基團上。在一些實施方案中，二次諧波活性部分(例如，標記物)具有胺反應(yīng)性琥珀酰亞胺酯、硫醇反應(yīng)性馬來酰亞胺或醛和/或酮反應(yīng)性酰肼和羥胺。在一些實施方案中，SFG或SHG-活性染料標記物可以通過用于偶合到疊氮化物的“點擊化學(xué)法”進行綴合。用于綴合物形成的點擊化學(xué)法的細節(jié)在下列文獻中描述：“SynthesisandFunctionalizationofBiomoleculesviaClickChemistry,C.Schilling等，第15章，第355-378頁，于“ClickChemistryforBiotechnologyandMaterialsScience”J.Lahann(Ed),Wiley(2009)中。適于在本文公開的方法中用作二次諧波或和頻率活性部分(例如，標記物)的染料的實例包括但不限于：馬來酰亞胺標記物(例如PyMPO-MALEIMIDETM(1-(2-馬來酰亞胺基乙基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)噁唑-2-基)吡啶鎓甲磺酸鹽)，其在半胱氨酸殘基上特異性標記蛋白質(zhì))、PyMPO-NHS(其特異性標記賴氨酸殘基)、噁唑標記物(例如特異性標記胺的PyMPO-琥珀酰亞胺酯)、BADANTM(6-溴乙?；?2-二甲基氨基萘)和ACRYLODANTM(6-丙烯?；?2-二甲基氨基萘)。在其他實施方案中，標記物可以是基于香豆素的染料，例如但不限于酮基香豆素和3,3’-羰基雙(7-二乙氨基香豆素)。在其他實施方案中，標記物可以是PyMPO-SETM(1-(3-(琥珀酰亞胺氧羰基)芐基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)噁唑-2-基)吡啶鎓溴化物)。在本文公開的方法的一些方面，可以將靶蛋白的一級氨基酸序列中的天然氨基酸殘基突變?yōu)榛蛑脫Q為另一種能夠與二次諧波活性染料結(jié)合的氨基酸。如本文中所使用的，“突變”包括至少一個氨基酸殘基在確定的一級氨基酸序列(例如靶蛋白的一級氨基酸序列)中的氨基酸殘基缺失、氨基酸殘基插入和/或氨基酸殘基置換。氨基酸“置換”意指確定的一級氨基酸序列的至少一個氨基酸成分被另一個氨基酸(例如，半胱氨酸殘基或賴氨酸殘基)所替換。理想的是，在一級氨基酸序列中的一個或多個氨基酸殘基的突變或置換(例如，保守突變或置換)不會導(dǎo)致由該氨基酸序列編碼的靶蛋白的敏感性的實質(zhì)性改變，該敏感性是對于在與該靶蛋白的配體結(jié)合時或與能夠變構(gòu)地結(jié)合靶蛋白的未知候選試劑結(jié)合時經(jīng)歷構(gòu)象變化的敏感性。通過標準技術(shù)向蛋白質(zhì)(例如靶蛋白)的一級氨基酸序列中工程構(gòu)建突變或置換的方法是本領(lǐng)域中公知的。本文所述的靶蛋白可包括保守置換。保守置換在上文的“氨基酸置換表”中的“優(yōu)選置換”標題下示出。2.非天然氨基酸在其他方面，二次諧波活性部分(例如，標記物)可以是非天然氨基酸(UAA)。與常規(guī)的標記物不同，UAA提供了在隱蔽的和暴露的位點處均標記蛋白質(zhì)的手段。此外，作為蛋白質(zhì)的固有組分，它們可以相比于連接到氨基酸官能團(如半胱氨酸和胺)上的標記物(例如染料)以更高靈敏度和保真度報告結(jié)構(gòu)變化。UAA具有用于使用非線性技術(shù)(如二次諧波產(chǎn)生)來檢測蛋白質(zhì)的超極化性。因此，這些特定的非天然氨基酸也被稱為SHAA(“二次諧波氨基酸”)。使用UAA作為探針來檢測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)構(gòu)象變化的另一個優(yōu)點是，該檢測可以在體內(nèi)進行——也就是說，在活細胞中進行。例如，本文所述的方法可以用來檢測活細胞中的靶蛋白響應(yīng)于候選試劑的結(jié)合所表現(xiàn)出的構(gòu)象變化。通過使用相對于表面定向的靶蛋白的蛋白質(zhì)群體，可以使用包含UAA作為其氨基酸序列的一部分的靶蛋白建立在真實空間中實時的結(jié)構(gòu)或構(gòu)象變化的高度精確圖譜。理想的是，在一級氨基酸序列中一個或多個氨基酸殘基被UAA置換不導(dǎo)致由該氨基酸序列編碼的靶蛋白的敏感性的實質(zhì)性改變，該敏感性是對于在與GDP或GTP結(jié)合時或者在GTP水解時或者在與能夠結(jié)合靶蛋白并將其穩(wěn)定為非活性或活性構(gòu)象的未知候選試劑結(jié)合時經(jīng)歷構(gòu)象變化的敏感性。任何可超極化的UAA可以作為二次諧波活性部分(例如，標記物)用來通過本文所述的任意方法測量靶蛋白結(jié)構(gòu)在與候選試劑結(jié)合時的構(gòu)象變化。在一些實施方案中，所述UAA是Aladan(Cohen等,2002,Science,296:1700；Abbyad等,2007,J.Phys.Chem.,111:8269，其公開內(nèi)容通過引用整體并入本文)。在其他實施方案中，所述UAA是丹酰丙氨酸(Summerer等,Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.,2006,103(26):9785-9789)。在一個實施方案中，所述非天然氨基酸是和頻產(chǎn)生活性的(SFG-活性的)。如本文所使用的，“和頻產(chǎn)生活性的”是指具有超極化性并且可通過SFG檢測的SH活性標記物。在其他實施方案中，所述UAA不是可超極化的，但具有合適的一個或多個化學(xué)官能團，從而使其能夠結(jié)合二次諧波活性標記染料，例如上述任意染料。在其他實施方案中，所述UAA可包括具有定制的振動性質(zhì)的探針，用于工程構(gòu)建到蛋白質(zhì)內(nèi)的不連續(xù)位點，以通過SFG鑒別位點特異性構(gòu)象變化。在一些實施方案中，理想的是，用于包含在UAA內(nèi)的探針部分足夠小，以使其不擾亂天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，并且可以包括但不限于NO、CN、SCN或N3。在一些實施方案中，探針部分提供在約1900至2300cm-1的頻譜范圍內(nèi)的獨特振動特征(vibrationalsignature)，這與內(nèi)在蛋白質(zhì)的振動很好地分開。在另一實施方案中，UAA可用于將靶蛋白連接到表面上，使得二次諧波活性部分(例如，標記物)具有相對于表面的凈取向。相應(yīng)地，在一些方面，通過測量工程構(gòu)建到靶蛋白不同突變體的氨基酸序列內(nèi)的非天然氨基酸標記物或一系列此類標記物的傾斜角或絕對傾斜角，能夠?qū)崟r地和在真實空間中確定靶蛋白構(gòu)象的結(jié)構(gòu)變化。探針可以在靶蛋白內(nèi)的任何位點處或在其末端，或在其任何結(jié)構(gòu)域中引入。在一些實施方案中，靶蛋白可包括在化學(xué)上配備成與UAA共價反應(yīng)的二次諧波活性標記物。例如，如果引入蛋白質(zhì)內(nèi)的UAA是對乙酰基苯丙氨酸(pAcF)，則二次諧波活性染料將具有在其上適當?shù)幕瘜W(xué)反應(yīng)(chemistry)，以便與pAcF共價鍵合。在另一實施方案中，除了第二UAA以外還引入SHAA，該第二UAA(其通常不是二次諧波活性的)允許蛋白質(zhì)以定向方式在化學(xué)上垂直共價偶聯(lián)到表面上，該表面用適當?shù)幕瘜W(xué)反應(yīng)進行衍生化以便與所述第二UAA反應(yīng)。對于高度定向的SH-活性的靶蛋白樣品(使用這兩種UAA)，相較于不采用UAA產(chǎn)生SHG信號的靶蛋白，基線SHG信號和對比度(在構(gòu)象變化時的信號變化)均可以更大。在其他方面，利用本文公開的任意方法在靶蛋白的氨基酸序列中使用一個或多個UAA使得能夠通過確定靶蛋白內(nèi)一個或多個位點處的一個或多個標記物隨時間變化的傾斜角，來確定靶蛋白在與候選變構(gòu)調(diào)節(jié)劑結(jié)合后經(jīng)歷的實際構(gòu)象變化。靶蛋白的三維結(jié)構(gòu)可以如下確定：制備蛋白質(zhì)的一個或多個突變體，其各自含有放置在不同位置上的SHAA探針(即，對于每個突變體中的探針，可以確定每個突變體中探針相對于表面的取向，從而確定側(cè)鏈的取向，并且可以使用該信息構(gòu)建整體三維蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的模型)。由本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的空間位阻方法、統(tǒng)計方法、分子動力學(xué)、拉馬錢德蘭圖(Ramachandranplot)或能量最低化方法獲得的信息可被用于進一步幫助基于所測量的探針傾斜角來確定該結(jié)構(gòu)。對探針傾斜角的時間分辨測量產(chǎn)生蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化在實時發(fā)生時的運動圖像。由于SHG的(以及SFG的)實際上瞬時的響應(yīng)和靈敏度，特定探針的空間取向(例如，相對于表面的傾斜角或絕對傾斜角)可以在幾乎任何感興趣的時間尺度上被實時地測量。關(guān)于在SHG技術(shù)中使用UAA的進一步的信息可以在美國專利申請公開第2010/0068144號中找到，其公開內(nèi)容通過引用整體并入本文。D.界面在本文所公開的方法的一些方面，靶蛋白與固體表面結(jié)合或相對于界面定向，使得與靶蛋白結(jié)合的二次諧波活性標記物具有凈取向。正是這種凈取向在結(jié)合GTP或GDP時、在靶蛋白活性位點內(nèi)的GTP水解時或在能夠?qū)⑼蛔冃突蛞吧桶械鞍椎慕Y(jié)構(gòu)穩(wěn)定為非活性或活性構(gòu)象的候選試劑(條件是該試劑誘導(dǎo)標記的靶蛋白的結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化)結(jié)合時能夠改變。在一些實施方案中，界面可以由二氧化硅、玻璃、硅、聚苯乙烯、尼龍、塑料、金屬、半導(dǎo)體或絕緣體表面，或任何可以吸附或附著生物成分的表面制成。在不同的實施方案中，界面可以是汽-液界面、液-液界面、液-固或固-固界面。在一個實施方案中，該汽-液界面是空氣-水界面。在一個實施方案中，該液-液界面是油-水界面。在不同的實施方案中，該液-固界面是水-玻璃界面或苯-SiO2界面。在一些方面，界面還可以包括生物細胞和脂質(zhì)體表面。附著或固定可通過多種本領(lǐng)域公知的技術(shù)進行。例如，對于蛋白質(zhì)，表面可使用醛硅烷進行衍生化，以供與生物分子表面上的胺偶聯(lián)(MacBeath和Schreiber，2000——其相關(guān)部分通過引用并入本文)。BSA-NHS(BSA-N-羥基琥珀酰亞胺)表面也可以如下使用：首先使BSA的分子層附著到表面上，然后用N,N’-二琥珀酰亞胺碳酸酯將其活化。BSA上的活化的賴氨酸、天冬氨酸或谷氨酸殘基與蛋白質(zhì)上的表面胺反應(yīng)。也可使用支持的磷脂雙層，同時使用或不使用膜蛋白或其他膜相關(guān)成分，例如，Salafsky等，Biochemistry，1996——其相關(guān)部分通過引用并入本文，“Biomembranes”,Gennis,Springer-Verlag，Kalb等，1992，以及Brian等，1984，它們的相關(guān)部分通過引用并入本文。支持的磷脂雙層是本領(lǐng)域公知的，并且有許多技術(shù)可用于其制備，其中使用或不使用相關(guān)的膜蛋白。這些支持的雙層通常必須浸沒于水溶液中，以防止其在暴露于空氣時被破壞。在一些實施方案中，表面是脂質(zhì)類似物雙層表面。如果使用固體表面(例如，平面基底、珠子等)，其也可以通過多種化學(xué)反應(yīng)進行衍生化，以降低或提高其凈表面電荷密度，從而優(yōu)化對靶蛋白-候選變構(gòu)調(diào)節(jié)劑相互作用的檢測。在其他實施方案中，固體表面可以是玻璃表面、塑料表面、金屬表面、膠乳表面、橡膠表面、陶瓷表面、聚合物表面、聚丙烯表面、聚偏二氟乙烯表面、聚苯乙烯表面或聚乙烯表面(如聚乙二醇表面)。靶蛋白固定于其上的載體可以由廣泛的材料構(gòu)成，例如但不限于生物的、非生物的、有機的、無機的或任何上述這些的組合，以顆粒、鏈、沉淀物、凝膠、板片、管、球、容器、毛細管、墊、薄片、膜、板或載玻片形式存在。表面可以具有任何適宜的形狀，例如但不限于圓盤、正方形、球形或圓形。表面可以優(yōu)選是扁平的，但也可以采取多種備選的表面構(gòu)型。例如，表面可包含凸起的或凹陷的區(qū)域，樣品(例如蛋白質(zhì))位于其上。表面優(yōu)選地形成剛性支撐，在其上可以形成樣品。表面也選擇為用于提供適當?shù)奈馓匦?。例如，表面可以是但不限于聚合的LangmuirBlodgett膜、官能化的玻璃、Si、Ge、GaAs、GaP、SiO2、SiN4、改性硅，或多種凝膠或聚合物中的任何一種，例如(聚)四氟乙烯、(聚)偏氟乙烯、聚乙二醇、聚苯乙烯、聚碳酸酯或其組合。其他表面材料對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。在一個實施方案中，基底是平板玻璃或二氧化硅。在一些方面，表面可以用公知的技術(shù)進行蝕刻，以提供所需的表面特征。例如，通過形成溝槽、V形槽、臺面結(jié)構(gòu)等，可以將靶蛋白(如，蛋白質(zhì)的合成區(qū)域)更接近地置于照射光的焦點內(nèi)。表面也可設(shè)置有反射性“鏡子”結(jié)構(gòu)以使從中收集的發(fā)射最大化。作為另一實例，可以對表面進行蝕刻以形成孔。在本發(fā)明的另一方面，寡聚聚乙二醇(PEG)分子可用于將親和標記的靶蛋白固定于表面上以供SHG或SFG檢測。在一些實施方案中，PEG可以是SAT(PEG4)(N-琥珀酰亞胺基S-乙?；?硫代四乙二醇)。適于檢測SHG信號的PEG化的界面可以通過用寡聚PEG溶液涂覆合適的表面(如上述任何表面)而制備。在一個實施方案中，表面可以是玻璃。在另一實施方案中，表面可以是氨基封端的硅烷衍生化的玻璃。親和標簽是本領(lǐng)域中常見的，并且可以是，例如，組氨酸標簽(如His6標簽)、麥芽糖結(jié)合蛋白標簽、HA標簽、生物素標簽、硫醇標簽或GST標簽。在一些實施方案中，親和標簽是具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或更多個組氨酸殘基中任意書目的組氨酸。在一個實施方案中，寡聚PEG分子使用將會與靶蛋白上表達的親和標簽結(jié)合的試劑進行修飾。該試劑在組氨酸標簽的情況下可以是鎳，或者可以是糖(如麥芽糖)、抗體或本領(lǐng)域已知的任何其他能夠與親和標簽結(jié)合的分子。IV.本發(fā)明的方法A.二次諧波產(chǎn)生二次諧波產(chǎn)生(SHG)是非線性光學(xué)過程，其中與非線性材料相互作用的光子有效地“組合”以形成新的光子，新的光子具有初始光子的兩倍的能量，并且因此具有兩倍的頻率和一半的波長。這是和頻產(chǎn)生(SFG)的一種特殊情況。表面選擇性非線性光學(xué)(SSNLO)技術(shù)(例如SHG)允許在大體積物質(zhì)的存在下檢測界面分子或顆粒。強激光束(基本的)照射至一些樣品的界面上；如果該界面是非中心對稱的，則樣品能夠產(chǎn)生非線性光，即基本光的諧波?；净蚨沃C波束可以被容易地彼此分離，不像熒光技術(shù)中的典型情況(其中激發(fā)光和發(fā)射光由于斯托克斯位移(Stokesshift)而以更窄的差別被分離)。如果單獨的分子或顆粒1)是非線性活性的(具有超極化性)且2)臨近表面，并通過表面的影響(通過化學(xué)力或電力)成為非隨機取向的，則它們可以被檢測到。物質(zhì)的這種凈取向和固有的SHG-活性促成界面處SHG容許的效應(yīng)。SHG已作為一種采用SH-活性探針來檢測和研究生物分子的構(gòu)象變化的靈敏的技術(shù)而出現(xiàn)(Salafsky,J.S.JournalofChemicalPhysics2006,125,074701；Salafsky,J.S.PhysicalChemistryChemicalPhysics2007,9,5704)。被吸附或共價固定在表面上的標記的蛋白質(zhì)產(chǎn)生SHG信號，這是由于相對于表面平面的SHG標記物的非線性極化性的平均凈取向。具體地，SH強度作為ISH＝G(χs(2))2I2給出，其中，ISH是二次諧波強度，G是依賴于實驗幾何形狀和波長的常數(shù)，I是基本光束的強度。非線性磁化率，χs(2)，通過如下等式帶有表面上SH-活性分子的詳細信息：χs(2)＝Ns＜α(2)＞，其中Ns是分子的表面密度，括號代表取向平均值，α(2)是其非線性極化率，即決定由基本光束的兩個入射光子產(chǎn)生二次諧波光子的概率的量子力學(xué)特性。對χs(2)的測量提供了關(guān)于表面上分子的取向的信息。例如，當α(2)由沿分子軸ζ的單一元素ζζζ(2)決定并且分子的方位角分布在表面平面中為隨機分布時，僅有的不會消失的χs(2)元素為：χs⊥⊥⊥(2)＝Ns＜cos3θ＞αξξζ(2)χs⊥|||(2)＝χs||⊥||(2)＝χs||||⊥(2)＝1/2Ns＜cosθsin2θ＞αζζζ(2)其中θ是ζ與表面法線之間的極角，而下標⊥和||分別代表與表面垂直和平行的方向(Heinz,T.F等.PhysicalReviewA1983,28,1983)。SH光是相干且定向的，從而簡化了SH束的收集和分離，并且由于基本和二次諧波在頻譜上很好地分離，串擾(其可給熒光測量造成麻煩)并不存在于SHG中。探針的光降解通過雙光子誘導(dǎo)的吸收相對緩慢地發(fā)生，從而允許在相對較長的時間尺度上進行測量。對SHG的折衷(trade-off)是信號強度，它比熒光弱數(shù)個數(shù)量級。然而，由于在表面附近隨機擴散的分子并不產(chǎn)生信號，因此僅固定在表面上的SH-活性分子有助于產(chǎn)生二次諧波光；由等式1得到的其取向平均值為零。因此，SHG固有地被配備為區(qū)分表面結(jié)合的和游離的分子。SH信號報告探針的取向平均值，并因此會由于構(gòu)象變化而變化。用于檢測靶蛋白-變構(gòu)調(diào)節(jié)劑的相互作用及其對靶蛋白構(gòu)象結(jié)構(gòu)的影響的設(shè)備可采取多種配置。作為其最簡單的形式，該設(shè)備將包括：i)基本光的光源；ii)具有表面連接的探針(如SHG標記的靶蛋白)的基底；以及iii)用于測量二次諧波或其他非線性光束的強度的檢測器。該設(shè)備的更復(fù)雜形式將采用例如：單色器(用于波長選擇)、通濾波器、濾色器、干涉濾波器或其他濾譜器(用于波長選擇或從高次諧波中分離基本光)、一個或多個偏振光學(xué)器件、一個或多個用于引導(dǎo)和聚焦光束的鏡子或透鏡、計算機控制或軟件。傳送或生成非線性光學(xué)光(例如，SHG)的模式可基于以下手段中的一種或多種：TIR(全內(nèi)反射)、光纖(連接有或未連接有珠子)、透射(基本光穿過樣品)、反射(基本光從樣品反射)、掃描成像(允許掃描樣品)、共聚焦成像或掃描、用于功率積聚的諧振腔、多通設(shè)置。測得的信息可以采取矢量的形式，其可包括一個或多個以下參數(shù)：光的強度(一般由PMT或光電二極管轉(zhuǎn)換為光電壓)、光的波長(用單色器和/或濾波器來確定)、時間或位置。所述設(shè)備的兩種一般配置為：圖像掃描(基底的成像——強度、波長等，作為x、y坐標的函數(shù))和光譜學(xué)(強度、波長等的測量，對于一些平面的表面或?qū)τ诩毎?、脂質(zhì)體或其他顆粒的懸浮液)?；竟馐梢砸远喾N方式傳輸?shù)綐悠?參見，例如，美國專利申請公開號2002/0094528，其公開內(nèi)容通過引用整體并入本文)。應(yīng)當理解，在和頻或差頻配置中，基本光束將由兩個或更多個光束組成，并且將在界面上產(chǎn)生差頻或者和頻光束。根據(jù)另一方面，當希望信息為基底位置(x，y)的函數(shù)時，可以使用電荷耦合檢測器(CCD)陣列檢測器。CCD包含像素(即，光電二極管)的陣列，其中每一個像素都可以獨立地測量照射在其上的光。對于給定的設(shè)備幾何形狀，產(chǎn)生自特定的基底位置(x，y)的非線性光可通過測量照射在與基底有一定距離的CCD位置(Q，R)上的非線性光的強度來確定——這可以確定是由于與熒光發(fā)射的自發(fā)、隨機且多方向性質(zhì)相比其為相干的、平行的(且通常與基本光共同傳播)非線性光束。采用CCD陣列，檢測器中的一個或多個陣列元件(10)將映射(map)到基底表面的特定區(qū)域，從而允許容易地確定作為基底位置(x，y)的函數(shù)的信息。光電二極管檢測器和光電倍增管(PMT)、雪崩光電二極管、光電晶體管、真空光電二極管或本領(lǐng)域中已知的用于將入射光轉(zhuǎn)換為電信號(即，電流、電壓等)的其他檢測器也可用于檢測光強度。對于CCD探測器，CCD與安裝在設(shè)備計算機中的數(shù)據(jù)采集板進行通信并受其控制。數(shù)據(jù)采集板可以是本領(lǐng)域所熟知的類型，例如由ComputerBoardsInc.生產(chǎn)的CIO-DAS16/Jr。例如，數(shù)據(jù)采集板和CCD子系統(tǒng)可以按照下述方式操作。數(shù)據(jù)采集板通過發(fā)送時鐘信號到CCD子系統(tǒng)來控制CCD整合周期。在一個實施方案中，CCD子系統(tǒng)將CCD整合周期設(shè)置為4096個時鐘周期。通過改變時鐘頻率，可操控CCD整合數(shù)據(jù)的實際時間。在整合周期中，每個光電二極管累積與到達它的光的量成比例的電荷。一旦該整合周期結(jié)束，電荷即轉(zhuǎn)移至CCD的移位寄存器且新的整合周期開始。移位寄存器將電荷存儲為電壓，該電壓代表了入射到CCD陣列上的光模式(pattern)。然后將電壓以時鐘頻率傳送到數(shù)據(jù)采集板，在那里將電壓數(shù)字化，并存儲在計算機的存儲器中。以這種方式，使樣品的條帶在每個整合周期中成像。此后，將隨后的行整合，直到樣品得到完全掃描。在一方面，SH光的檢測器可以是以單光子計數(shù)模式操作的光電倍增管?？墒褂肧R445型快速前置放大器和SR400型鑒別器(由StanfordResearchSystems,Inc.提供)對光電流脈沖進行電壓轉(zhuǎn)換、放大、進行區(qū)分，然后發(fā)送到計數(shù)器?？墒褂脭?shù)字延遲/脈沖發(fā)生器將通過DAC輸出的光子計數(shù)器門控(gating)和電流計控制進行同步。與PC計算機的通信可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法來實現(xiàn)，包括但不限于使用并行寄存器、CAMAC控制器卡和PC適配器卡。在可備選的方面，將帶通濾波器、陷波濾波器或濾色器置于任一或全部的光束通路(例如，基本的、二次諧波等)中，從而允許，例如，更寬的頻譜帶寬或更多的光通量。在一個實施方案中，可使用干涉濾波器、陷波-通濾波器、帶通濾波器、反射式濾波器或吸收性濾波器代替圖中的濾波器，以便通過或阻斷基本光束或非線性光束。在本文所提供的方法的一些方面，可將檢測器所記錄的數(shù)據(jù)記錄在固定的或數(shù)據(jù)存儲介質(zhì)中，該存儲介質(zhì)是通過用于讀取存儲介質(zhì)的系統(tǒng)可訪問的。例如，用于讀取數(shù)據(jù)存儲介質(zhì)的系統(tǒng)可包括：計算機，其包括中央處理器(“CPU”)；工作存儲器，其可以是，例如，RAM(隨機存取存儲器)或“磁芯”存儲器、大容量存儲器(例如一個或多個磁盤驅(qū)動器或CD-ROM驅(qū)動器)；一個或多個顯示設(shè)備(例如，陰極射線管(“CRT”)顯示器、發(fā)光二極管(“LED”)顯示器、液晶顯示器(“LCD”)、電致發(fā)光顯示器、真空熒光顯示器、場發(fā)射顯示器(“FED”)、等離子體顯示器、投影面板等)；一個或多個用戶輸入設(shè)備(例如，鍵盤、麥克風、鼠標、觸摸屏等)；一條或多條輸入線以及一條或多條輸出線，它們均通過常規(guī)的雙向系統(tǒng)總線互連。該系統(tǒng)可以是獨立的計算機，或者可以與其他系統(tǒng)(例如，計算機、主機、服務(wù)器等等)網(wǎng)絡(luò)化連接(例如，通過局域網(wǎng)、廣域網(wǎng)、內(nèi)聯(lián)網(wǎng)、外聯(lián)網(wǎng)或因特網(wǎng))。該系統(tǒng)還可包括其他的計算機控制的設(shè)備，例如消費者電子產(chǎn)品和裝置。輸入硬件可通過輸入線耦接到計算機，并且可以以多種方式來實現(xiàn)。本發(fā)明的機器可讀數(shù)據(jù)可通過使用經(jīng)電話線或?qū)Ｓ脭?shù)據(jù)線連接的一個或多個調(diào)制解調(diào)器進行輸入。可備選地或另外地，輸入硬件可包括CD-ROM驅(qū)動器或磁盤驅(qū)動器。在與顯示終端結(jié)合時，鍵盤也可用作輸入設(shè)備。輸出硬件可通過輸出線耦接到計算機，并且可以類似地通過常規(guī)設(shè)備來實現(xiàn)。舉例而言，輸出硬件可包括用于使用(例如QUANTA)的程序來顯示本發(fā)明的活性位點的圖形化表示形式的顯示設(shè)備。輸出硬件還可包括打印機以便可以產(chǎn)生硬拷貝輸出；或者磁盤驅(qū)動器，以便存儲用于后續(xù)使用的系統(tǒng)輸出。在本發(fā)明中有用的機器可讀存儲設(shè)備包括但不限于磁性設(shè)備、電子設(shè)備、光學(xué)設(shè)備及其組合。這樣的數(shù)據(jù)存儲設(shè)備的實例包括但不限于硬盤設(shè)備、CD設(shè)備、數(shù)字視頻磁盤設(shè)備、軟盤設(shè)備、可移動硬盤設(shè)備、磁光盤設(shè)備、磁帶設(shè)備、閃存設(shè)備、磁泡存儲器設(shè)備、全息存儲設(shè)備以及任何其他大容量存儲外圍設(shè)備。應(yīng)當理解，這些存儲設(shè)備包括必要的硬件(例如，驅(qū)動器、控制器、電源等)，以及任何必要的使得能夠存儲數(shù)據(jù)的介質(zhì)(例如，磁盤、閃存卡等)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，還可設(shè)想任何其他進行數(shù)據(jù)通信或數(shù)據(jù)存儲的方法或技術(shù)來以機器可讀格式提供靶蛋白在與候選調(diào)節(jié)劑結(jié)合時的構(gòu)象變化的實時數(shù)據(jù)。B.SHG檢測和標記根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的程序?qū)碜訲i:S飛秒激光器的光束用作基本光。具體地，采用在80MHz、約150fs脈沖持續(xù)時間和0.5W平均功率下運行的氬泵Ti:藍寶石系統(tǒng)(Coherent，Inc.)。光束優(yōu)先聚焦到載玻片-緩沖液界面處的點上。收集由表面產(chǎn)生的二次諧波光，將其從基本光中過濾，并根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的程序通過光電倍增管(PMT)進行檢測。記錄由于光漂白引起的強度下降的基線信號。改變基本光束的偏振以產(chǎn)生最大信號輸出。通過確定信號對基本強度的二次方依賴性并測量其特征性譜線形狀來驗證該信號為二次諧波。通過使用光子計數(shù)(1秒的整合時間)來獲得每個數(shù)據(jù)點。在一些方面，靶蛋白可用二次諧波(SH)活性標記物(例如上述的任意標記物)進行標記。在一個實施方案中，采用二次諧波活性部分(例如，標記物)在一個或多個氨基酸殘基上標記靶蛋白，并將其連接到表面上或在界面(例如本文所述的任何表面或界面)處定向，從而使SH活性標記物具有相對于界面的凈取向。標記的氨基酸可包括但不限于半胱氨酸殘基、賴氨酸殘基或胺。在其他實施方案中，采用非天然氨基酸(例如但不限于Aladan)對靶蛋白進行標記。在一些實施方案中，靶蛋白中的天然氨基酸殘基采用二次諧波活性標記物進行標記。在其他實施方案中，所標記的氨基酸殘基可以是工程構(gòu)建至靶蛋白的一級氨基酸序列中的突變的或置換的氨基酸殘基(如保守突變的或保守置換的氨基酸殘基)。在其他實施方案中，靶蛋白被連接到表面(例如本文所述的任何表面或界面)上并采用SH活性標記物進行原位標記。C.用于鑒別與靶蛋白上的變構(gòu)位點結(jié)合的試劑的方法本文提供了用于鑒別與靶蛋白上的變構(gòu)位點結(jié)合的試劑的方法。將與在界面處具有凈取向的SH活性標記物結(jié)合的靶蛋白與已知結(jié)合靶蛋白的活性位點的天然或合成配體進行預(yù)孵育，并建立基線二次諧波信號?；蛘撸瑢械鞍讖木哂幸雅c活性位點結(jié)合的天然配體的細胞或組織中分離。在此之后，將靶蛋白與候選變構(gòu)調(diào)節(jié)劑(例如本文所述的任何候選變構(gòu)調(diào)節(jié)劑)進行孵育。候選變構(gòu)調(diào)節(jié)劑與靶蛋白的結(jié)合產(chǎn)生指示靶蛋白結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化的可檢測信號。于是，可檢測SHG信號的存在或不存在將候選試劑鑒別為靶標的變構(gòu)調(diào)節(jié)劑。在一些實施方案中，已知與靶蛋白的活性位點結(jié)合的合成配體是藥物，例如抑制劑或靶蛋白的天然配體的合成類似物。在一些方面，SH活性標記物與已知結(jié)合一種或多種胞內(nèi)或胞外配體的靶蛋白上的特定氨基酸殘基結(jié)合。這些配體可包括但不限于，另一種蛋白質(zhì)、肽、核酸(例如，抑制性核酸，例如反義寡核苷酸或siRNA)、磷脂、碳水化合物或輔因子(例如但不限于金屬離子或維生素)。在一個實施方案中，SH活性標記物與已知位于靶蛋白與另一蛋白質(zhì)之間相互作用的界面區(qū)(即，位于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的位點處)的靶蛋白中的氨基酸結(jié)合。在一些方面，靶蛋白上的標記的氨基酸殘基可包括但不限于半胱氨酸殘基、賴氨酸殘基或胺。在其他實施方案中，靶蛋白采用非天然氨基酸(例如但不限于Aladan或丹酰丙氨酸)進行標記。在另一實施方案中，非天然氨基酸是和頻產(chǎn)生活性的(SFG活性的)。在一些實施方案中，可將包含具有定制的振動性質(zhì)的獨特探針的UAA工程構(gòu)建至靶蛋白的不連續(xù)位點處(例如在靶蛋白與另一蛋白質(zhì)之間的相互作用的界面區(qū))，以通過SFG鑒別位點特異性構(gòu)象變化。探針部分可包括但不限于NO、CN、SCN或N3。在一些實施方案中，探針部分提供在約1900到2300cm-1的頻譜范圍內(nèi)的獨特的振動特征(vibrationalsignature)。在一些實施方案中，靶蛋白中的天然氨基酸殘基采用二次諧波活性標記物進行標記。在其他實施方案中，標記的氨基酸殘基可以是工程構(gòu)建至靶蛋白的一級氨基酸序列中的突變的或置換的氨基酸殘基(例如保守突變的或保守置換的氨基酸殘基)。在其他方面，靶蛋白可與表面結(jié)合或在界面處結(jié)合，例如上述的任何表面或界面。在一些實施方案中，靶蛋白包括用于將其固定至表面上的親和標簽(例如但不限于聚組氨酸標簽，例如His6)。在另一實施方案中，表面涂覆有鎳-寡聚PEG分子以便將His6標記的激酶固定至表面上，以用于SHG或SFG檢測。在又一實施方案中，表面是支持的脂雙層表面或脂質(zhì)類似物雙層表面。在一些方面，候選變構(gòu)調(diào)節(jié)劑與SH活性標記的靶蛋白的結(jié)合可誘導(dǎo)靶蛋白結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化。在一些實施方案中，這種構(gòu)象變化可使SH活性標記物的凈取向相對于界面發(fā)生變化。在一些實施方案中，在與候選變構(gòu)調(diào)節(jié)劑結(jié)合后，SH活性標記物的凈取向相對于界面改變約1°、2°、3°、4°、5°、6°、7°、8°、9°、10°或更大值中的任意值。在一個實施方案中，實時檢測并記錄這種變化。C.用于鑒別在與試劑進行變構(gòu)結(jié)合后經(jīng)歷構(gòu)象變化的靶蛋白的結(jié)構(gòu)中的特定位點的方法本文提供了用于鑒別與試劑進行變構(gòu)結(jié)合后經(jīng)歷構(gòu)象變化的靶蛋白的結(jié)構(gòu)中的特定位點的方法。在一些方面，在兩個或更多個不同的位置采用SH活性標記物標記單個靶蛋白，使得每個靶蛋白與一個SH活性標記物結(jié)合，但至少兩個或更多個靶蛋白之間的SH活性標記物的位置不同(即，靶蛋白的至少兩個拷貝各自具有位于靶蛋白的不同區(qū)域內(nèi)的單一SH活性標記物)。任選地，與在界面處具有凈取向的SH活性標記物結(jié)合的至少兩個靶蛋白可與已知結(jié)合靶蛋白的活性位點的天然或合成配體進行預(yù)孵育，并建立基線二次諧波信號。然后將所述至少兩個或更多個標記的靶蛋白中的每一個與候選變構(gòu)調(diào)節(jié)劑(例如本文所述的任何候選變構(gòu)調(diào)節(jié)劑)進行孵育。候選變構(gòu)調(diào)節(jié)劑與靶蛋白的結(jié)合產(chǎn)生指示靶蛋白結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化的可檢測信號。如果用位于靶標上第一位點處的SH活性標記物標記的靶蛋白在與候選變構(gòu)調(diào)節(jié)劑結(jié)合后產(chǎn)生了可檢測信號，而在相同的候選變構(gòu)調(diào)節(jié)劑與用位于靶標上第二位點處的SH活性標記物標記的靶蛋白孵育時沒有產(chǎn)生可檢測信號，則指示該候選變構(gòu)調(diào)節(jié)劑與靶蛋白特異性地結(jié)合并誘導(dǎo)靶蛋白上第一位點處而非第二位點處的構(gòu)象變化。另一方面，如果帶有位于第一位點處的SH活性標記物的靶蛋白和帶有位于第二位點處的SH活性標記物的靶蛋白在與候選變構(gòu)調(diào)節(jié)劑一起孵育時各自產(chǎn)生可檢測信號，則指示該候選變構(gòu)調(diào)節(jié)劑與靶蛋白特異性地結(jié)合并誘導(dǎo)靶蛋白結(jié)構(gòu)在兩個位點處的構(gòu)象變化，或者指示該候選變構(gòu)調(diào)節(jié)劑與靶蛋白非特異性地結(jié)合。增加靶蛋白上SH活性標記物所在的位點的數(shù)目，可提高確定候選變構(gòu)調(diào)節(jié)劑與靶蛋白是特異性地結(jié)合還是非特異性地結(jié)合的能力(即，特異性相互作用的可能性隨著在靶蛋白上超過一個，如兩個、三個、四個或五個位點上產(chǎn)生的可檢測信號的數(shù)目而降低)。在一些實施方案中，可產(chǎn)生靶蛋白的數(shù)種形式，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10種或更多種中的任一種，每種均具有位于靶蛋白的不同區(qū)域中的SH活性標記物。術(shù)語“特異性結(jié)合”描述了靶生物分子(例如，靶蛋白)與結(jié)合配偶體之間的通常特異性的且可逆的相互作用，其需要生物分子與結(jié)合配偶體結(jié)構(gòu)在結(jié)合位點處的空間互補性加上結(jié)合位點處一種或多種類型的靜電力、氫鍵鍵合、疏水力和/或范德華力的組合效應(yīng)?？臻g互補性越大且在結(jié)合位點處的其他力越強，則生物分子對其相應(yīng)的結(jié)合配偶體的結(jié)合特異性將會越大。術(shù)語“非特異性結(jié)合”是指靶生物分子與結(jié)合配偶體之間的相互作用，其為通過在相互作用位點處的非特異性相互作用，例如通過靜電力、氫鍵鍵合、疏水力和/或范德華力，但缺少增強非結(jié)構(gòu)力(例如在親和性(特異性)結(jié)合中)的效應(yīng)的結(jié)構(gòu)互補性。在一些實施方案中，當在第一位點(例如，第一氨基酸位點)處標記靶生物分子時，測量候選結(jié)合配偶體與靶生物分子結(jié)合后可檢測信號(例如，歸一化的SHG強度)的第一變化。在一些實施方案中，當在第二位點(例如，第二氨基酸位點)處標記靶蛋白時，測量相同的候選結(jié)合配偶體與靶生物分子結(jié)合后可檢測信號(例如，歸一化的SHG強度)的第二變化。歸一化的SHG強度是在候選結(jié)合配偶體與靶生物分子結(jié)合后測量的SHG信號與對照值(例如，在不存在候選結(jié)合配偶體時測量的SHG信號)的比值。在一些實施方案中，在噪聲水平以上的第一變化與第二變化之間的差異指示候選結(jié)合配偶體是特異性結(jié)合物。在一些實施方案中，噪聲水平是0.1％、0.2％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％或10％。在一些實施方案中，第一變化與第二變化之間的差異為噪聲水平以上1％、2％、3％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％或500％。在一些實施方案中，特異性結(jié)合配偶體在游離溶液中對靶生物分子具有在10-4-10-8M、10-4-10-8M、10-4-10-5M、10-5-10-6M、10-6-10-7M、10-7-10-8M、10-8-10-12M、10-8-10-9M、10-9-10-10M、10-10-10-11M、10-11-10-12M范圍內(nèi)或者大于10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11或10-12的親和力。在一些實施方案中，在噪聲水平以下的第一變化和第二變化之間的差異指示候選結(jié)合配偶體是非特異性結(jié)合物。在一些實施方案中，噪聲水平是0.1％、0.2％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％或10％。在一些實施方案中，第一變化和第二變化之間的差異為噪聲水平以下95％、85％、75％、65％、55％、45％、35％、25％、15％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.2％或0.1％。在一些實施方案中，非特異性結(jié)合配偶體在游離溶液中對靶生物分子具有在10-1-10-2M、10-2-10-3M、10-3-10-4M范圍內(nèi)或者小于10-4、10-3、10-2或10-1的親和力。在一些方面，至少一個SH活性標記物不與靶蛋白上的天然氨基酸殘基結(jié)合，而是與工程構(gòu)建至靶蛋白的特定區(qū)域內(nèi)的氨基酸(例如，工程化的半胱氨酸殘基)結(jié)合。在一些實施方案中，靶蛋白在多于一個天然氨基酸殘基(如半胱氨酸殘基)上用SH活性標記物標記，其中，每個天然氨基酸位于靶蛋白的不同區(qū)域或結(jié)構(gòu)域中。在另一實施方案中，靶蛋白上所有的SH活性標記物均與靶蛋白的兩個或更多個區(qū)域中的工程化的(即突變的或置換的)氨基酸殘基結(jié)合。在一些方面，靶蛋白上的標記的氨基酸殘基可包括但不限于半胱氨酸殘基、賴氨酸殘基或胺。在其他實施方案中，靶蛋白采用非天然氨基酸(例如但不限于Aladan或丹酰丙氨酸)進行標記。在另一實施方案中，非天然氨基酸是和頻產(chǎn)生活性的(SFG活性的)。在一些實施方案中，可將包含具有定制的振動性質(zhì)的獨特探針的UAA工程構(gòu)建至靶蛋白的不連續(xù)位點(例如，在靶蛋白與另一蛋白質(zhì)之間的相互作用的界面區(qū))處，以通過SFG鑒別位點特異性構(gòu)象變化。探針部分可包括但不限于NO、CN、SCN或N3。在一些實施方案中，探針部分提供在約1900到2300cm-1的頻譜范圍內(nèi)的獨特的振動特征。在一些實施方案中，靶蛋白中的天然氨基酸殘基采用二次諧波活性標記物進行標記。在其他實施方案中，標記的氨基酸殘基可以是工程構(gòu)建至靶蛋白的一級氨基酸序列中的突變的或置換的氨基酸殘基(如保守突變的或保守置換的氨基酸殘基)。在其他方面，靶蛋白可與表面結(jié)合或在界面上結(jié)合，例如上述的任何表面或界面。在一些實施方案中，靶蛋白包括用于將其固定至表面上的親和標簽(例如但不限于聚組氨酸標簽，例如His6)。在另一實施方案中，表面涂覆有鎳-寡聚PEG分子以便將His6標記的蛋白質(zhì)(例如激酶)固定至表面上，以用于SHG或SFG檢測。在又一實施方案中，表面是支持的脂雙層表面或脂質(zhì)類似物雙層表面。在一些方面，候選變構(gòu)調(diào)節(jié)劑與SH活性標記的靶蛋白的結(jié)合可誘導(dǎo)靶蛋白結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化。在一些實施方案中，這種構(gòu)象變化可使SH活性標記物的凈取向相對于界面發(fā)生變化。在一些實施方案中，在與候選變構(gòu)調(diào)節(jié)劑結(jié)合后，SH活性標記物的凈取向相對于界面改變約1°、2°、3°、4°、5°、6°、7°、8°、9°、10°或更大值中的任一數(shù)值。在一個實施方案中，實時檢測并記錄這種變化。本文提供了用于確定靶生物分子與候選結(jié)合配偶體之間的結(jié)合相互作用的特異性的方法。在一些實例中，采用非線性活性標記物，如二次諧波活性部分，在第一位點處標記靶生物分子。然后使標記的蛋白質(zhì)與候選結(jié)合配偶體接觸。使用表面選擇性技術(shù)測量與靶生物分子和候選結(jié)合配偶體之間的結(jié)合相關(guān)聯(lián)的信號(例如，歸一化的二次諧波產(chǎn)生強度)。隨后針對一個或多個位點重復(fù)進行相同的程序。例如，靶生物分子可在與相同的候選結(jié)合配偶體接觸之前在第二位點進行標記(未標記第一位點)。使用表面選擇性技術(shù)測量與靶生物分子和相同的候選結(jié)合配偶體之間的結(jié)合相關(guān)聯(lián)的信號(例如，歸一化的二次諧波產(chǎn)生強度)。將使用在第一位點標記的靶標產(chǎn)生的信號與使用在第二位點標記的靶標產(chǎn)生的信號進行比較。噪聲水平以上的差異(例如，噪聲水平以上1％、2％、3％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％或500％)指示靶生物分子與候選結(jié)合配偶體之間的特異性結(jié)合。噪聲水平以下的差異指示靶生物分子與候選結(jié)合配偶體之間的非特異性結(jié)合。本文提供的方法可用于篩查靶向同一靶生物分子的藥物候選物文庫。例如，可針對文庫中的每種藥物執(zhí)行上文概述的程序。對于每種藥物，與靶生物分子和藥物候選物之間的結(jié)合相關(guān)聯(lián)的信號(例如，歸一化的二次諧波產(chǎn)生強度)在靶生物分子在第一標記位點上進行標記時測量一次，以及在靶生物分子在第二標記位點上進行標記(未標記第一位點)時測量一次。這兩個測量結(jié)果之間的差異為藥物候選物的結(jié)合特異性、藥物候選物誘導(dǎo)靶生物分子的構(gòu)象的能力、藥代動力學(xué)和藥效的指示?；谶@兩個測量結(jié)果之間的差異，可選擇藥物候選物用于另外的下游篩選(例如，動物試驗或臨床試驗)。靶生物分子可以是任何生物分子，包括蛋白質(zhì)、DNA、RNA或寡糖。可以基于若干標準來選擇標記位點。例如，可以基于與結(jié)合位點的距離來選擇標記位點。在一些方法中，第一標記位點比第二標記的位點更靠近結(jié)合位點。第一標記位點和第二標記位點可以都在結(jié)合界面內(nèi)。優(yōu)選地，并非所有的標記位點都在結(jié)合界面內(nèi)。在一些方法中，至少一個標記位點不在結(jié)合界面內(nèi)。在其他方法中，至少一個標記位點在結(jié)合界面內(nèi)。在一些方法中，第一標記位點在結(jié)合界面內(nèi)而第二位點在結(jié)合界面之外。在一些方法中，兩個標記位點均在結(jié)合界面之外。D.用于鑒別與G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)上的變構(gòu)位點結(jié)合的試劑的方法本文提供了用于鑒別與G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR；例如本文所述的任何GPCR)上的變構(gòu)位點結(jié)合的試劑的方法。將GPCR與天然配體進行預(yù)孵育，其中采用與GPCR結(jié)合后在界面處具有凈取向的二次諧波活性標記物標記天然配體，并建立基線二次諧波信號。在此之后，將GPCR與候選變構(gòu)調(diào)節(jié)劑(例如本文所述的任何候選變構(gòu)調(diào)節(jié)劑)進行孵育。候選變構(gòu)調(diào)節(jié)劑與GPCR的結(jié)合產(chǎn)生指示GPCR結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化的可檢測信號。于是，可檢測的SHG信號的存在或不存將候選試劑鑒別為GPCR的變構(gòu)調(diào)節(jié)劑。在一些實施方案中，已知與GPCR的活性位點結(jié)合的天然配體是激素，例如肽激素。在一些方面，天然配體上的標記的氨基酸殘基可包括但不限于半胱氨酸殘基、賴氨酸殘基或胺。在其他實施方案中，天然配體采用非天然氨基酸(例如但不限于Aladan或丹酰丙氨酸)進行標記。在另一實施方案中，非天然氨基酸是和頻產(chǎn)生活性的(SFG活性的)。在一些實施方案中，可將包含具有定制的振動性質(zhì)的獨特探針的UAA工程構(gòu)建至天然配體的不連續(xù)位點處。探針部分可包括但不限于NO、CN、SCN或N3。在一些實施方案中，探針部分提供在約1900到2300cm-1的頻譜范圍內(nèi)的獨特的振動特征。在一些實施方案中，天然配體中的天然氨基酸殘基采用二次諧波活性標記物進行標記。在其他實施方案中，標記的氨基酸殘基可以是工程構(gòu)建至天然配體的一級氨基酸序列中的突變的或置換的氨基酸殘基(如保守突變的或保守置換的氨基酸殘基)。在其他方面，GPCR可在生物細胞的質(zhì)膜或合成生物膜上(如在脂質(zhì)體的表面上)表達。在又一個實施方案中，GPCR嵌入表面，例如支持的脂雙層表面或脂質(zhì)類似物雙層表面內(nèi)。在一些實施方案中，所述生物細胞在其表面上天然地表達GPCR。在其他實施方案中，生物細胞異源表達編碼GPCR的核酸，該核酸在生物細胞的表面上表達。用于在細胞表面上異源表達蛋白質(zhì)(例如GPCR)的方法有許多，并且是本領(lǐng)域公知的技術(shù)。在一些方面，候選變構(gòu)調(diào)節(jié)劑與GPCR的結(jié)合可誘導(dǎo)GPCR結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化。在一些實施方案中，這種構(gòu)象變化可使SH活性標記的天然配體的凈取向相對于界面(例如，細胞的質(zhì)膜或合成生物膜，如脂質(zhì)體)發(fā)生變化。在一些實施方案中，在與候選變構(gòu)調(diào)節(jié)劑結(jié)合后，SH活性標記物的凈取向相對于界面改變約1°、2°、3°、4°、5°、6°、7°、8°、9°、10°或更大值中的任一數(shù)值。在一個實施方案中，實時檢測并記錄這種變化。V.標記標記物可連接至蛋白質(zhì)上不同類型的標記位點。例如，一個或多個標記物可連接至天然蛋白質(zhì)殘基或突變蛋白質(zhì)位點(例如，引入了非天然氨基酸的位點)或其組合。標記位點可位于蛋白質(zhì)的表面上或埋藏于蛋白質(zhì)內(nèi)。優(yōu)選地，標記位點位于蛋白質(zhì)的表面上。連接至非天然氨基酸的標記物允許對埋藏于蛋白質(zhì)內(nèi)的殘基進行標記。標記物可連接至任何類型的氨基酸殘基。例如，標記物可連接至預(yù)先選定的位點，如半胱氨酸殘基或賴氨酸殘基。標記物也可隨機地連接至整個蛋白質(zhì)中的氨基酸上(例如，通過氨基基團)。標記物可以以不同的速率或不同的占有率與不同的殘基(例如半胱氨酸或賴氨酸殘基)結(jié)合。例如，溶液中的標記物與一個位點處的胺基團的結(jié)合可比與另一個位點處的胺基團的結(jié)合更快。結(jié)合速率還依賴于標記反應(yīng)條件。例如，pH的變化可意味著一種類型的殘基將優(yōu)先與給定的標記物結(jié)合。此外，標記物(例如，染料分子)與待標記的蛋白質(zhì)的比值可影響所標記的位點的數(shù)目。控制所標記的位點的數(shù)目和/或位置可以是重要的，例如，用于探查結(jié)合相互作用的特異性。對于非天然氨基酸，標記程序可以是為了標記選定的位點而特別制訂的?？刹呗孕缘剡x擇這種位點，例如，在功能上相關(guān)的位點的附近。在一些實例中，可使一個或多個標記位點更可用于進行標記，例如通過將待標記的蛋白質(zhì)固定于脂雙層上，從而暴露該蛋白質(zhì)的背朝脂雙層的部分。因此，標記可隨機地進行和/或針對蛋白質(zhì)上預(yù)選的位置特異性地進行。例如，可在預(yù)選的位置(如功能上相關(guān)的位點)的附近或周圍提供1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、75、100個或更多個標記物?？墒褂酶鞣N形式來測定標記的蛋白質(zhì)。例如，可使用多孔板測定標記的蛋白質(zhì)?？字械牡鞍踪|(zhì)可以以不同的方式(即，在不同的標記位點)進行標記。測定區(qū)別標記的蛋白質(zhì)可以提供蛋白質(zhì)在與結(jié)合配偶體結(jié)合后的構(gòu)象變化的圖譜(map)。在一些方法中，可選擇標記位點從而使所述位點在蛋白質(zhì)之上或之內(nèi)形成預(yù)定的模式或網(wǎng)格。在不同的標記位點處檢測到的構(gòu)象變化可指示結(jié)合配偶體的結(jié)合特異性。V.試劑盒在其他方面，包含用于實踐本文所公開的方法的組合物的試劑盒構(gòu)成本發(fā)明的另一特征。本文中使用二次諧波產(chǎn)生(SHG)的方法、試劑盒和/或系統(tǒng)(例如，包括任何本文所述的標記物和/或非天然氨基酸)的任何描述可以應(yīng)用于使用和頻產(chǎn)生(SFG)或差頻產(chǎn)生(DFG)的方法、試劑盒和/或系統(tǒng)。在一個實施方案中，提供了試劑盒，其包含一個或多個用于綴合至靶蛋白的SHG、SFG或DFG-活性部分(如標記物)，例如任何本文中所描述的SHG、SFG或DFG-活性標記物(如染料標記物)。這些可以包括具有針對特定官能團的不同偶聯(lián)化學(xué)反應(yīng)的染料標記物，例如但不限于，馬來酰亞胺標記物(如，PyMPO-MALEIMIDETM(1-(2-馬來酰亞胺基乙基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)噁唑-2-基)吡啶鎓甲磺酸鹽))、PyMPO-NHS、噁唑標記物、BADANTM(6-溴乙酰基-2-二甲基氨基萘)、PyMPO-SETM(1-(3-(琥珀酰亞胺氧羰基)芐基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)噁唑-2-基)吡啶鎓溴化物)以及ACRYLODANTM(6-丙烯酰基-2-二甲基氨基萘)。在其他實施方案中，染料可以是基于香豆素的染料，例如但不限于酮基香豆素和3,3'-羰基雙(7-二乙基氨基香豆素)。在試劑盒中預(yù)期還包含供本文公開的任意方法使用的、用SHG、SFG或DFG-活性標記物標記蛋白質(zhì)的工具和試劑。這些可以包括但不限于，用于測試不同的標記條件的緩沖液組、用于進行標記反應(yīng)的緩沖液、在其中進行標記反應(yīng)的管、用于從未結(jié)合的標記物中純化標記的蛋白質(zhì)的旋轉(zhuǎn)柱和/或凝膠過濾柱，以及用于洗滌標記的蛋白質(zhì)的緩沖液。在另一實施方案中，試劑盒可包含一個或多個用于結(jié)合靶蛋白的表面，如本文公開的任何表面。這些表面可以是可重復(fù)使用的或消耗性的(即，打算使用一次或有限的次數(shù))。表面可以由玻璃(如載玻片)、塑料、金屬、膠乳、橡膠、陶瓷、聚合物(例如但不限于聚丙烯、聚偏二氟乙烯、聚苯乙烯或聚乙烯(例如，聚乙二醇))或任何可以吸附或附著生物分子(如蛋白質(zhì))的表面制成。在一些實施方案中，表面是平滑的。然而，在其他實施方案中，表面可包括預(yù)先形成的表面特征，例如但不限于溝槽、V形槽、臺面結(jié)構(gòu)和/或孔。此外，表面可以根據(jù)任何本文所公開的方法進行預(yù)清洗。在另外的實施方案中，當表面不包括預(yù)先形成的表面特征時，試劑盒可以包含用于在表面上模板化形成孔的粘合墊圈。在一個實施方案中，可以針對不同的激發(fā)幾何形狀對包含在試劑盒中的表面進行優(yōu)化，其中傳送或生成非線性光學(xué)光的模式基于但不限于TIR(全內(nèi)反射)、透射或反射中的一種或多種。在其他實施方案中，包含在本文所公開的試劑盒中的表面可以預(yù)先涂覆有一種或多種提供適合于連接到靶蛋白上的表面化學(xué)反應(yīng)的分子。這些分子可以包括任何本文公開的分子，例如但不限于醛硅烷、BSA-NHS(BSA-N-羥基琥珀酰亞胺)或寡聚聚乙二醇(PEG)。在一個實施方案中，該分子可以包括親和標簽，如任何本文公開的那些標簽。例如，表面可以涂覆有鎳-寡聚PEG分子以用于將組氨酸-標記的蛋白質(zhì)固定至表面上。在另一實施方案中，包含在試劑盒中的表面可以預(yù)先涂覆有支持的脂質(zhì)(例如但不限于磷脂)雙層或支持的脂質(zhì)類似物雙層。該試劑盒的該實施方案還包含用于在任何本文所公開的表面上制備支持的脂雙層或支持的脂質(zhì)類似物雙層的脂質(zhì)或脂質(zhì)混合物。在一些實施方案中，脂質(zhì)混合物可以包含磷酸膽堿，例如但不限于DOPC。在一些實施方案中，脂質(zhì)混合物可以包含但不限于，DDAB(N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化銨)、DMRIE(N-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羥乙基溴化銨)、DODAC(N,N-二油烯基-N,N-二甲基氯化銨)、DOGS(雙十七烷基氨基甘氨酰基亞精胺)、DOPE(1,2-sn-二油酰基磷脂酰乙醇胺)、DOSPA(N-(1-(2,3-二油烯基氧基)丙基)-N-(2-(精胺甲酰胺基)乙基)-N,N-二甲基三氟乙酸銨)、DOTAP(N-(1-(2,3-二油烯基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化銨)、DOTMA(N-(1-(2,3-二油烯基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化銨)中的一種或多種。在其他實施方案中，任何脂質(zhì)混合物的脂質(zhì)或脂質(zhì)組分可以包括用于與蛋白質(zhì)結(jié)合的親和標簽(例如但不限于鎳化脂質(zhì)，例如，DOGS-Ni-NTA脂質(zhì))。預(yù)期在本文所公開的一個或多個試劑盒中還包含與如下的設(shè)備一起使用的信號外圍設(shè)備，該設(shè)備用于檢測靶蛋白-變構(gòu)調(diào)節(jié)劑相互作用和對靶蛋白構(gòu)象結(jié)構(gòu)的影響，用于確定靶生物分子與候選結(jié)合配偶體之間的結(jié)合相互作用的特異性，和/或任何使用SHG、SFG或DFG檢測和/或測量構(gòu)象變化的方法。這些可以包括但不限于通濾波器、濾色器、干涉濾波器或其他濾譜器(用于波長選擇或從高次諧波中分離基本光)、一個或多個偏振光學(xué)器件和/或一個或更多個用于引導(dǎo)和聚焦光束的鏡子或透鏡。以定量測量為目的的機動化旋轉(zhuǎn)臺也可包括在本文所公開的試劑盒中。在另一實施方案中，蛋白質(zhì)或酶功能所必需的一種或多種輔因子可以包含在本文所公開的試劑盒中。這些可以包括無機輔因子(例如但不限于銅、鐵、鎂、錳、鉬、鎳、鈷或鋅離子)。這些也可包括有機輔因子，例如但不限于焦磷酸硫胺素、NAD+(NADH)、NADP+(NADPH)、磷酸吡哆醛、硫辛酰胺、甲基鈷胺素、鈷胺素、生物素、輔酶A、四氫葉酸、甲萘醌、抗壞血酸、黃素單核苷酸、黃素腺嘌呤二核苷酸、輔酶F420、三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、三磷酸鳥苷(GTP)、二磷酸鳥苷(GDP)、S-腺苷基甲硫氨酸、輔酶B、輔酶M、輔酶Q、三磷酸胞苷、谷胱甘肽、血紅素、核苷酸糖、吡咯并喹啉、醌和/或四氫生物蝶呤。預(yù)期在本文公開的任何試劑盒中還包含已知與一種或多種靶蛋白(例如，泛素或SUMO)結(jié)合的一種或多種標記的(如SFG或SHG標記的)肽和/或蛋白質(zhì)，或一種或多種SFG或SHG標記的抗體或其片段。在其他實施方案中，試劑盒可包含一種或多種用于向蛋白質(zhì)中引入SHG-、SFG-或DFG-活性非天然氨基酸(UAA)標記物的組分。這些組分可以包括但不限于無細胞翻譯提取物、用于引入特定非天然氨基酸標記物(如，Aladan)的tRNA/tRNA合成酶對和/或反應(yīng)和洗滌緩沖劑。在一些實例中，這些組分可以允許在靶蛋白上的一個或多個位置選擇性地進行標記，例如，用于按照本文所述的特異性方法放置標記物，用于在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)之上或之內(nèi)的功能上相關(guān)的位點(例如，位于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用區(qū)域附近的位點，不直接位于任何結(jié)合位點附近但在構(gòu)象上受結(jié)合事件影響的位點，等)、活性位點、結(jié)合位點或任何其他位點周圍的策略性位置放置標記物。試劑盒可以包含用于在預(yù)定位置實現(xiàn)選擇性標記的工具。在另一實施方案中，試劑盒可包含一種或多種用于活細胞標記的組分。這些可以包括但不限于，用于細胞附著的表面、SHG和SFG-活性標記物、在細胞標記反應(yīng)中使用的緩沖液、用于除去未反應(yīng)的標記物的洗出緩沖液以及細胞生長培養(yǎng)基。在又一個實施方案中，試劑盒可包含一種或多種用于根據(jù)本文所描述的標記技術(shù)標記天然殘基的組分。這樣的組分可包括任何所述的用于標記活細胞的組分、反應(yīng)和洗滌緩沖液、用于相對于待標記的蛋白質(zhì)定量標記物(例如，染料)的組分和其他組分。例如，該組分可允許標記條件(例如，標記物濃度、物理和/或化學(xué)環(huán)境)改變以獲得所期望的標記結(jié)果。在一些實施方案中，一個或多個試劑盒可以包含用于標記陣列和/或用于標記多個樣品孔的組分。例如，基于對標記條件的精確控制，用于控制標記劑量的組分可以在不同的孔和/或陣列區(qū)域中實現(xiàn)不同的標記結(jié)果。例如，試劑盒可以包括用于隨位置改變標記條件的組分。進一步地，試劑盒可包括與相應(yīng)的標記工具(例如，一種或多種用于將SHG、SFG或DFG活性非天然氨基酸(UAA)標記物引入蛋白質(zhì)中的組分)一起提供的一種或多種標記物。此類試劑可按照試劑盒的應(yīng)用領(lǐng)域以自定的濃度或量包括在內(nèi)。VI.系統(tǒng)在其他方面，本文提供了下述系統(tǒng)：其用于使用二次諧波產(chǎn)生(SHG)、和頻產(chǎn)生(SFG)和/或差頻產(chǎn)生(DFG)技術(shù)來篩選和鑒別結(jié)合至和/或調(diào)節(jié)靶蛋白上的變構(gòu)位點的試劑，以確定靶生物分子與候選結(jié)合配偶體之間的結(jié)合相互作用的特異性，和/或檢測和/或測量構(gòu)象變化。在一些實施方案中，所述系統(tǒng)包含用SHG-、SFG-或DFG-活性部分(例如，在本文所提供的任何組合物、方法或試劑盒中公開的任何SFG-、SHG-或DFG-活性部分，例如，SFG-、SHG-或DFG-活性染料標記物或SFG-、SHG-或DFG-活性非天然氨基酸)標記的靶蛋白。所述系統(tǒng)還包含用于檢測靶蛋白-試劑相互作用的設(shè)備，其包括：i)基本光的光源；ii)具有表面連接的探針(例如SHG標記的、SFG標記的或DFG標記的靶蛋白)的基底；和iii)用于測量二次諧波或其他非線性光束的強度的檢測器。在該系統(tǒng)的一些實施方案中，通過該設(shè)備檢測試劑與蛋白質(zhì)上的變構(gòu)位點的結(jié)合，并且可以將檢測器所記錄的數(shù)據(jù)記錄在固定的或數(shù)據(jù)存儲介質(zhì)上，該介質(zhì)是通過用于讀取存儲介質(zhì)的系統(tǒng)可訪問的。在其他實施方案中，通過該設(shè)備檢測靶生物分子與候選結(jié)合配偶體之間的結(jié)合相互作用的特異性，并且可以將檢測器所記錄的數(shù)據(jù)記錄在固定的或數(shù)據(jù)存儲介質(zhì)上，該介質(zhì)是通過用于讀取存儲介質(zhì)的系統(tǒng)可訪問的。在另外其他的實施方案中，檢測并監(jiān)測(例如，實時地)在任何結(jié)合事件后的一個或多個實時構(gòu)象變化，并且可以將檢測器所記錄的數(shù)據(jù)記錄在固定的或數(shù)據(jù)存儲介質(zhì)上，該介質(zhì)是通過用于讀取存儲介質(zhì)的系統(tǒng)可訪問的。在其他實施方案中，該系統(tǒng)還包括單色器(用于波長選擇)、通濾波器、濾色器、干涉濾波器或其他濾譜器(用于波長選擇或從高次諧波中分離基本光)、一個或多個偏振光學(xué)器件、一個或多個用于引導(dǎo)和聚焦光束的鏡子或透鏡、計算機控制或軟件。在其他實施方案中，傳送或生成非線性光學(xué)光(例如，SHG)的模式可以基于以下一種或多種手段：TIR(全內(nèi)反射)、光纖(連接有或未連接有珠子)、透射(基本光穿過樣品)、反射(基本光從樣品反射)、掃描成像、共聚焦成像或掃描、用于功率積聚的諧振腔、多通設(shè)置。在所述系統(tǒng)的另一個實施方案中，測得的信息可以采取矢量的形式，其可以包括以下一個或多個參數(shù)：光的強度(通常由PMT或光電二極管轉(zhuǎn)換為光電壓)、光的波長(由單色器和/或濾波器確定)、時間或位置。所述設(shè)備的兩種一般配置為：圖像掃描(基底的成像——作為x，y坐標的函數(shù)的強度、波長等)和光譜學(xué)(強度、波長等的測量，對于一些平面表面或?qū)τ诩毎?、脂質(zhì)體或其他顆粒的懸浮液)?？梢酝ㄟ^參考以下實施例進一步理解本發(fā)明，這些實施例是以舉例說明的方式提供的，并不意味著是限制性的。實施例實施例1：通過向激酶活性位點添加合成配體對激酶的變構(gòu)調(diào)節(jié)劑的鑒別激酶為一類主要的藥物靶標，當前在臨床試驗中具有至少30種不同的激酶靶標。大多數(shù)激酶藥物，被稱為I型抑制劑，通過模擬ATP并與ATP直接競爭而與激酶的ATP結(jié)合位點結(jié)合并起作用，從而將激酶激活環(huán)穩(wěn)定為活性構(gòu)象。在另一方面，II型抑制劑通過部分地與激活環(huán)以及激酶上的其他位點結(jié)合而導(dǎo)致激酶的激活環(huán)轉(zhuǎn)變成無活性構(gòu)象。在另一方面，III型激酶抑制劑通過與激酶上除激酶激活環(huán)以外的位點結(jié)合來變構(gòu)地調(diào)節(jié)激酶活性。III型抑制劑的鑒別是困難的，因為確定候選抑制劑與激酶結(jié)合的位點通常需要X射線晶體學(xué)來辨別。在本實施例中，使用二次諧波產(chǎn)生(SHG)檢測對分子進行鑒別，該分子i)在一個或多個標記的位點處改變激酶構(gòu)象，且ii)在存在與激酶活性位點結(jié)合的已知合成配體(伊馬替尼)時發(fā)生上述改變，從而偏向?qū)Π凑斩x與活性位點以外的位置結(jié)合的變構(gòu)分子的搜索。材料與方法激酶產(chǎn)生與標記如文獻(5-7)所述構(gòu)建、表達和純化帶有N-末端6xHis標簽的Abl激酶KD。然后通過標準程序在標記緩沖液(0.1MTris緩沖液pH8.0，20mMNaCl，5mMTCEP，5％甘油)中透析該蛋白質(zhì)。為了進行標記，蛋白質(zhì)濃度應(yīng)為2-5mg/mL。更低的濃度是可以接受的，但是標記時間可能需要相應(yīng)地調(diào)整。為了使蛋白質(zhì)上升到此濃度水平，通過使用Centricon來濃縮蛋白質(zhì)可能是必要的。將濃縮的蛋白質(zhì)(2-5mg/mL)與PyMPO-MALEIMIDETM(1-(2-馬來酰亞胺基乙基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)噁唑-2-基)吡啶鎓甲磺酸鹽)(Invitrogen)以1:12的摩爾比混合。馬來酰亞胺探針對半胱氨酸具有高度特異性。將標記反應(yīng)中的DMSO濃度限制為約3％或更低。然后將標記反應(yīng)轉(zhuǎn)移到帶有攪拌葉片的干凈的錐形玻璃標記瓶中，并將反應(yīng)置于攪拌盤上的箔包內(nèi)部，在輕輕攪拌下于室溫下放置1小時。采用制造商公布的方案，在測量/加樣緩沖液(0.1MTris，緩沖液pH8.0，20mMNaCl)的一份濃縮(stacking)緩沖液中用Zeba旋轉(zhuǎn)柱對標記的蛋白質(zhì)進行柱純化。在這種情況下，蛋白質(zhì)：染料的化學(xué)計量經(jīng)分光光度法確定為約1：2。質(zhì)譜分析證實該探針標記了激酶中的兩個半胱氨酸。玻璃器皿和超聲波儀的準備在開始前(20分鐘)用食人魚洗液(Piranhawash)清潔所有玻璃器皿。小心使用。食人魚洗液是高度放熱的，并且容易爆炸，特別是當與有機物接觸時。在通風櫥中、在耐熱玻璃器皿(例如Pyrex)中，通過先量出H2O2再加入醋酸來制備溶液。用氯仿(CHCl3)漂洗真空瓶。確定DOPC脂質(zhì)與DGSNTA(Ni)的所需摩爾比，同時注意盡可能地避免暴露于空氣。將含有脂質(zhì)混合物的真空瓶放到Rotovap蒸發(fā)器上。蒸發(fā)至干(約30秒)，然后用N2氣體吹過蒸發(fā)后的制品10分鐘以除去殘留的CHCl3。在2mL的diH2O中重懸浮脂質(zhì)混合物。劇烈渦旋振蕩直到渾濁懸浮液形成(大約5分鐘)。將該懸浮液轉(zhuǎn)移至4mL聚苯乙烯試管中。在冰上超聲處理脂質(zhì)混合物，直至溶液澄清。超聲波儀被設(shè)定為25％功率時這應(yīng)該需要約60至90秒。將超聲處理后的脂質(zhì)溶液轉(zhuǎn)移到微量離心管中，并在4℃下以17,000×G離心30分鐘。將上清液轉(zhuǎn)移到干凈的微量離心管中，并將成品脂質(zhì)制劑儲存在4℃，其穩(wěn)定大約1個月。載玻片準備和蛋白質(zhì)上樣在臨施加DOPC/DGSNTA(Ni)脂質(zhì)前，用食人魚洗液清洗顯微鏡載玻片20分鐘。在載玻片染色容器中用diH2O漂洗三次。用壓縮氮氣干燥載玻片。通過將粘合墊圈附接至用食人魚洗液清洗過的載玻片上來組裝SHG孔(即，每個載玻片16個孔，包含10-20μl體積)。使用裝配夾具來對齊墊圈，小心地將載玻片放入夾具中，并用力按壓。用PBS或TBS緩沖液1：1稀釋DOPC/DGSNTA(Ni)脂質(zhì)制劑。需要100mMNaCl來減少載玻片的流體靜電荷，并使SLB能夠形成。將10μl稀釋的DOPC/DGSNTA(Ni)脂質(zhì)移取到載玻片的孔中，并在室溫下孵育5分鐘。通過將載玻片浸沒在緩沖液浴(PBS或TBS)中并用200μL移液器攪動來清洗各孔，在任何時候都要注意不要向孔中引入空氣。將液浴中的整個體積的緩沖液更換為新鮮緩沖液，并再重復(fù)洗滌步驟兩次。向所有孔中加入1：1體積的100mMNiCl2溶液，并在室溫下孵育10分鐘。通過將載玻片浸沒在緩沖液浴(PBS或TBS)中并用200μL移液器攪動來清洗各孔。將液浴中的整個體積的緩沖液更換為新鮮緩沖液，并再重復(fù)洗滌步驟兩次。如果有必要，將孔中的緩沖更換為適當?shù)牡鞍踪|(zhì)上樣緩沖液，并將目的靶蛋白加載至孔中。在室溫下孵育30至90分鐘，隨后在開始實驗前用測定緩沖液對孔進行徹底的漂洗。將SUV施加到食人魚洗液清洗過的Fisher載玻片上，以制作SLB表面。添加NiCl210分鐘，并在標記緩沖液中洗滌各孔。將標記的蛋白質(zhì)以3μM加載到如上所述制備的SLB表面上45分鐘，隨后進行洗滌。圖1顯示該標記的蛋白質(zhì)在SLB上能夠通過SHG而檢測到。如果添加咪唑，則信號下降到基線水平，表明經(jīng)由蛋白質(zhì)的His標簽發(fā)生了與表面的附著。將伊馬替尼(通過晶體學(xué)得知其能夠結(jié)合至Abl激酶的活性位點口袋(6，8，9))以5μM的濃度加入到孔中并孵育10分鐘，以允許結(jié)合到ATP口袋(活性位點)。然后向孔中加入候選變構(gòu)調(diào)節(jié)劑并監(jiān)測SHG信號以檢測候選劑在標記位點處改變構(gòu)象的能力。陽性“命中(hit)”被鑒別為在其添加后改變基線信號的候選變構(gòu)調(diào)節(jié)劑。實施例2：標記位于參與配偶體結(jié)合事件的靶蛋白區(qū)域中的位點進行多種突變以將半胱氨酸插入到已知參與PI3K效應(yīng)子結(jié)合的H-Ras區(qū)域中。可以任選地將天然半胱氨酸殘基C118突變?yōu)楸彼峄蚪z氨酸。使用質(zhì)譜法和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方案檢測突變體被SHG探針PyMPO-MALEIMIDETM(1-(2-馬來酰亞胺基乙基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)噁唑-2-基)吡啶鎓甲磺酸鹽)標記的能力。例如，已知天然殘基酪氨酸Y64參與PI3K結(jié)合。因此，根據(jù)標準方案(10)制備具有雙突變(C118A，Y64C)的重組6×-His標記的(N-末端)H-Ras蛋白質(zhì)。在室溫下，在0.1MTrispH8.0、20mMNaCl、0.5mMTCEP、5％甘油中，采用12：1的染料：蛋白質(zhì)比，使用半胱氨酸反應(yīng)性SHG探針PyMPO-MALEIMIDETM(1-(2-馬來酰亞胺基乙基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)噁唑-2-基)吡啶鎓甲磺酸鹽)標記H-Ras一小時。通過凝膠過濾純化除去未反應(yīng)的染料。通過質(zhì)譜法確認第64位半胱氨酸的標記。使蛋白質(zhì)暴露于候選結(jié)合劑分子以僅僅識別那些與本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的對照(例如，DMSO緩沖液載體)相比以顯著方式在C64位點處改變Ras構(gòu)象的候選結(jié)合劑分子。如果工程化的半胱氨酸不能被標記，則對如本文所定義的在功能上與效應(yīng)子結(jié)合事件相關(guān)的位點進行突變并測試其被標記的能力。對其他的位點可以進行類似的程序。實施例3：以兩種或更多種不同的方式標記靶標，其中該兩種或更多種不同方式中的至少一種不涉及標記天然殘基寡聚PEG衍生化的載玻片如下制備：將載玻片染色容器在75℃/20英寸汞柱下在真空爐中清洗并干燥，然后使其冷卻至室溫。向染色容器中加入足夠的SAT(PEG4)(N-琥珀酰亞胺基S-乙酰基(硫代四乙二醇)；Pierce)的溶液，以覆蓋整個載玻片(約50mL)。將Ultrastick載玻片(氨基封端的硅烷衍生化的載玻片；Thermo)放置在染色架中并浸沒在染色容器中。載玻片在通風櫥(hood)中在室溫下孵育，攪拌2-3小時。然后從SAT(PEG4)溶液中取出載玻片，并將其轉(zhuǎn)移至含有無水氯仿的載玻片洗滌皿中。通過將洗滌皿浸泡在自來水中至其高度的2/3來超聲處理載玻片15分鐘。將載玻片轉(zhuǎn)移到第二洗滌皿中并用乙醇漂洗各個載玻片，然后用diH2O漂洗。最后，將清洗后的SAT(PEG4)載玻片放在37℃/20英寸汞柱的真空爐中直至干燥(30至60分鐘)。每孔加入15μL含有1mg/mL馬來酰亞胺基-C3-NTA的脫酰溶液。在玻璃罩下于室溫孵育20分鐘。用diH2O徹底洗滌，接著每孔加入15μL100mMNiCl2/TrispH7.2溶液。在室溫下孵育10分鐘。通過浸沒在特定實驗所需的上樣緩沖液中來洗滌各孔。用200μL移液器攪動。(但是，如果實驗需要使用PBS，則首先用水將NiCl2/TrispH7.2溶液從孔中洗出，然后用所需的緩沖液洗滌)。在任何時候都保持孔用適當?shù)木彌_液濕潤。使用本領(lǐng)域中已知的方法(11-13)創(chuàng)建具有N-末端8xHis標簽的二氫葉酸還原酶(DHFR)蛋白質(zhì)的突變體。在第一種情況下，構(gòu)建一種突變體，其中兩個天然半胱氨酸被除去(C85A和C152A)，而一個不同的殘基被突變?yōu)榘腚装彼?。為了選擇突變位點，將該蛋白質(zhì)的表面上的各種殘基突變成半胱氨酸，并測試其被SHG探針標記的能力。在第二種情況下，對野生型蛋白質(zhì)進行標記，并通過質(zhì)譜法確認探針與C152的連接。將野生型或重組蛋白質(zhì)純化至25mMTrispH7.2、150mMNaCl中。按照以下方案，使用PyMPO-MALEIMIDETM(1-(2-馬來酰亞胺基乙基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)噁唑-2-基)吡啶鎓甲磺酸鹽)對任一蛋白質(zhì)進行標記。將該蛋白質(zhì)在25mMTrispH7.2、150mMNaCl、1mMTCEP和約50μM的10％甘油中用20：1的染料：蛋白質(zhì)標記比(DMSO終濃度為5％)進行孵育。該蛋白質(zhì)在4℃下攪拌過夜，然后凝膠純化至25mMTris-HClpH7.2、150mMNaCl、1mMTCEP中。該蛋白質(zhì)經(jīng)由其His標簽被固定到PEG表面上。兩種蛋白質(zhì)都暴露于候選結(jié)合劑分子，以測定所述分子是否在不同(半胱氨酸)標記位點改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象。比較兩種不同標記的突變體的SHG響應(yīng)可以用來確定，例如，給定的候選結(jié)合分子在靶蛋白上的位點特異性響應(yīng)。例如，在來自不同的標記位點的SHG響應(yīng)相同的情況下，候選結(jié)合分子可以是非特異性地與該蛋白質(zhì)結(jié)合。實施例4：通過SHG技術(shù)測試已知變構(gòu)調(diào)節(jié)劑與Abl激酶的結(jié)合在本實施例中，利用二次諧波產(chǎn)生(SHG)檢測來研究基于X射線晶體學(xué)研究(NagarB等,Cell2003；112(6):859-871)已知會變構(gòu)結(jié)合Abl激酶的GNF-2是否在結(jié)合后誘導(dǎo)Abl激酶結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化。對GNF-2與Abl激酶的野生型和K419C突變體的結(jié)合都進行了研究。材料與方法載玻片清潔和組裝載玻片在100℃下在食人魚洗液(70％硫酸/30％過氧化氫)中洗滌20分鐘。使其離熱并讓其冷卻10分鐘。然后將載玻片從食人魚洗液中移出，并讓過量的溶液從載玻片上滴下。將載玻片放置在新的容器中，并在dH2O(超純18MOhm)中洗滌三次以除去任何殘留的食人魚洗液。從dH2O中取出載玻片，并通過將氮氣吹過載玻片而使其干燥。將含有16個孔的粘合硅隔離體放置在裝配夾具上，并將干燥的載玻片放置在隔離體上，隨后用Kimwipe向下按壓以使其牢固地粘附。脂雙層和蛋白質(zhì)上樣小單層囊泡(SUV)溶液通過用PBS按1：1稀釋SUV原液(DOPC脂質(zhì)/DGS-NTA/DHPE德克薩斯紅)來制備。向載玻片的各孔中加入10μL此1：1的SUV/PBS溶液，并在表面玻璃下于室溫孵育5分鐘。然后通過將整個載玻片浸入含有50mLPBS的容器中洗滌載玻片3次。各孔用PBS洗滌，并更換兩次200μL吸頭。然后從PBS中取出載玻片，各孔用20μLdH2O洗滌3次。該步驟對于防止在下一步使用的NiCl2溶液從溶液中沉淀出來是必要的。向各孔中加入10μL的0.1MNiCl2儲備溶液，從而在孔中產(chǎn)生0.05MNiCl2的最終溶液。將其在表面玻璃下于室溫孵育10分鐘。通過將整個載玻片浸沒在含有50mLPBS的容器中洗滌載玻片一次。各孔用PBS洗滌，并更換兩次200μL吸頭。然后通過將整個載玻片浸沒在含有50mL蛋白質(zhì)特異性反應(yīng)緩沖液(100mMTris，pH8.0，100mMNaCl，10mMMgCl2，1mMTCEP)的容器中洗滌載玻片三次。各孔用反應(yīng)緩沖液洗滌，并更換兩次200μL吸頭。將6×His標記的Abl-KD或KD-K419C(Seeliger等,Structure.2007；15:299-311)加到含有8μL反應(yīng)緩沖液的各孔中至5μM的終濃度。然后使蛋白質(zhì)在表面玻璃下在孔中于室溫孵育45分鐘。SHG測定將GNF2(SigmaAldrich)在DMSO中制備成10mM儲液。對于該實驗，在反應(yīng)緩沖液中制備20μM儲備溶液，該反應(yīng)緩沖液具有0.2％的DMSO終濃度。45分鐘后，使用BK-7匹配流體將載玻片放置在Artemis平臺中以安裝到道威(dove)棱鏡上。小心從載玻片下除去所有氣泡。使用Artemis平臺，進行洗滌前的行掃描以評價每個孔中的SHG水平。然后用20μL測定溶液(100mMTris，pH8.0，100mMNaCl，10mMMgCl2，1mMTCEP，0.2％DMSO)洗滌各孔5次。然后使用Artemis平臺，進行洗滌后的行掃描以獲得每個孔中的SHG水平。使用定制編寫的軟件將平臺移動至選定的孔。開始采集并記錄數(shù)據(jù)5-7秒以確定緩沖液注入前的基線。向孔中注入10μL測定溶液并混合。記錄SHG水平的變化約30秒。在此之后，阻斷激光輸出約5秒，以標記GNF2注入前的階段。隨后去除激光阻斷并使SHG信號返回至基線水平。隨后記錄數(shù)據(jù)約5秒，接著向孔中注入10μL20μMGNF2儲備溶液。孔中的GNF2終濃度為10μM。隨后在注入后記錄數(shù)據(jù)30秒，阻斷激光輸出約60秒，然后再記錄數(shù)據(jù)30-60秒。結(jié)果針對緩沖液注入和GNF2注入均測定了SHG水平的變化。通過在注入后15秒獲取SHG強度并除以注入前的基線SHG強度來確定所述變化。來自這些實驗的數(shù)據(jù)表明，用Abl激酶特異性抑制劑GNF2處理野生型Abl-KD或K419C突變體不會導(dǎo)致如通過SHG測到的構(gòu)象變化。雖然這些ABL-KD片段包含對于GNF2結(jié)合而言必需的結(jié)構(gòu)域，但這些片段缺乏在全長Abl激酶中所發(fā)現(xiàn)的SH3-SH2結(jié)構(gòu)域，如以下列出的同行評審的出版物中所表明的，對于響應(yīng)于GNF-2結(jié)合的構(gòu)象變化而言，該SH3-SH2結(jié)構(gòu)域是必需的。因此，SHG數(shù)據(jù)顯示在結(jié)合GNF-2后不發(fā)生構(gòu)象變化，如根據(jù)以前的X射線共晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)所預(yù)期的。因此，該實施例表明，SHG檢測是用于評估分子與靶蛋白的變構(gòu)結(jié)合的強大且相對快速的技術(shù)。實施例5：在天然胺和巰基上均標記蛋白質(zhì)并且偶聯(lián)到支持的脂雙層上本實施例表明，蛋白質(zhì)可以在天然胺和巰基上均被標記并通過組氨酸親和標簽偶聯(lián)到支持的脂雙層上，以供使用SHG技術(shù)進行檢測。材料與方法玻璃器皿和超聲波儀的準備：在開始前(20分鐘)用食人魚洗液清潔所有的玻璃器皿。用氯仿(CHCl3)漂洗真空瓶。隨后確定DOPC脂質(zhì)與DGSNTA(Ni)的所需摩爾比。對于本文所公開的數(shù)據(jù)，使用摻雜有0.5％德克薩斯紅DHPE的3％DGSNTA(Ni)、96.5％DOPC對支持的雙層進行成像。將含有脂質(zhì)混合物的真空瓶置于Rotovap蒸發(fā)器上，蒸發(fā)至干(大約30秒)。用N2氣體吹過蒸發(fā)后的制品上10分鐘以除去任何殘留的CHCl3。然后在2mLdiH2O中重懸浮脂質(zhì)混合物，并且劇烈渦旋振蕩直到渾濁懸浮液形成(大約5分鐘)。將懸浮液轉(zhuǎn)移至4mL聚苯乙烯試管中。在冰上超聲處理脂質(zhì)混合物，直至溶液澄清。然后將超聲處理后的脂質(zhì)溶液轉(zhuǎn)移到微量離心管中，并在4℃下以17,000×G離心30分鐘。隨后將上清液轉(zhuǎn)移到干凈的微量離心管中。將成品脂質(zhì)制劑儲存在4℃，其大約1個月是穩(wěn)定的。蛋白質(zhì)標記-溶液中半胱氨酸的標記：根據(jù)標準方案(6)制備重組His-標記的(N-末端)H-Ras蛋白。根據(jù)該方案制備的Ras蛋白與GDP結(jié)合。隨后在0.1MTrispH8.0、20mMNaCl、0.5mMTCEP、5％甘油中，以12：1的染料：蛋白質(zhì)比，用半胱氨酸反應(yīng)性染料PyMPO-MALEIMIDETM(1-(2-馬來酰亞胺基乙基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)噁唑-2-基)吡啶鎓甲磺酸鹽)在室溫下標記該蛋白質(zhì)一小時。通過凝膠過濾純化出未反應(yīng)的染料。所得的染料：蛋白質(zhì)比為0.7：1，并且是通過分光光度法所確定的。單一的半胱氨酸在Ras的X-射線晶體結(jié)構(gòu)中是溶劑可及的(Cys118)；這一發(fā)現(xiàn)符合所測的染料：蛋白質(zhì)比小于或等于1.0。半胱氨酸標記的Ras隨后直接偶聯(lián)至膜上。蛋白質(zhì)標記-溶液中胺的隨機標記：使用標準方案在pH8.3的碳酸氫鈉緩沖液(Invitrogen,Inc.)中標記Ras蛋白中的胺基團，并且通過凝膠過濾和透析進行純化。然后胺標記的Ras直接偶聯(lián)至膜上。載玻片準備和蛋白質(zhì)上樣：在臨施加DOPC/DGSNTA(Ni)脂質(zhì)前，用食人魚洗液清潔顯微鏡載玻片20分鐘，隨后在載玻片染色容器中用diH2O漂洗三次。用壓縮氮氣干燥載玻片。通過將粘合墊圈附接至用食人魚洗液清潔過的載玻片上來組裝SHG孔。用PBS或TBS緩沖液1：1稀釋dDOPC/DGSNTA(Ni)脂質(zhì)制劑。需要100mMNaCl來減少載玻片的流體靜電荷，并使SLB能夠形成。將10μL稀釋的DOPC/DGSNTA(Ni)脂質(zhì)移取到載玻片的孔中，隨后在室溫下孵育5分鐘。通過將載玻片浸沒在緩沖液浴(PBS或TBS)中并用200μL移液器攪動來清洗各孔兩次。要小心確保在任何時候都沒有空氣被引入孔中。向所有孔中加入1：1體積的100mMNiCl2溶液并在室溫下孵育10分鐘。通過將載玻片浸沒在緩沖液浴(PBS或TBS)中并用200μL移液器攪動來清洗各孔兩次。隨后將孔中的緩沖液更換為適當?shù)牡鞍踪|(zhì)上樣緩沖液。通過采用德克薩斯紅-DHPE對表面進行表面熒光成像來證實流體支持的脂雙層。如本領(lǐng)域已知的，該雙層的側(cè)向移動性通過光漂白后的熒光恢復(fù)被證實。隨后向孔中加入目的靶蛋白，并在室溫下孵育30至90分鐘。在開始實驗之前用測定緩沖液對孔進行徹底漂洗。結(jié)果將標記的H-Ras蛋白(通過胺或半胱氨酸)以3μM加載到支持的脂雙層(SLB)表面上45分鐘，然后進行洗滌。圖3顯示該標記的蛋白質(zhì)在SLB上能夠通過SHG而檢測到。如果加入咪唑，則信號下降至基線水平，表明經(jīng)由蛋白質(zhì)的His標簽發(fā)生了與表面的附著。本實施例表明，Ras蛋白可以在天然胺和巰基上均被標記并且經(jīng)由N-末端組氨酸親和標簽偶聯(lián)到支持的脂雙層上，以供使用SHG技術(shù)進行檢測。實施例6：檢測蛋白質(zhì)中兩個不同位點處的構(gòu)象變化，以研究試劑結(jié)合的特異性及蛋白質(zhì)結(jié)合位點的功能性本實施例證明了檢測蛋白質(zhì)中兩個不同位點處的構(gòu)象變化如何提供關(guān)于結(jié)合劑的特異性的信息。在本實施例中，一個位點是Ras中的溶劑可及的半胱氨酸(C118)，如在解析的Ras蛋白的X射線晶體結(jié)構(gòu)(PDB編碼3L8Z、5P21等)中所鑒別的。其他位點為帶有自由胺(賴氨酸)的位點。對幾種化合物在這兩個位置(半胱氨酸位點vs.胺位點)改變構(gòu)象的能力進行了檢測。一種化合物只在胺位點而不在半胱氨酸位點產(chǎn)生構(gòu)象變化，表明該化合物特異性地結(jié)合Ras。本實施例也表明了如何能標記并研究蛋白質(zhì)中的功能上相關(guān)的位點：半胱氨酸118接近Ras的催化區(qū)(半胱氨酸殘基的硫原子SG與3L8Z結(jié)構(gòu)中的核苷酸的磷酸原子PA之間的距離為1.6nm)，并因此提供了有關(guān)這些化合物是否能夠在催化區(qū)中特異性地改變構(gòu)象的信息。針對通過N端6X組氨酸標簽鏈接到SLB表面上的隨機標記的(胺標記的)和半胱氨酸標記的野生型H-Ras蛋白，測試一組三個小分子。材料與方法采用兩個方案中的一個，將PyMPO-SETM(1-(3-(琥珀酰亞胺氧羰基)芐基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)噁唑-2-基)吡啶鎓溴化物)偶聯(lián)到His標記的野生型H-Ras(Novus)上。在第一方案中，蛋白質(zhì)首先結(jié)合至支持的脂雙層的表面(通過SUV和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標準方案制備得到的含有3％Ni-NTADOGS的DOPC)，隨后于洗滌前暴露于10μMPyMPO-SETM(1-(3-(琥珀酰亞胺氧羰基)芐基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)噁唑-2-基)吡啶鎓溴化物)30分鐘。或者，使用標準第二方案在pH8.3的碳酸氫鈉緩沖液(Invitrogen,Inc.)中標記Ras并通過凝膠過濾和透析進行純化。標記的Ras然后直接偶聯(lián)到膜上。在第二方案中，用半胱氨酸反應(yīng)性SHG探針PyMPO-MALEIMIDETM(1-(2-馬來酰亞胺基乙基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)噁唑-2-基)吡啶鎓甲磺酸鹽)標記H-Ras。根據(jù)標準方案(Hall等,2002,Proc.Nat.Acad.Sci.,U.S.A.,99(19):12138-42)制備重組的His-標記(N-末端)的H-Ras蛋白。根據(jù)該方案制備的Ras蛋白與GDP結(jié)合。隨后在0.1MTrispH8.0、20mMNaCl、0.5mMTCEP、5％甘油中，以12：1的染料：蛋白質(zhì)比，用半胱氨酸反應(yīng)性染料PyMPO-MALEIMIDETM(1-(2-馬來酰亞胺基乙基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)噁唑-2-基)吡啶鎓甲磺酸鹽)在室溫下標記該蛋白質(zhì)一小時。通過凝膠過濾純化出未反應(yīng)的染料。如通過分光光度法所確定的，所得的染料：蛋白質(zhì)比為0.7：1。使三種化合物暴露于標記的Ras：化合物1：117028，5-溴-7-[(4-苯基哌嗪-1-基)甲基]喹啉-8-醇；化合物2：643000，2-(1H-咪唑-2-基甲基)-4-(1H-咪唑-4-基甲基)-1H-咪唑；和化合物3：662796，1H-吡啶并[2,3-E][1,2,4][三氮雜-1-酮，2,3-二氫-4-[(嗎啉代乙?；?氨基]。通過以3X濃度(30μM)將5μL化合物1至3分開加到孔中的10μL測定緩沖液中然后輕柔混合，誘發(fā)經(jīng)固定的Ras靶蛋白的構(gòu)象變化。各化合物的終濃度為10μM。測定緩沖液為20mMTrispH8.0，150mMNaCl，0.5mMDTT，0.15％DMSO。結(jié)果結(jié)果總結(jié)于表1中?；衔?對胺和半胱氨酸標記的蛋白質(zhì)都表現(xiàn)出活性，而化合物2只對胺標記的蛋白質(zhì)表現(xiàn)出有活性?；衔?不與Ras蛋白反應(yīng)，這與標記物的位置無關(guān)。暴露于空白雙層(無蛋白質(zhì))隨后進行洗滌的PyMPO-SETM(1-(3-(琥珀酰亞胺氧羰基)芐基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)噁唑-2-基)吡啶鎓溴化物)不產(chǎn)生高于背景的信號。因此，在標記后的蛋白質(zhì)的存在下檢測到的信號是由于固定在膜上的該蛋白質(zhì)本身的標記引起的?；衔?的位點依賴性活性提供了對其特異性結(jié)合蛋白質(zhì)的額外支持?；衔?，因為它在功能上相關(guān)的半胱氨酸位點處有活性，因此很可能對附近(納米距離)的催化區(qū)有影響。圖4示出了胺標記的H-Ras靶蛋白的數(shù)據(jù)。圖5示出了半胱氨酸標記的H-Ras靶蛋白的數(shù)據(jù)。在以20μM的2倍濃度手動注入每種化合物前，采集基線SHG測量結(jié)果約5秒鐘。在注入后，實時監(jiān)測構(gòu)象變化約60秒的一段時間。根據(jù)探針在胺或半胱氨酸位點上的安置，觀察所施加的化合物的差異活性。表1：化合物對通過本文中描述的兩種不同方法標記的H-Ras的活性的總結(jié)表。該實驗表明，SHG可用于鑒別這樣的小分子化學(xué)化合物：該化合物能夠誘導(dǎo)鏈接到支持脂雙層上的Ras蛋白的結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化。實施例(其純粹是本發(fā)明的示例，因此不應(yīng)被認為以任何方式限制本發(fā)明)還描述并詳述了以上討論的發(fā)明的方面和實施方案。上述實施例和詳述是以舉例說明的方式提供的，而不是以限制的方式提供的。本說明書中引用的所有出版物、專利申請和專利均通過引用并入本文，如同具體地和單獨地指出每個單獨的出版物、專利申請或?qū)＠ㄟ^引用并入本文那樣。特別地，本文引用的所有出版物均明確地通過引用并入本文，用于描述和公開可能與本發(fā)明結(jié)合使用的組合物和方法學(xué)的目的。盡管為了清楚理解的目的已通過舉例說明和實施例的方式相當詳細地描述了前述發(fā)明，但本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)將會輕易地明白，可以對其進行某些變更和修改而不脫離所附權(quán)利要求的精神或范圍。參考文獻1.ChristopoulosA.Allostericbindingsitesoncell-surfacereceptors:noveltargetsfordrugdiscovery.NatRevDrugDiscov.2002；1(3):198-210.2.SchneiderE,KellerM,BrennauerA,HoefelschweigerBK,GrossD,WolfbeisOS等,SynthesisandCharacterizationoftheFirstFluorescentNonpeptideNPYY1ReceptorAntagonist.ChemBioChem.2007；8(16):1981-8.3.CampagnolaPJ,LoewLM.Secondharmonicimagingmicroscopyforvisualizingbiomoleculararraysincells,tissuesandorganisms.NatureBiotechnology.2003；21(11):1356-60.4.MillardAC,CampagnolaPJ,MohlerW,LewisA,LoewLM.Secondharmonicimagingmicroscopy.Biophotonics,PtB2003.p.47-69.5.ShanYB,SeeligerMA,EastwoodMP,FrankF,XuHF,JensenMO等,Aconservedprotonation-dependentswitchcontrolsdrugbindingintheAblkinase.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica.2009；106(1):139-44.6.SeeligerMA,RanjitkarP,KasapC,ShanYB,ShawDE,ShahNP等,EquallyPotentInhibitionofc-SrcandAblbyCompoundsthatRecognizeInactiveKinaseConformations.CancerResearch.2009；69(6):2384-92.7.SeeligerMA,YoungM,HendersonMN,PellicenaP,KingDS,FalickAM等,Highyieldbacterialexpressionofactivec-Ablandc-Srctyrosinekinases.ProteinScience.2005；14(12):3135-9.8.NagarB,HantschelO,YoungMA,ScheffzekK,VeachD,BornmannV等,Structuralbasisfortheautoinhibitionofc-Abltyrosinekinase.Cell.2003；112(6):859-71.9.SeeligerMA,NagarB,FrankF,CaoX,HendersonMN,KuriyanJ.c-SrcbindstothecancerdrugimatinibwithaninactiveAbl/c-Kitconformationandadistributedthermodynamicpenalty.Structure.2007；15:299-311.10.HallBE,Bar-SagiD,NassarN.ThestructuralbasisforthetransitionfromRas-GTPtoRas-GDP.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences.2002；99(19):12138-42.11.RajagopalanPTR,ZhangZ,McCourtL,DwyerM,BenkovicSJ,HammesGG.Interactionofdihydrofolatereductasewithmethotrexate:Ensembleandsingle-moleculekinetics.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica.2002；99(21):13481-6.12.GoodeyNM,BenkovicSJ.Allostericregulationandcatalysisemergeviaacommonroute.NatChemBiol.2008；4(8):474-82.13.AntikainenNM,SmileyRD,BenkovicSJ,HammesGG.ConformationCoupledEnzymeCatalysis:，Single-MoleculeandTransientKineticsInvestigationofDihydrofolateReductase，Biochemistry.2005；44(51):16835-43.14.NagarB等,Structuralbasisfortheautoinhibitionofc-Abltyrosinekinase.Cell2003；112(6):859-871.15.HarrisonSC.VariationonanSrc-likeTheme.Cell2003；112(6):737-740.當前第1頁1 2 3