專利名稱：恢復p53家族蛋白質(zhì)的構象穩(wěn)定性的方法和組合物的制作方法
1.發(fā)明領域本發(fā)明涉及癌癥治療領域。本發(fā)明提供能夠與p53家族的腫瘤抑制劑蛋白質(zhì)相互作用并且穩(wěn)定其中功能構象的有機非肽類化合物。本發(fā)明特別適用于穩(wěn)定患者體內(nèi)腫瘤抑制劑蛋白的突變形式，對于所述患者來說，校正該蛋白質(zhì)的功能能力能有利于癌癥治療。還提供了篩選這樣的化合物的方法。
11.發(fā)明背景一種蛋白質(zhì)的一級結(jié)構是連接在一起形成蛋白質(zhì)的多肽鏈的氨基酸結(jié)構單元的特定序列。這些多肽鏈接著折疊成三維結(jié)構?，F(xiàn)在認為多種不同的疾病是由細胞蛋白質(zhì)的三維結(jié)構中的構象微擾產(chǎn)生的(參見綜述Thomas等，1995，TIBS 20456-459；Carrell等，1997，Lancet 350134-138)。例如，早老性癡呆由β-淀粉樣蛋白的錯折疊和接下來的聚集引起，導致?lián)p害細胞功能。類似地，Creutzfeld-Jakob疾病的病原體物質(zhì)，朊病毒，據(jù)認為通過引發(fā)將正常的朊病毒蛋白轉(zhuǎn)化為錯折疊朊病毒蛋白的鏈反應而引起疾病。
采取不正常構象的蛋白質(zhì)會如此，或者因為它們固有地易錯折疊或者因為它們具有突變，該突變相對于野生型蛋白質(zhì)來說熱力學上將突變體蛋白質(zhì)去穩(wěn)定化。導致疾病的錯義突變體的基本例子是腫瘤抑制蛋白p53。
野生型p53作為協(xié)調(diào)調(diào)控細胞周期，編程性細胞死亡和血管生成中多個途徑的轉(zhuǎn)錄調(diào)控物起作用。監(jiān)測細胞應力反應，例如DNA損傷，有絲分裂紡錘體錯裝配，缺氧的細胞途徑看起來都集中在p53上。p53活性的損失可以導致受影響的細胞的不受控制的增殖和腫瘤生長。盡管p53活性的損失其本身可以或可以不被觸發(fā)將細胞轉(zhuǎn)化成癌細胞，可檢測到的癌癥更通常和可能在具有p53突變的人中生長。事實上，p53的突變體在癌癥中最通常是遺傳畸變的。
最近，兩種另外的蛋白質(zhì)，p73和p63，經(jīng)鑒定與p53具有同源性(綜述參見Kaelin，1999，J.Natl.Cancer Inst.91594-598；也參見Yang等，1998，分子細胞(Molecular Cell)2(3)305-16；和Yoshikawa等.，1999，致癌基因(Oncogene)18(22)3415-21)。p51也稱為p40，p51，KET或p73L。這些蛋白質(zhì)不只是具有與p53的氨基酸序列同源性，并且它們也激活p53應答啟動子并且誘導編程性細胞死亡。此外，編碼這些蛋白質(zhì)的基因看起來遺傳學上與p53相關。因此，存在本領域確認的蛋白質(zhì)家族相關的p53，其具有相似功能和相關的氨基酸序列。
p53是一種具有三個獨立功能結(jié)構域的復合大分子誘導轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構域的N-末端(大約氨基酸1-43)；一個編碼DNA結(jié)合域(DBD)的中心部分(大約氨基酸100-300)；和作為寡聚作用結(jié)構域起作用的C-末端部分(大約氨基酸319-360)。這些p53 DBD的結(jié)晶結(jié)構表明具有高β-折疊含量的大概的球狀球形結(jié)構域。
p53活性高度取決于蛋白質(zhì)維持其功能構象的穩(wěn)定性的能力。來自很多不同癌癥的腫瘤分析表明DBD常常發(fā)生突變。Friedlander等，1996，生物化學雜志(J.Biol.Chem.)2712546825478。盡管有大量不同的在主要癌癥中的p53DNA結(jié)合結(jié)構域中發(fā)生的定點突變(Pavletich等，1993，Genes & Development 7，25562564)，但是已知為熱點的p53 DBD中的具體殘基位置不經(jīng)常高發(fā)生率發(fā)生突變。通常在人腫瘤中發(fā)現(xiàn)的熱點突變多少隨機地分布于DBD。當接觸脲時，所有常見的p53突變形式的p53 DBD比野生型DBD更不穩(wěn)定(Bullock等，上文)。另外，p53突變體經(jīng)常與細胞中的熱激蛋白有關，得出它們不能保持天然構象的結(jié)論(Finlay等，1988，分子和細胞生物學(Molecular and Cellular Biology)8531-39)。
發(fā)現(xiàn)與p53的C-末端結(jié)構域的相互作用激活p53的細胞周期停滯性質(zhì)。具體地說，將C-末端特異性p53抗體注射到周期細胞中可以捕獲它們(Mercer等，1982，美國國家科學院院刊(Proc.Nat.Acad.Sci.USA)79，6309-6312)。更詳細的研究證明，C-末端結(jié)構域調(diào)控DBD結(jié)構域的DNA結(jié)合活性。例如，Hupp發(fā)現(xiàn)單克隆抗體Pab 421，其與p53 C-末端結(jié)構域的殘基373-381相互作用，能增強某些突變形式的p53的DNA結(jié)合活性(Hupp等，1993，核酸研究(Nucleic Acids Research)213167-3174)。因此，Hupp及其同事集中研究中和C-末端中獨立的負調(diào)控結(jié)構域的抗體和肽，試圖恢復p53功能(Selivanova等，1997，天然藥物(Nature Med.)3，632-638)。但是，通過該方法恢復的273位突變與其它常見突變的不同之處在于它們保持高基礎DNA結(jié)合活性并且表現(xiàn)出類似于野生型蛋白質(zhì)的熱動力學穩(wěn)定特征(Bullock等，1997，美國國家科學院院刊(Proc.Nat.Acad..Sci.USA)94，14338-143421)。
本領域其它研究人員證明開發(fā)一種結(jié)合突變體p53的N-末端結(jié)構域的化合物是恢復野生型p53活性的最有效途徑。例如，F(xiàn)riedlander等試驗了很多種結(jié)合p53上定義的表位的不同的單克隆抗體以獲得促進溫度敏感p53突變體的DNA結(jié)合活性的穩(wěn)定性。Friedlander等，1996，生物化學雜志(J.Biol.Chem.)271，25468-25478。但是在較低的溫度下C-末端特異性抗體PAb 421不恢復對突變體p53的DNA結(jié)合功能，而N-末端特異性p53抗體，特別是單克隆抗體Pabl 801，在升高的溫度下在促進溫度敏感p53突變體的DNA結(jié)合活性方面更有效。以這些發(fā)現(xiàn)為基礎，F(xiàn)riedlander等推測通過與N-末端結(jié)合上模擬1801表位識別區(qū)的小分子會有利于突變體p53中的野生型DNA結(jié)合活性。值得注意的是，F(xiàn)riedlander等證明對p53蛋白質(zhì)的中心部分(DBD結(jié)構域)中的表位特異性的抗體對DNA結(jié)合活性沒有影響。作為他們的結(jié)論的一種解釋，F(xiàn)riedlander等假設通過使用一個遠的結(jié)構域穩(wěn)定一種蛋白質(zhì)中的一種結(jié)構域的構象。Bullock等證明通常發(fā)生的p53DNA結(jié)合域突變體中熱動力學穩(wěn)定性中的變化確實很小，并且推測對于p53開發(fā)小分子治療，例如如Friedlander等提議的(即與N-末端結(jié)合的分子)可能是容易的。Bullock等，1997，上文。
鑒定抗癌藥物的其它更普遍的方法關鍵在于在以細胞為基礎的(例如腫瘤細胞系)或動物分析中分析小分子的直接的抗腫瘤活性。曾經(jīng)描述過具有可能的抗腫瘤活性的多種小分子。Mazerska等，1990，抗腫瘤藥物設計(Anti-Cancer Drug Design)5，169-187；Su等，1995，藥物化學雜志(J.Med.Chem.)38，3226-3235；Nagy等，1996，抗癌研究(Anticancer Research)16，1915-1918；Wuonola等，1997，抗癌研究(Anticancer Research)17，3409-23。Mazerska等描述了一系列硝基-9-氨基吖啶，其中硝基與吖啶連接，其抗腫瘤性質(zhì)歸因于它們結(jié)合DNA并且產(chǎn)生共價鏈間交聯(lián)的能力。Su等描述了開發(fā)為拓撲異構酶II的帶有各種位置苯胺和被取代的吖啶環(huán)的一系列9-苯胺吖啶衍生物。Nagy等描述了一系列通過短的碳連接體與脲或者以苯二亞酰亞氨基為基礎的基團連接的吩噻嗪-相關化合物。Nagy等假設這類化合物的抗腫瘤細胞活性來自它們與鈣通道和鈣調(diào)蛋白反應的能力。Wuonola等，上文，描述了與上文Nagy等描述的化合物類似的吩噻嗪化合物。
迄今為止，還沒有報道過與p53家族蛋白質(zhì)相互作用以恢復或穩(wěn)定野生型活性，例如腫瘤抑制活性，的小的有機非肽分子。此外，這樣的化合物的發(fā)現(xiàn)由于缺乏高通量篩選或分析阻礙。
III發(fā)明概述認識到鑒定可以使與人疾病相關的熱動力學不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)或錯折疊蛋白質(zhì)構象穩(wěn)定化的化合物的重要性，和認識到其中這樣的化合物可能被快速鑒定的高通量分析系統(tǒng)的缺乏，本申請人研究了分離的突變體p53 DNA結(jié)合域(DBD)在其中快速鑒定將突變體p53構象穩(wěn)定化的物質(zhì)的體外和體內(nèi)分析中作為模型系統(tǒng)的用途。本發(fā)明提供了客觀鑒定促進p53家族蛋白質(zhì)野生型活性的化合物，包括人用藥物的快速可靠和準確的方法。
因此，本發(fā)明提供了非肽有機化合物可以與p53家族蛋白質(zhì)相互作用并且促進其野生型活性的第一次證明。在生理溫度或接近生理溫度時，這些活性化合物不只是在各種突變體p53蛋白質(zhì)中而且在野生型p53蛋白質(zhì)中促進p53的野生型活性。這樣的化合物具有作為抗癌藥物的重要用途。因此，本發(fā)明提供用于具有p53家族蛋白質(zhì)突變體或野生型活性的癌癥中的抗腫瘤治療的新的方法和化合物。
一方面，本發(fā)明提供了促進人p53家族蛋白質(zhì)的突變型中的野生型活性的方法，其中該蛋白質(zhì)的一個或多個功能活性至少部分被蛋白質(zhì)的在生理條件下保持功能構象的無能而損害，該方法包括使突變蛋白接觸能在生理條件下結(jié)合突變蛋白中的一個或多個結(jié)構域并且穩(wěn)定其中的功能構象，并且允許穩(wěn)定化的蛋白質(zhì)與參與野生型活性的一個或多個大分子相互作用的有機非肽化合物。所述人p53家族蛋白質(zhì)可以是，例如，p53，p63或p73。在優(yōu)選的實施方案中，所述有機非肽化合物與p53相互作用，更優(yōu)選地，與p53的DNA結(jié)合域相互作用。
在另一個實施方案中，本發(fā)明還提供了一種對人受治療者治療一種與具有一種或幾種減小的野生型活性的p53家族突變蛋白質(zhì)的表達有關的疾病狀態(tài)的方法，包括對受治療者施用一種能在生理條件下結(jié)合突變蛋白中的一個或多個結(jié)構域并且穩(wěn)定其中的功能構象；允許患者中穩(wěn)定化的蛋白質(zhì)與一種或幾種參與野生型活性的大分子相互作用的有機非肽化合物的步驟。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了對人受治療者治療癌癥的方法，包括下面的步驟對受治療者施用一種能在生理條件下結(jié)合人p53家族蛋白中的一個或多個結(jié)構域并且穩(wěn)定其中的功能構象，并且允許穩(wěn)定化的蛋白質(zhì)與參與野生型活性的一個或多個大分子相互作用的有機非肽化合物。
一方面，在本發(fā)明中使用的有機非肽化合物可以是包含通過一個特定長度的連接體連接在一起的一個疏水基團(例如平面多環(huán))和一個陽離子基團(優(yōu)選胺)的化合物。
在一個優(yōu)選方面，在本發(fā)明中使用的有機非肽化合物選自 其中對于第I組，
R5是-N-R18R19，其中R18是H，(C1-C6)烷基，或苯基，和R19is H，(C1-C6)烷基，(C3-C10)環(huán)烷基，或苯基，其中所述烷基，環(huán)烷基或苯基任選被羥基，(C3-C8)環(huán)雜烷基，-CONR18(CH2)pNR20R21，-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21，或-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21取代，其中p是0-5，m是0-5，n是0-5，R22是羥基或(C1-C6)烷基，和R20和R21各自獨立地選自(a)H，(C1-C12)烷基，(C3-C12)環(huán)烷基，(C3-C10)雜環(huán)烷基，(C6-C10)芳基，(C5-C9)雜芳基，(C1-C6)烷基(C6-C12)芳基，其中所述基團任選被一個或多個羥基，鹵基，氨基，三氟甲基，(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷氧基，(C1-C6)烷基(C3-C10)雜環(huán)烷基，或(C1-C6)烷基(C6-C12)芳基取代；或(b)NR20R21一起代表氫，嗎啉，或4-(C1-C6)烷基哌嗪；R6是is(a)(C1-C6)烷基或(C2-C8)鏈烯基，各自任選被一個或多個苯基取代，或者(b)被鹵基，(C1-C6)烷氧基取代的苯基；和R7和R8是相同或不同的，并且選自H，硝基，(C1-C6)烷氧基，或選自氟，氯和溴的鹵素；其中對于第II組， R9是(C1-C6)烷基，(C3-C10)環(huán)烷基，或苯基，其中所述烷基，環(huán)烷基或苯基任選被羥基，(C3-C8)環(huán)雜烷基，-CONR18(CH2)pNR20R21，-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21，或-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21取代，其中p是0-5，m是0-5，n是0-5，R22是羥基或(C1-C6)烷基，和R20和R21各自獨立地選自H，(C1-C12)烷基，(C3-C12)環(huán)烷基，(C3-C10)雜環(huán)烷基，(C6-C10)芳基，(C5-C9)雜芳基，(C1-C6)烷基(C6-C12)芳基，其中所述基團任選被一個或多個羥基，鹵基，氨基，三氟甲基，(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷氧基，(C1-C6)烷基(C3-C10)雜環(huán)烷基，(C1-C6)烷基(C5-C9)雜芳基，或(C1-C6)烷基(C6-C10)芳基取代；其中對于第III組， R10是-N-R18R19，其中R18是H，(C1-C6)烷基，或苯基，和R19is H，(C1-C6)烷基，(C3-C10)環(huán)烷基，或苯基，其中所述烷基，環(huán)烷基或苯基任選被羥基，(C3-C8)環(huán)雜烷基，-CONR18(CH2)pNR20R21，-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21，或-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21取代，其中p是0-5，m是0-5，n是0-5，R22是羥基或(C1-C6)烷基，和R20和R21各自獨立地選自(a)H，(C1-C12)烷基，(C3-C12)環(huán)烷基，(C3-C10)雜環(huán)烷基，(C6-C10)芳基，(C5-C9)雜芳基，(C1-C6)烷基(C6-C12)芳基，其中所述基團任選被-個或多個羥基，鹵基，氨基，三氟甲基，(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷氧基，(C1-C6)烷基(C3-C10)雜環(huán)烷基，(C1-C6)烷基(C5-C9)雜芳基或(C1-C6)烷基(C6-C10)芳基取代；或(b)NR20R21一起代表氫，嗎啉，或4-(C1-C6)烷基哌嗪；A和B是相同或不同的并且各自代表碳或氮；和R11和R12是相同或不同的，并且選自H，硝基，(C1-C6)烷氧基，或選自氟，氯和溴的鹵素；其中對于第IV組， R13是-N-R18R19，其中R18是H，(C1-C6)烷基，或苯基，和R19is H，(C1-C6)烷基，(C3-C10)環(huán)烷基，或苯基，其中所述烷基，環(huán)烷基或苯基任選被羥基，(C3-C8)環(huán)雜烷基，-CONR18(CH2)pNR20R21，-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21，或-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21取代，其中p是0-5，m是0-5，n是0-5，R22是羥基或(C1-C6)烷基，和R20和R21各自獨立地選自(a)H，(C1-C12)烷基，(C3-C12)環(huán)烷基，(C3-C10)雜環(huán)烷基，(C1-C6)烷基(C5-C9)雜芳基，(C5-C9)雜芳基，(C6-C10)芳基，和(C1-C6)烷基(C6-C10)芳基，其中所述基團任選被一個或多個羥基，鹵基，氨基，三氟甲基，(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷氧基，(C1-C6)烷基(C3-C10)雜環(huán)烷基，(C1-C6)烷基(C5-C9)雜芳基和(C1-C6)烷基(C6-C10)芳基取代；或(b)NR20R21一起代表氫，嗎啉，或4-(C1-C6)烷基哌嗪；A和B是相同或不同的并且各自代表碳或氮；和R14和R15是相同或不同的，并且選自H，硝基，(C1-C6)烷氧基，或選自氟，氯和溴的鹵素；和其中對于第V組， A是碳或氮；R16是-N-R18R19，其中R18是H，(C1-C6)烷基，或苯基，和R19is H，(C1-C6)烷基，(C3-C10)環(huán)烷基，或苯基，其中所述烷基，環(huán)烷基或苯基任選被羥基，(C3-C8)環(huán)雜烷基，-CONR18(CH2)pNR20R21，-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21，或-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21取代，其中p是0-5，m是0-5，n是0-5，R22是羥基或(C1-C6)烷基，和R20和R21各自獨立地選自(a)H，(C1-C12)烷基，(C3-C12)環(huán)烷基，(C3-C10)雜環(huán)烷基，(C6-C10)芳基，(C5-C9)雜芳基，(C1-C6)烷基(C6-C10)芳基，和(C1-C6)烷基(C5-C9)雜芳基，或者其中所述基團任選被一個或多個羥基，鹵基，氨基，三氟甲基，(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷氧基，(C1-C6)烷基(C3-C10)雜環(huán)烷基，(C1-C6)烷基(C5-C9)雜芳基或(C1-C6)烷基(C6-C10)芳基取代；或(b)NR20R21一起代表氫，嗎啉，或4-(C1-C6)烷基哌嗪；R17選自H，硝基，(C1-C6)烷氧基，或選自氟，氯和溴的鹵素。
另外，在實施本發(fā)明中有用的很多化合物本身是新的，這里對于這樣的化合物的描述定義了本發(fā)明的又一方面。
本發(fā)明另一方面還提供了設計促進p53家族蛋白質(zhì)的野生型活性的另外的化合物的方法。該方法要求使用本發(fā)明的一種活性化合物來提出一種假設，鑒定一種符合該假設的候選化合物，并且測定該候選化合物是否促進p53家族蛋白質(zhì)的野生型活性。
本發(fā)明的另一方面是一種組合物，含有一種p53家族蛋白質(zhì)和與該蛋白質(zhì)相互作用并且促進該蛋白質(zhì)的野生型活性的非肽化合物的一種復合物。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種篩選促進p53家族蛋白質(zhì)的野生型活性的方法。在優(yōu)選的方面，該方法包括檢測與p53DNA結(jié)合域(DBD)相互作用的化合物，并且測定在該化合物的存在下p53DBD的構象。但是，本發(fā)明還涉及p53家族全長和部分蛋白質(zhì)在這樣的篩選方法中的用途。在一個特別實施方案中，同時進行檢測和測定步驟。任選地體內(nèi)對發(fā)現(xiàn)促進p53家族蛋白質(zhì)的突變型中的野生型活性的化合物篩選它們使腫瘤生長停止或抑制的能力。本發(fā)明的另一方面是通過對有機非肽化合物篩選與p53DBD的特異性相互作用的藥物發(fā)現(xiàn)的一種方法。
本發(fā)明鑒定促進p53家族的突變體或野生型蛋白質(zhì)中野生型活性的化合物的成功證明本發(fā)明的方法是可被廣泛用于對由構象缺陷或不穩(wěn)定蛋白質(zhì)誘導的一類疾病的藥物發(fā)現(xiàn)。這樣的蛋白質(zhì)靶物的例子包括pp60src，遍在蛋白活化酶El，囊性纖維化跨膜傳導調(diào)節(jié)劑，血紅蛋白，朊病毒蛋白，絲氨酸蛋白酶抑制劑，和β-淀粉狀蛋白。
IV.附圖的簡要說明

圖1. p53DBD上構象依賴性表位的調(diào)控。p53DBD固定在微量滴定孔中并且在升高的溫度下溫育。用ELISA分析測定保留在加熱的孔中的mAb 1620表位相對于冰中保持的對照孔的百分比。圖1A溫育0.5ng野生型p53DBD，并且以未加熱的對照物的百分比表示保留的mAb1620表位。標準偏差＜10％。圖1B固定1.25ng的FLAG-標記的p 53DBD，在45℃下加熱，并且以未加熱的對照物的百分比表示保留的抗-FLAG，mAb1620和mAb240表位。圖1C在37℃下加熱1.0ng的野生型和143位點突變體p53DBD，它表現(xiàn)出大約相等水平的mAb1620表位。并且以未加熱的對照物的百分比監(jiān)測表位的穩(wěn)定性。誤差條是重復4次的標準偏差。
圖2.突變體p53DBD上1620表位的穩(wěn)定化作用。圖2A代表性化合物稱之為化合物X，化合物Y和化合物Z，它們促進p53的構象穩(wěn)定性。圖2B將1ng的野生型p53DBD固定并且在化合物或等量濃度的DMSO賦形劑的存在下在45℃下加熱30分鐘。以未加熱的對照物的百分比表示保留的mAb1620表位。圖2C將具有接近相等水平的mAb1620表位的野生型和突變體p53DBD制劑(10％內(nèi))固定并且在化合物或賦形劑存在下在37℃下加熱30分鐘。以未加熱的對照物的百分比表示保留的mAb1620表位。誤差條是重復4次的標準差。
圖3.在攜帶p53突變體的細胞中調(diào)節(jié)p53構象和轉(zhuǎn)錄活性。圖3A在培養(yǎng)基中用16.5μg/ml化合物X處理表達173位突變體p53的H1299轉(zhuǎn)染子。使用全p53抗體，mAbDO-1，應用蛋白質(zhì)印跡，在總p53蛋白質(zhì)中使細胞溶胞產(chǎn)物以最小偏差標準化，在ELISA測試中測定表現(xiàn)出mAb1620表位的p53的量。用未處理細胞中1620-陽性p53級分校正1620-陽性p53級分的增加，圖3B在微量滴定孔中將攜帶熒光素酶報道基因(H1299/報道基因)或者攜帶該報道基因和173位點突變體p53(H1299/報道基因＋突變體p53)的匹配的H1299轉(zhuǎn)染子處理16小時。用沒有化合物存在下的表達的基礎水平校正是野生型p53功能的指征的熒光素酶報道基因的誘導的表達。數(shù)值代表重復4次的平均值。
圖4.攜帶突變體p53的細胞中WAF1表達的誘導。用16.5μg/ml化合物X將表達轉(zhuǎn)染的突變體p53蛋白質(zhì)(173位點或249位點)的Saos-2細胞在培養(yǎng)中處理16小時。使用總蛋白質(zhì)校正細胞溶胞產(chǎn)物并且用蛋白質(zhì)印跡分析。用mAbDO-1對該印跡的上部分探測總p53，并且用針對WAF1的抗體對相同印跡的下部分探測。
圖5.促進腫瘤中的p53構象穩(wěn)定性和功能。對帶有從H1299/報道基因＋突變體p53細胞產(chǎn)生的皮下腫瘤的小鼠一次腹膜內(nèi)注射100mg/kg化合物X并且以使用mAbDO-1的蛋白質(zhì)印跡的光密度掃描為基礎對雙份腫瘤溶胞產(chǎn)物校正總p53內(nèi)含物。在ELISA測試中測定表現(xiàn)出mAb1620表位的p53的量，并且用未處理腫瘤溶胞產(chǎn)物中1620-陽性p53級分校正1620-陽性p53級分的增加。也對腫瘤溶胞產(chǎn)物分析熒光素酶表達以評價p53轉(zhuǎn)錄活性的增強。對熒光素酶表達校正蛋白質(zhì)濃度并且與來自未處理腫瘤的的溶胞產(chǎn)物相比較。
圖6.表達突變的p53的腫瘤異種移植的抑制。用腫瘤細胞接種小鼠并且通過腹膜內(nèi)注射上述化合物X或賦形劑來處理。以每天一次(q.d.)或12小時間隔(b.i.d.)，施用化合物7天。賦形劑處理過的小鼠以12小時間隔接受注射。通過在兩維方向測定腫瘤直徑來確定腫瘤體積并且對每組5-7只小鼠取平均值。虛線代表當開始治療時開始的腫瘤體積。
V.發(fā)明的詳細描述腫瘤抑制基因產(chǎn)物p53中功能的損失可以導致在很多不同類型癌癥中觀察到的不受控制的增殖和/或細胞編程性細胞死亡的損失。即使在癌癥細胞中p53不發(fā)生突變，在這樣的一個細胞中促進野生型p53活性可以抑制癌性表型。本發(fā)明第一次證明，有機非肽化合物可以與p53家族的蛋白質(zhì)相互作用來穩(wěn)定其中的功能構象。因此，這樣的化合物作為治療所有類型的癌癥的藥物具有重要的用途。
因此，一方面，本發(fā)明提供了促進人p53家族蛋白質(zhì)的突變型的野生型活性的方法，其中該蛋白質(zhì)的一個或多個功能活性至少部分被蛋白質(zhì)的保持在生理條件下功能構象的無能而損害，該方法包括使突變蛋白接觸能在生理條件下結(jié)合突變蛋白中的一個或多個結(jié)構域并且穩(wěn)定其中的功能構象，并且允許穩(wěn)定化的蛋白質(zhì)與參與野生型活性的一個或多個大分子相互作用的有機非肽化合物。所述人p53家族突變蛋白質(zhì)可以是，例如，p53，p63或p73突變蛋白。在優(yōu)選的實施方案中，所述有機非肽化合物與p53相互作用，更優(yōu)選地，與p53的DNA結(jié)合域相互作用。
在另一個實施方案中，本發(fā)明還提供了一種對人受治療者治療一種與具有一種或幾種減小的野生型活性的p53家族突變蛋白質(zhì)的表達有關的疾病狀態(tài)的方法，包括對受治療者施用一種能在生理條件下結(jié)合突變蛋白中的一個或多個結(jié)構域并且穩(wěn)定其中的功能構象，并且允許患者內(nèi)穩(wěn)定化的蛋白質(zhì)與參與野生型活性的一個或多個大分子相互作用的有機非肽化合物的步驟。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了對人受治療者治療癌癥的方法，包括下面的步驟對受治療者施用一種能在生理條件下結(jié)合人p53家族蛋白中的一個或多個結(jié)構域并且穩(wěn)定其中的功能構象，并且允許穩(wěn)定化的蛋白質(zhì)與參與蛋白質(zhì)野生型活性的一個或多個大分子相互作用的有機非肽化合物。在本發(fā)明方法中穩(wěn)定的人p53家族蛋白可以是野生型或突變蛋白，例如p53，p63或p73。
盡管p53家族的蛋白質(zhì)是各種各樣的癌癥中的突變體，但是在某些癌癥或癌細胞類型中p53家族的蛋白質(zhì)(對p53本身進行了最充分的研究)的結(jié)構或功能被改變，即使涉及的細胞保持了野生型編碼等位基因。例如，參見Kaelin，1999，上文，對于與病毒相關的癌癥的討論，其中病毒蛋白質(zhì)降解p53蛋白，或者p53例如通過致癌基因的表達產(chǎn)物而被滅活或降解。給出細胞調(diào)節(jié)過程中p53家族的蛋白質(zhì)的重要性，本發(fā)明的化合物也用于在該蛋白質(zhì)的壽期和/或結(jié)構和/或活性正常的細胞中在生理條件下穩(wěn)定非突變p53家族成員的功能構象就顯而易見了。因此，本發(fā)明的化合物用來治療其中p53蛋白質(zhì)的功能等基本上不受癌癥狀態(tài)存在的影響的癌癥，并且也用于治療表達其異常還沒有可檢測地擴展到異常p53(或p53家族成員)功能，壽期或結(jié)構的前癌細胞的組織。另外，通過進一步穩(wěn)定(例如，引起延長的壽命)與惡性腫瘤病灶鄰近的或者在體內(nèi)以其它方式與惡性腫瘤細胞接觸的健康細胞中的p53家族的蛋白質(zhì)，可以控制癌癥的擴散。從這一點來說，本發(fā)明的化合物也是有用的。
根據(jù)本發(fā)明的實施，p53家族的蛋白質(zhì)定義為哺乳動物p53，p63，或p73；和/或具有與一種或多種下面的結(jié)構域總體具有至少50％，更優(yōu)選80％的氨基酸序列同源性的結(jié)構域的蛋白質(zhì)(1)轉(zhuǎn)錄激活需要的N-末端結(jié)構域，(2)DNA-結(jié)合結(jié)構域，或(3)哺乳動物p53，p63，或p73的寡聚作用結(jié)構域，其中通過任何認可的算法BLASTP v.2.0(www.ncbi.nlm.nih.gov)(Altschul等，1990，分子生物學雜志(J.of Molec.Biol.)，215403-410，＂BLAST算法；Altschul等，1997，核酸研究(Nuc.Acids Res.)253389-3402)，和W.U.-BLAST-2.0(從圣路易斯華盛頓大學，MO，USA獲得)確定所述同源性，并且其中所述蛋白質(zhì)證實具有至少一個本領域認可也是p53，p63，或p73的特征的功能(例如，激活響應啟動子并誘導編程性細胞死亡的能力；關于本領域認可的性質(zhì)的討論參見Kaelin，1999；Yang等，1998；和Yoshikawa等，1999，上述)。對于該方法的一般性討論和BLAST的優(yōu)點，Smith-Waterman和FASTA算法參見Nicholas等，1998，研究序列數(shù)據(jù)和序列評分方法指南(＂A Tutorialon Searching Sequence Databases and Sequence Scoring Methods＂)(www.psc.edu)和其中引用的參考。
穩(wěn)定p53家族蛋白質(zhì)的野生型構象的化合物是當與p53家族蛋白質(zhì)接觸時促進或恢復該蛋白質(zhì)的野生型活性例如DNA結(jié)合親和性或者與影響p53家族蛋白質(zhì)的正常功能的任何大分子相互作用的能力的化合物。p53的其它野生型活性包括但不限于轉(zhuǎn)錄激活活性(例如，WAF 1誘導作用)，細胞周期停滯，和編程性細胞死亡觸發(fā)。
另一方面，本發(fā)明包括本發(fā)明的化合物抑制腫瘤生長和/或治療癌癥的用途。本發(fā)明的特別優(yōu)點在于使用這里的方法這樣鑒定的化合物表現(xiàn)出不只是穩(wěn)定在篩選中所用的野生型p53DBD和突變體p53DBD的活性構象，而且還有其它突變體p53和p53DBD。因此這樣鑒定的化合物在治療各種癌癥中具有廣闊的應用。
本發(fā)明還提供了篩選促進p53家族蛋白質(zhì)的野生型構象并且可以對p53家族的突變蛋白質(zhì)恢復野生型活性的化合物的新的方法。使用本發(fā)明方法鑒定的化合物用于治療例如與p53家族蛋白質(zhì)活性缺陷相關的癌癥這樣的疾病。
本發(fā)明方法包括篩選與p53家族蛋白質(zhì)直接作用的化合物。這樣的方法可以使用用于篩選目的的p53家族全長蛋白質(zhì)(突變體或野生型)，或者至少包含DBD和任選地N-末端和/或C-末端結(jié)構域的缺失衍生物。但是，在本發(fā)明優(yōu)選方面，篩選使用只包含DBD而沒有完整的N或C末端結(jié)構域的p53家族蛋白質(zhì)的多肽片段。因此，對于該應用目的，術語＂DNA結(jié)合域＂或＂DBD＂理解為只是包括p53家族蛋白質(zhì)的DBD，沒有完整的N或C末端(除非另有說明)。但是根據(jù)測試形式，這樣的DBD結(jié)構域可以與異源多肽融合(例如，一個FLAG表位或者一種谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶蛋白)。另外，不是只是去除對DNA結(jié)合的負調(diào)節(jié)作用，本發(fā)明的方法和化合物促進p53家族野生型和突變蛋白兩者增強的構象穩(wěn)定性。
因此，在通過非限制性操作實施例在下面描述的一方面中，本發(fā)明提供了篩選與p53DBD特異性作用的化合物并且測定在試驗化合物的存在下p53DBD構象的方法。任選地，p53DBD是突變體p53DBD。但是，野生型p53DBD更容易大量超額生產(chǎn)。盡管篩選測試可以以細胞為基礎的形式進行，但是對于對靶向p53DBD的化合物特異性的高通量篩選，體外基礎的測試是最直接和期望的。對p53DBD最初篩選中鑒定的化合物可以進一步測試它們對完整p53(包括p53錯義突變體)的影響。使用這些方法鑒定的化合物也在本發(fā)明范圍內(nèi)。
為了本發(fā)明目的，設計對與p53家族蛋白質(zhì)的DNA結(jié)合結(jié)構域相互作用的化合物的測定，使得沒有覆蓋的化合物是特異性靶向DBD而不是該蛋白質(zhì)的其它結(jié)構域。例如，特異性與DBD＂相互作用＂或者“作用于”DBD的化合物不需要必須穩(wěn)定結(jié)合DBD(盡管其可以)；對于該化合物來說，對在該化合物存在下的p53家族蛋白質(zhì)的構象施與一定影響就已足夠。因此，可以首先對化合物篩選對與DBD的相互作用，然后測定它們對構象的影響，或者通過使用在該化合物存在下的構象變化也檢測與DBD的相互作用，這兩個篩選步驟可以同時進行。
本申請中術語特異性相互作用用來排除非特異性結(jié)合形式，包括已知在疏水性化合物和蛋白質(zhì)之間通過非選擇性疏水性相互作用發(fā)生的類型。術語特異性相互作用還用來通過改變大量溶劑的化學性質(zhì)而將本發(fā)明的化合物的性質(zhì)與影響蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的化合物區(qū)別開來。因此不包括在本發(fā)明范圍中的這樣的分子包括熱穩(wěn)定試劑，例如甘油，三甲胺-氧化物和重水。與p53家族蛋白質(zhì)特異性相互作用的化合物在比這樣的大量溶劑或非特異性疏水性相互作用低得多的濃度下表現(xiàn)出一種作用。例如，甘油在600mM下有效。但是，在體外或者以細胞為基礎的測試中，與p53家族蛋白質(zhì)特異性相互作用的化合物的作用在低于1mM，優(yōu)選低于100微摩爾，更優(yōu)選低于10微摩爾化合物濃度下觀察到。
與實施本發(fā)明相關，一般使用下面的定義。這里使用的術語＂烷基＂，除非另有說明，包括具有直鏈，支鏈或環(huán)部分的或者它們的組合的一價烴基。類似地，術語＂鏈烯基＂和＂炔烴基＂定義其中分別存在至少一個雙鍵，或者至少一個三鍵的具有直鏈，支鏈或環(huán)部分的烴基。當另外的基團例如烷氧基或烷基胺中存在烷基，鏈烯基或炔烴基時，這樣的定義也適用。這里使用的術語＂烷氧基＂包括其中“烷基”如上定義的0-氧基。這里使用的術語＂鹵基＂，除非另有說明，包括氟，氯，溴或碘。
為了描述方便起見，當在這里使用時，術語(C3-C10)環(huán)烷基指具有0個或者任選地具有一個或多個雙鍵的環(huán)烷基和環(huán)烯基，例如環(huán)丙基，環(huán)丁基，環(huán)戊基，環(huán)戊烯基，環(huán)己基，環(huán)己烯基，1，3-環(huán)己二烯基，環(huán)庚基，環(huán)庚烯基，雙環(huán)[3.2.1]辛烷，降冰片烷基，等。當在這里使用時(C3-C10)雜環(huán)烷基指吡咯烷基，四氫呋喃基，二氫呋喃基，四氫吡喃基，吡喃基，噻喃基，吖丙啶基，環(huán)氧乙烷基，亞甲二氧基，苯并吡喃基，異噁唑烷基，1，3-噁唑烷-3-基，異噻唑烷基，1，3-噻唑烷-3-基，1，2-吡唑烷-2-基，1，3-吡唑烷-1-基，哌啶基，硫代嗎啉基，1，2-四氫噻嗪-2-基，1，3-四氫噻嗪-3-基，四氫噻二嗪基，嗎啉基，1，2-四氫二嗪-2-基，1，3-四氫二嗪-1-基，四氫吖庚因基，哌嗪基，苯并二氫吡喃基，等等。本領域技術人員明白所述(C3-C10)雜環(huán)烷基環(huán)的連接是通過碳或sp3雜化氮雜原子。
當在這里使用時(C5-C9)雜芳基指呋喃基，噻吩基，噻唑基，吡唑基，異噻唑基，噁唑基，異噁唑基，吡咯基，三唑基，四唑基，咪唑基，1，3，5-噁二唑基，1，2，4-噁二唑基，1，2，3-噁二唑基，1，3，5-噻二唑基，1，2，3-噻二唑基，1，2，4-噻二唑基，吡啶基，嘧啶基，吡嗪基，噠嗪基，1，2，4-三嗪基，1，2，3-三嗪基，1，3，5-三嗪基，吡唑并[3.4-b]吡啶基，噌啉基，喋啶基，嘌呤基，6，7-二氫-5H-[1]吡啶基，苯并[b]噻吩基，5，6，7，8-四氫喹啉-基，苯并噁唑基，苯并噻唑基，苯并異噻唑基，苯并異噁唑基，苯并咪唑基，硫雜茚基，異硫雜茚基，苯并呋喃基，異苯并呋喃基，異吲哚基，吲哚基，中氮茚基，吲唑基，異喹啉基，喹啉基，2，3-二氮雜萘基，喹喔啉基，喹唑啉基，苯并噁嗪基，等等。
本領域技術人員明白(C5-C9)雜芳基與結(jié)構的其它部分連接通常沒有限制，即通過一個碳原子或者一個sp2雜化雜原子。類似地，苯基和萘基是(C6-C10)雜芳基的代表。
當在一幅圖中時，描繪了一個鍵但是沒有進行鑒定位于其遠端的基團，按常規(guī)理解是一個甲基。在沒有任何鍵被描繪的情況下，該位置被氫占據(jù)，如果原子價允許，這一點在本領域中是容易理解的。因此在描述中，R-O-指R-O-CH3。
A.促進p53家族的一種蛋白質(zhì)中野生型活性的本發(fā)明化合物本發(fā)明的有機非肽化合物可以是任何類型的化合物，當暴露給p53家族的野生型或突變蛋白時，其促進該蛋白質(zhì)的野生型活性。優(yōu)選的化合物是相對小的(與50-150kD典型的蛋白質(zhì)相比)有機化合物。本發(fā)明第一次提供了這樣的化合物，它們不是肽，而且更特別地不是抗體，但是與p53特異性反應，從而穩(wěn)定p53DBD或p53蛋白質(zhì)的野生型構象。不是肽的有機化合物特別用作各種原因的藥物。例如，非肽化合物比肽類有小得多的免疫原性，并且更容易通過粘膜或其它細胞層屏障吸收到體內(nèi)，并且可能較小不穩(wěn)定性。
一方面，通過本發(fā)明方法找到的活性化合物可以定義為包含通過一個特定長度的連接體連接在一起的一個疏水基團(例如平面多環(huán))和一個陽離子基團(優(yōu)選胺)的化合物。疏水位置中苯并咪唑，苯并喹啉，吩噻嗪，和苯乙基喹唑啉是優(yōu)選的。
活性陽離子基團是仲胺和叔胺，包括但不限于二甲胺，二乙胺，二乙醇胺，甲胺，甲基哌嗪，和嗎啉。當在吩噻嗪疏水系列中試驗時一些較大的胺相應地更具活性；因此在此種情況下，優(yōu)選較大的胺。陽離子位置中帶正電荷基團是活性的和優(yōu)選的(見下面的表1)。
關于本發(fā)明的該方面，疏水基團和陽離子基團之間的距離應該至少有一個丙基長；比丙基長度短的連接體基本上在測定的特定條件下無效(見下面的表2)。因此，具有大約3-5個碳原子長度的連接體是優(yōu)選的(5-9埃，更優(yōu)選6-8埃)，但是包含一個丙基連接體長度(約6.5埃)的化合物最有活性。比一個丁基連接體的長度長的連接體導致測試的特定條件下比帶有丁基連接體長度連接體的相應的化合物更小有效性的化合物(表2)。更優(yōu)選的是保持正確距離的支鏈連接體；在該項測試中這樣的連接體一般比相應的直鏈連接體更具活性，只要它們?nèi)匀槐３?和9埃之間(最佳地約6.5埃)的正確的連接體長度。
因此，一方面，本發(fā)明的化合物具有下面的結(jié)構式F1-L-F2并且F1選自 其中R1，R2，R3是相同或不同的，并且各自獨立地選自氫，鹵素，甲氧基和硝基；L是一個具有5-9埃長度的直鏈或支鏈烷基；和F2是一個仲胺或叔胺。在其它方面，F(xiàn)2是二甲胺，二乙胺，二甲醇胺，甲基哌嗪或嗎啉。例如，F(xiàn)2可以是選自下面的胺 其中R4是-O-CH2-CH3或H。
下面提供了本發(fā)明各種化合物的化學結(jié)構。發(fā)現(xiàn)這些化合物中的每一個在至少一個突變體p53DBD中在接近生理溫度下顯著增強p53構象敏感表位的穩(wěn)定性。
1.吖啶類
3.酚噻嗪類(Phenothizoles)
根據(jù)這里所述一般設計原理，在實施本發(fā)明中，下面各組的化合物是優(yōu)選的 其中，對于第I組， R5是-N-R18R19，其中R18是H，(C1-C6)烷基，或苯基，和R19is H，(C1-C6)烷基，(C3-C10)環(huán)烷基，或苯基，其中所述烷基，環(huán)烷基或苯基任選被羥基，(C3-C8)環(huán)雜烷基，-CONR18(CH2)pNR20R21，-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21，或-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21取代，其中p是0-5，m是0-5，n是0-5，R22是羥基或(C1-C6)烷基，和R20和R21各自獨立地選自(a)H，(C1-C12)烷基，(C3-C12)環(huán)烷基，(C3-C10)雜環(huán)烷基，(C6-C10)芳基，(C5-C9)雜芳基，(C1-C6)烷基(C6-C12)芳基，其中所述基團任選被一個或多個羥基，鹵基，氨基，三氟甲基，(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷氧基，(C1-C6)烷基(C3-C10)雜環(huán)烷基，或(C1-C6)烷基(C6-C12)芳基取代；或(b)NR20R21一起代表氫，嗎啉，或4-(C1-C6)烷基哌嗪；R6是is(a)(C1-C6)烷基或(C2-C8)鏈烯基，各自任選被一個或多個苯基取代，或者(b)被鹵基，(C1-C6)烷氧基取代的苯基；和R7和R8是相同或不同的，并且選自H，硝基，(C1-C6)烷氧基，或選自氟，氯和溴的鹵素；其中對于第II組， R9是(C1-C6)烷基，(C3-C10)環(huán)烷基，或苯基，其中所述烷基，環(huán)烷基或苯基任選被羥基，(C3-C8)環(huán)雜烷基，-CONR18(CH2)pNR20R21，-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21，或-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21取代，其中p是0-5，m是0-5，n是0-5，R22是羥基或(C1-C6)烷基，和R20和R21各自獨立地選自H，(C1-C12)烷基，(C3-C12)環(huán)烷基，(C3-C10)雜環(huán)烷基，(C6-C10)芳基，(C5-C9)雜芳基，(C1-C6)烷基(C6-C12)芳基，其中所述基團任選被一個或多個羥基，鹵基，氨基，三氟甲基，(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷氧基，(C1-C6)烷基(C3-C10)雜環(huán)烷基，(C1-C6)烷基(C5-C9)雜芳基，或(C1-C6)烷基(C6-C10)芳基取代；其中對于第III組， R10是-N-R18R19，其中R18是H，(C1-C6)烷基，或苯基，和R19is H，(C1-C6)烷基，(C3-C10)環(huán)烷基，或苯基，其中所述烷基，環(huán)烷基或苯基任選被羥基，(C3-C8)環(huán)雜烷基，-CONR18(CH2)pNR20R21，-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21，或-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21取代，其中p是0-5，m是0-5，n是0-5，R22是羥基或(C1-C6)烷基，和R20和R21各自獨立地選自(a)H，(C1-C12)烷基，(C3-C12)環(huán)烷基，(C3-C10)雜環(huán)烷基，(C6-C10)芳基，(C5-C9)雜芳基，(C1-C6)烷基(C6-C12)芳基，其中所述基團任選被一個或多個羥基，鹵基，氨基，三氟甲基，(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷氧基，(C1-C6)烷基(C3-C10)雜環(huán)烷基，(C1-C6)烷基(C5-C9)雜芳基或(C1-C6)烷基(C6-C10)芳基取代；或(b)NR20R21一起代表氫，嗎啉，或4-(C1-C6)烷基哌嗪；A和B是相同或不同的并且各自代表碳或氮；和R11和R12是相同或不同的，并且選自H，硝基，(C1-C6)烷氧基，或選自氟，氯和溴的鹵素；其中對于第IV組， R13是-N-R18R19，其中R18是H，(C1-C6)烷基，或苯基，和
R19is H，(C1-C6)烷基，(C3-C10)環(huán)烷基，或苯基，其中所述烷基，環(huán)烷基或苯基任選被羥基，(C3-C8)環(huán)雜烷基，-CONR18(CH2)pNR20R21，-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21，或-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21取代，其中p是0-5，m是0-5，n是0-5，R22是羥基或(C1-C6)烷基，和R20和R21各自獨立地選自(a)H，(C1-C12)烷基，(C3-C12)環(huán)烷基，(C3-C10)雜環(huán)烷基，(C1-C6)烷基(C5-C9)雜芳基，(C5-C9)雜芳基，(C6-C10)芳基，和(C1-C6)烷基(C6-C10)芳基，其中所述基團任選被一個或多個羥基，鹵基，氨基，三氟甲基，(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷氧基，(C1-C6)烷基(C3-C10)雜環(huán)烷基，(C1-C6)烷基(C5-C9)雜芳基和(C1-C6)烷基(C6-C10)芳基取代；或(b)NR20R21一起代表氫，嗎啉，或4-(C1-C6)烷基哌嗪；A和B是相同或不同的并且各自代表碳或氮；和R14和R15是相同或不同的，并且選自H，硝基，(C1-C6)烷氧基，或選自氟，氯和溴的鹵素；和其中對于第V組， A是碳或氮；R16是-N-R18R19，其中R18是H，(C1-C6)烷基，或苯基，和R19is H，(C1-C6)烷基，(C3-C10)環(huán)烷基，或苯基，其中所述烷基，環(huán)烷基或苯基任選被羥基，(C3-C8)環(huán)雜烷基，-CONR18(CH2)pNR20R21，-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21，或-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21取代，其中p是0-5，m是0-5，n是0-5，R22是羥基或(C1-C6)烷基，和R20和R21各自獨立地選自(a)H，(C1-C12)烷基，(C3-C12)環(huán)烷基，(C3-C10)雜環(huán)烷基，(C6-C10)芳基，(C5-C9)雜芳基，(C1-C6)烷基(C6-C10)芳基，和(C1-C6)烷基(C5-C9)雜芳基，或者其中所述基團任選被一個或多個羥基，鹵基，氨基，三氟甲基，(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷氧基，(C1-C6)烷基(C3-C10)雜環(huán)烷基，(C1-C6)烷基(C5-C9)雜芳基或(C1-C6)烷基(C6-C10)芳基取代；或(b)NR20R21一起代表氫，嗎啉，或4-(C1-C6)烷基哌嗪；R17選自H，硝基，(C1-C6)烷氧基，或選自氟，氯和溴的鹵素。
本發(fā)明特別優(yōu)選的化合物包括下面11種化合物 (1-芐基-哌啶-4-基)-(3-吩噻嗪-10-基-丙基)-胺 [2-(4-氯-苯基)-乙基]-(3-吩噻嗪-10-基-丙基)-胺 (3-吩噻嗪-10-基-丙基)-二氫苯并噻喃-4-基-胺 -(3-吩噻嗪-10-基-丙基)-胺 (7-乙氧基-1，2，3，4-四氫-萘-2-基)-(3-吩噻嗪-10-基-丙基)-胺 N’-(9-氟-苯并[c]吖啶-7-基)-N，N-二甲基-丙烷-1，3-二-胺 N’-吖啶-9-基-N，N-二甲基-丙烷-1，3-二胺 2-{4-[4-(苯并[g]喹啉-4-基氨基)-苯基]-哌嗪-1-基}-乙醇
N4-{2-[2-(4-溴-苯基)-乙烯基]-7-氯-喹唑啉-4-基}-N1，N1-二乙基-戊烷-1，4-二胺 N-苯并[g]喹啉-5-基-N’-環(huán)己基-丙烷-1，3-二胺 2-[(2-羥基-乙基)-(3-{2-[2-(4-甲氧基-苯基)-乙烯基]-喹唑啉-4-基氨基}-丙基)-氨基]-乙醇發(fā)明的有機非肽化合物可以應用常規(guī)方法合成。
本發(fā)明的化合物和在本發(fā)明方法中使用的化合物還包括促進p53家族的蛋白質(zhì)的野生型活性的化合物的前藥。前藥是當對受試者哺乳動物(特別是人)施用時以顯著和有效量轉(zhuǎn)化為活性分子的化合物。
本發(fā)明的化合物可以是游離酸，游離堿或者其藥物有效堿的形式。這樣的鹽可以容易地通過用合適的酸處理一種化合物來制備。這樣的酸包括，例如但不限于，無機酸，例如氫鹵酸(鹽酸，氫溴酸等)，硫酸，硝酸，磷酸等；和有機酸，例如乙酸，丙酸，2-氧代丙酸，丙二酸，丁二酸等。相反，通過用堿處理可以將鹽轉(zhuǎn)化為游離堿。
B.治療終點和劑量通過本發(fā)明方法鑒定的化合物用于治療與構象不穩(wěn)定或錯折疊的蛋白質(zhì)相關的疾病。與構象不穩(wěn)定或錯折疊的蛋白質(zhì)相關的疾病是已知的并且包括囊性纖維化(CFTR)，Marfan綜合癥(原纖蛋白)，肌萎縮性側(cè)索硬化(超氧化物歧化酶)，壞血病(膠原)，槭糖尿病(α-酮酸脫氫酶復合物)，成骨不全(1型原膠原原-α)，Creutzfeldr-Jakob疾病(朊病毒)，早老性癡呆(β-淀粉狀蛋白)，家族淀粉樣變(溶菌酶)，白內(nèi)障(晶體蛋白)，家族高膽固醇血癥(LDL受體)，α1-抗胰蛋白酶不足，Tay-Sachs疾病(β-hexosaminidase)，色素性視網(wǎng)膜炎(視紫紅質(zhì))，和矮妖精貌綜合征(胰島素受體)。當然，這里描述的方法和化合物特別用于治療癌癥，尤其是用于治療與突變體p53基因相關的癌癥。
本領域技術人員將明白，從醫(yī)療人員或患者角度，不期望的與疾病狀態(tài)特別是癌癥狀態(tài)相關的癥狀(例如疼痛，敏感性，體重減輕，等等)的基本上所有的減輕或預防是所期望的。另外，關于癌癥狀態(tài)，任何腫瘤體的縮小或生長速度的減緩都是所期望的，并且期望腫瘤的組織病理學照片的改善。因此，為了該中請的目的，這里使用的術語＂治療＂，＂治療用途＂或＂藥物用途＂應該指要求保護的無論用什么方法治療一種疾病狀態(tài)或癥狀，或者防止，阻止，阻礙或者反轉(zhuǎn)疾病或其它不期望的癥狀的組合物的任何和所有的用途。
可以通過常規(guī)方法確定有效的劑量和治療方案，對試驗動物用低劑量開始，然后將劑量漸增同時監(jiān)測效果，并且系統(tǒng)改變劑量給藥方案。動物研究，優(yōu)選哺乳動物研究，通常用來確定每千克體重最大耐受劑量或生物活性物質(zhì)的MTD。本領域技術人員有規(guī)律地推斷有效同時避免對其它物種包括人的毒性的劑量。
在進行對人的藥效研究之前，對正常受試者的I期臨床研究有助于確立安全劑量。當決定對于給定患者的最佳劑量時醫(yī)生要考慮多種因素。其中首先是選擇的異源基因產(chǎn)物的毒性和半壽期。其它因素包括患者體重，患者年齡，患者的一般狀況，要治療的具體的癌癥，疾病的嚴重程度，患者體內(nèi)存在的其它藥物，基因產(chǎn)物的體內(nèi)活性等等。在考慮了動物研究和臨床文獻之后選擇試驗劑量。
正如下面通過實際工作實施方案證明的，200mg/kg/天的劑量對于抑制和/或退化人癌癥的動物模型中腫瘤生長是高度有效的。以該結(jié)果為基礎用于治療癌癥的化合物X的典型的人用劑量是0.1至10g/天，靜脈內(nèi)注射或者直接注入腫瘤體或者口服給藥，取決于患者狀況。對于具有不同水平藥效和/或毒性的化合物，這些值當然相應地改變。另外，每天可以增加兩次或幾次劑量。
在本發(fā)明中使用的化合物也可以配制成用于延長和持續(xù)給藥的緩釋埋入裝置。這樣的緩釋制劑的例子包括生物相容聚合物例如聚(乳酸)，聚(乙酸-共聚-乙醇酸)，甲基纖維素，透明質(zhì)酸，膠原等的復合物。在一些公開文獻中綜述了藥物送遞賦形劑中可降解聚合物的結(jié)構，選擇和應用，包括A.Domb等，用于先進技術的聚合物(Polymersfor vanced Technologies)3279-292(1992)。在藥物制劑中選擇和應用聚合物的另外的指南可以參見文獻M.Chasin和R.anger(編著)，作為藥物送遞系統(tǒng)的生物可降解聚合物(＂BiodegradablePolymers as Drug Delivery Systems＂)，藥物和制藥科學(＂Drugs ande Pharmaceutical Sciences＂)，Vol.45，M.Dekker，紐約，1990，和美國專利5573528，Aebischer等(1996年11月12日公開)。
特別是在涉及體內(nèi)使用情況下，本發(fā)明的各種生物化學成分優(yōu)選高度純化并且基本上沒有潛在的有害污染物(例如至少國家食品(NF)級)，一般至少分析級，優(yōu)選至少藥物級)。在使用前必須合成給定化合物的程度，這樣的合成或接下來的純化應該優(yōu)選生產(chǎn)基本上沒有潛在的在合成或純化過程中使用的有毒物質(zhì)的產(chǎn)物。
對于對受治療者治療癌癥狀態(tài)中的用途，本發(fā)明在其一方面還提供了滅菌裝填的小瓶或安瓿形式的試劑盒或包裝，含有證明在本發(fā)明方法中有效的一種化合物。在一個實施方案中，所述試劑盒含有本發(fā)明的一種化合物，例如化合物Y，化合物X或化合物Z，作為即用型直徑，或者是單位劑量或者是多劑量，其中包裝中加入了說明治療癌癥的成分的使用標簽。或者，根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，所述包裝提供了含有這樣一種化合物的滅菌裝填的小瓶或安瓿。
C.藥物發(fā)現(xiàn)方法篩選與p53家族蛋白質(zhì)特別是p53DBD相互作用，和/或影響其野生型活性的化合物的每一個或所有步驟經(jīng)得起對于候選化合物的高通量測定分析。高通量篩選是本領域已知的并且可以用各種各樣的形式進行。例如，ELISAS，閃爍親近測定法技術，競爭結(jié)合測定和置換結(jié)合測定是有用的形式。實驗自動化，包括機器人技術，可以大大縮短篩選大量化合物需要的時間，并且可以從例如，Tecan，Scitec，Rosys，Mitsubishi，CRS Robotics，F(xiàn)anuk，和Beckman-Coulter Sagian等幾個公司購得。鑒定了候選化合物之后(或者在它們鑒定的同時)，可以進行第二次篩選來測定該化合物對p53家族蛋白質(zhì)的活性的細胞和/或體內(nèi)作用1.本發(fā)明的方法和組合物靶向的p53家族蛋白質(zhì)p53在真核生物中普遍存在。因此，在本發(fā)明的方法和組合物中使用的p53蛋白和p53DBD可以來自，或者產(chǎn)生于任何真核細胞，包括真菌(例如，釀酒酵母)(Saccharomyces cerevisiae)，昆蟲(例如，果蠅(Drosophila)和哺乳動物(例如，小鼠和/或人)，但是人p53蛋白是優(yōu)選的。已經(jīng)鑒定了具有相關結(jié)構和功能的另外的哺乳動物p53類似物，特別是p63和p73；也可以在本發(fā)明的方法和組合物中使用這樣的p53家族蛋白質(zhì)和例如它們各自的DBD。另外，還沒有發(fā)現(xiàn)的p53家族蛋白質(zhì)(根據(jù)這里定義的)也可以在本發(fā)明的方法和組合物中使用。
如上所述，p53蛋白包含至少三個不同的結(jié)合域位于氨基末端的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構域；中心DBD；位于羧基末端的寡聚作用結(jié)構域。另外，一個負調(diào)節(jié)結(jié)構域出現(xiàn)在該蛋白質(zhì)的羧基末端。大多數(shù)與人癌癥相關的p53錯義突變發(fā)生在DBD。本發(fā)明的方法和組合物涉及穩(wěn)定任何這樣的錯義突變體的構象。特別優(yōu)選的靶物是包含一個或多個在175，245，248，249，273和282位點殘基處突變的稱之為＂熱點＂的突變體p53(就人p53序列給出了所有的殘基位置；通過與人序列的同源性對比可以容易地測定來自其它生物體的p53蛋白中類似殘基位置)。p53中其它常見突變發(fā)生于132，135，138，141，143，146，151，152，154，157，158，159，163，173，176，179，186，194，196，213，220，237，238，241，242，258，266，272，278，280，281，285和286；這些也是本發(fā)明的靶物。此外，下面以工作實施例詳細說明本發(fā)明，證明下面突變體p53蛋白的構象穩(wěn)定化作用143A，173A，175S，241D，249S和273H。
與p53蛋白特別是p53蛋白的DBD中錯義突變相關的癌癥包括但不限于結(jié)腸直腸癌，膀胱癌，肝細胞癌，卵巢癌，肺癌，乳腺癌，頭頸鱗狀細胞癌，食道癌，甲狀腺癌，和神經(jīng)原性腫瘤，例如星形細胞瘤，神經(jīng)節(jié)細胞瘤和成神經(jīng)細胞瘤。用本發(fā)明方法和化合物可以治療上述癌癥和其它癌癥。
p53DBD大約位于氨基酸殘基100-300。證明對于DNA結(jié)合，殘基102-292的抗蛋白酶解核是足夠的，并且p53DBD結(jié)晶結(jié)構已經(jīng)查明殘基94-312(Cho等，1994，Science 265，346；Friend，1994，Science 265，334)。因此，對于在本發(fā)明方法中的應用，p53DBD結(jié)構域的N-末端可以自殘基50-110開始，并且優(yōu)選從殘基94-102之間的某一個位點起始。p53DBD的C-末端可以在殘基286-340終止，并且優(yōu)選在殘基292-312之間終止。
＂p53的熱力學不穩(wěn)定突變體＂是這樣的突變體，它不保留p53的功能性質(zhì)的一種或多種，例如在生理溫度(即37℃左右)下DNA結(jié)合，但是在低溫下或者在其它條件下恢復這樣的功能。例如，通常遇到的所有突變體在低溫下恢復體外結(jié)合DNA能力(Friedlander等，1996，上文)。
2.測試形式a.結(jié)合測試形式用來鑒定簡單結(jié)合p53家族的蛋白質(zhì)的DBD的化合物的測定原理涉及在足以使兩種成分相互反應并結(jié)合的條件和時間下制備DBD蛋白質(zhì)和試驗化合物的反應混合物，這樣生成一種復合物，其可以在反應混合物中去除和/或檢測。使用的DBD物種可以根據(jù)篩選測試的目的而不同。例如，探索與特定結(jié)合結(jié)構域作用的化合物，可以使用包含結(jié)合結(jié)構域的p53家族的全長蛋白質(zhì)，DBD本身，或者包含在測定系統(tǒng)中提供有益效果的融合一種蛋白質(zhì)或多肽的DBD的融合蛋白(例如，標記得到的復合物的分離等)。在本技術中使用的來自DBD的肽應該包括DBD的至少6個連續(xù)的氨基酸，優(yōu)選10個連續(xù)的氨基酸，更優(yōu)選20個連續(xù)的氨基酸，更優(yōu)選30個甚至50個連續(xù)的氨基酸，或者更多。
所述篩選測試可以通過各種各樣的方法進行。例如，進行這樣一種測試的一種方法涉及將DBD蛋白質(zhì)，多肽，肽或融合蛋白或試驗物質(zhì)固定到固相上，并且在反應終止時檢測固定在該固相上的DBD/試驗化合物復合物。在這樣一種方法的一個實施方案中，DBD反應物可以固定在固體表面，沒有固定的試驗化合物可以被直接或間接地標記。可以使用各種各樣的合適的標記系統(tǒng)，包括但不限于放射性同位素例如125I和32P，當暴露給底物時產(chǎn)生可檢測熱信號或光的酶標記系統(tǒng)，和熒光標記。在該方法的另一個實施方案中，固定在固相上的一種DBD蛋白與標記的抗體復合。然后，對一種試驗化合物測試其干擾DBD/抗體復合物締合的能力。
實際上，微量滴定板可以方便地被用作固相。固定的成分可以通過非共價或共價連接固定。非共價連接可以通過簡單地用蛋白質(zhì)的溶液包被固體表面并且干燥來實現(xiàn)?；蛘撸瑢σ潭ǖ牡鞍踪|(zhì)特異性的一種固定化抗體，優(yōu)選一種多克隆抗體，可以用來將蛋白質(zhì)固定到固體表面。可以先制備表面并且貯存。
為了進行該測試，向含有固定化成分的包被的表面加入非固定化成分。反應完全后，在形成的任何復合物保持固定在固體表面上的條件下去除未反應的成分(例如通過洗滌)?？梢杂枚喾N方法實現(xiàn)對固定在固體表面上的復合物的檢測。在事先先標記非固定化成分情況下，在表面上檢測到固定化標記表明形成了復合物。在事先沒有先標記非固定化成分情況下，可以用間接標記來檢測固定在表面上的復合物；例如，使用對事先沒有固定化的成分特異性的標記抗體(該抗體，接著，可以用標記的抗-Ig抗體直接標記或間接標記)。
在另一個實施方案中，可以不使用直接或間接標記來檢測結(jié)合作用。例如，可以測試當發(fā)生結(jié)合時改變的生物物理性質(zhì)。對于這樣的篩選特別有利的一種固體載體系統(tǒng)是BlAcore 2000TM系統(tǒng)，可以從BlAcore，Inc.(Piscataway，NJ)購得。The BIAcoreTM儀器(http//www.biacore.com)利用了表面細胞質(zhì)基因組共振(SPR)對監(jiān)測生物特異性相互作用的實時光學現(xiàn)象。SPR效應基本上是受金屬-液體界面折射指數(shù)的局部變化影響的短暫的電場。傳感器芯片由玻璃和羧甲基葡聚糖基質(zhì)之間的金箔這三層組成，要測試的配體或蛋白質(zhì)與羧甲基葡聚糖基質(zhì)化學鍵連。該傳感器芯片安裝在流體筒上形成流動細胞，通過該元件可以注入分析化合物。根據(jù)從芯片表面反射的偏振光束角的變化測定該傳感器芯片上配體-分析物相互作用。任何物質(zhì)與該芯片的結(jié)合影響金/葡聚糖層中的SPR。金層中電場的該變化與反射光束相互作用并且改變與結(jié)合的物質(zhì)質(zhì)量成正比的反射角。在二極陣列上檢測反射光并且翻譯成表示為響應單位的結(jié)合信號(RU)。因為該響應直接與結(jié)合的質(zhì)量成正比，可以測定蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的動力學和平衡常數(shù)。
或者，反應可以在液相中進行，將反應產(chǎn)物與未反應成分分離，并且檢測復合物。
b.測定p53家族蛋白質(zhì)的構象的方法可以用多種不同的方法測定p53蛋白的構象。例如，可以使用抗體來探測p53 DBD的構象。本發(fā)明優(yōu)選的方法使用單克隆抗體，它們對p53和/或p53DBD的活性(例如，DNA結(jié)合)或失活(熱動力學不穩(wěn)定的，或錯折疊的或未折疊的)構象是特異性的。例如，mAb1620識別p53DBD上的表位，該表位與p53蛋白腫瘤抑制劑活性相關。Ball等，1984，EMBO J.31485-1491；Gamble等，1988，病毒學(Virology)162452-458。這樣當其采納失活構象時，mAb1620將不結(jié)合p53DBD。相反，當p53被突變滅活或者野生型p53變性時，mAb240識別的表位暴露出來(Bartek等，1990，致癌基因(Oncogene)5,893-899；Stephen等，1992，分子生物學雜志(J.Mol.Biol.)225，577-83)。在本發(fā)明方法中也可以使用已知的或者還沒有發(fā)現(xiàn)的構象特異性的其它單克隆抗體。這樣的抗體是有用的，因為它們?nèi)菀撞捎酶咄亢Y選。制備抗體包括單克隆抗體的方法是本領域公知的。
測定p53家族蛋白質(zhì)例如p53或p53DBD的構象的其它方法包括但不限于染料的吸收，光譜(例如，圓二色性，NMR)，大小排阻層析，超離心，特異性DNA結(jié)合(例如，在與低溫相對的生理溫度下)，和特異性蛋白質(zhì)結(jié)合(例如，只與野生型激活構象結(jié)合而不與失活構象結(jié)合的SV40大T抗原)。
如上所述，很多常常遇到的p53突變體在生理溫度下不能結(jié)合DNA，但是在低溫下將結(jié)合DNA。因此一方面，在試驗化合物存在下測定p53家族蛋白質(zhì)的構象是溫度依賴性的。優(yōu)選地，在生理溫度(大約38℃)下測定構象；合適的范圍在20℃和50℃之間，更優(yōu)選在35℃和42℃之間。也可以隨時間測定靶物蛋白質(zhì)的構象，從幾分鐘至幾小時或更多。當在篩選中使用野生型p53蛋白質(zhì)或p53DBD時，一般比使用突變體p53DBD時加熱的時間更長并且在更高的溫度下。本領域技術人員利用這里提供的信息容易確定合適的溫度。
另外，人們可以同時測定化合物的結(jié)合和p53家族蛋白質(zhì)的構象中的任何變化兩者。在這樣一項測定中，可以將在一種試驗化合物存在下p53家族蛋白質(zhì)的構象的一次變化評分為一次命中。下面以非限制性實施例詳細說明高產(chǎn)率篩選，對與p53DBD相互作用的化合物的測定引起一次構象變化。這些高產(chǎn)率篩選能鑒定一類在本發(fā)明方法中使用的化合物。在接近生理溫度下，這些化合物增強了野生型和各種突變體p53蛋白質(zhì)上對mAb1620構象敏感表位的穩(wěn)定性。低微摩爾濃度的化合物暫時增強活細胞中表位的穩(wěn)定性并且使突變體p53激活轉(zhuǎn)錄。如下面更詳細的描述，當用突變體p53對帶腫瘤的小鼠給藥時，有機非肽化合物調(diào)節(jié)p53構象和功能，并且用天然突變的p53明顯抑制人腫瘤異種皮移植的生長。
C.以細胞為基礎的和以動物為基礎的測試一旦應用上述第一次篩選鑒定了候選化合物，一般就進行以細胞為基礎的和以動物為基礎的測試來測定候選化合物在這些系統(tǒng)中的作用。初始的測試涉及得自攜帶編碼p53家族蛋白質(zhì)的突變基因的腫瘤的細胞系，或者被操作來表達p53家族突變蛋白質(zhì)的細胞系。評價候選化合物對p53家族蛋白質(zhì)的任何一項(或所有的)野生型活性的影響。例如，在候選化合物的存在下誘導WAF1表明化合物通過促進特異性DNA結(jié)合性質(zhì)而不是普遍的結(jié)合性質(zhì)而在突變體p53中保持了功能?？梢詸z查p53或p53家族蛋白質(zhì)的其它成員正調(diào)節(jié)或負調(diào)節(jié)的任何基因。p53家族蛋白質(zhì)的其它活性包括生長抑制和編程性細胞死亡。在組織培養(yǎng)細胞中通過顯微鏡或者通過菌落生成測試容易評價生長抑制。通過TUNEL染色或者碘化丙錠染色和流式細胞儀可以目測編程性細胞死亡。
另外，可以使用以動物為基礎的模型對候選化合物篩選毒性和藥效。例如，可以在動物模型中誘導攜帶突變體p53的腫瘤，并且對該動物施用候選化合物。評價毒性和腫瘤生長或抑制。下面提供了這樣的篩選的一個工作實施例。
3.用于篩選的化合物的來源可以根據(jù)本發(fā)明篩選的化合物包括但不限于能獲得進入細胞并且影響p53家族蛋白質(zhì)的活性的小有機分子。可以從公司購買多種化合物庫，所述公司例如Pharmacopeia，Arqule，Enzymed，Sigma，Aldrich，Maybridge，Trega and PanLabs，這只是其中的幾個來源，人們也可以篩選已知化合物的庫，對于與p53 DBD相互作用的化合物來說，包括天然產(chǎn)物和合成的化合物，和生物活性材料，包括蛋白質(zhì)。但是，優(yōu)選的化合物不是蛋白質(zhì)或肽(即，通過肽鍵連接的3個或多個氨基酸的鏈)?？贵w是免疫球蛋白或者免疫球蛋白的抗原結(jié)合片段的肽；優(yōu)選的化合物也不是抗體。下面描述學本發(fā)明方法中使用的化合物的具體類型和實施例。
一旦鑒定了促進p53家族蛋白質(zhì)野生型活性的化合物，可以利用分子模型技術來設計更有效的化合物的變體。分子模型系統(tǒng)的實施例是CHARM(Polygen Corporation，Waltham，MA)和(QUANTA programsMolecular Simulations Inc.，San Diego，CA)。CHARM執(zhí)行能量減小和分子動力學功能。QUANTA執(zhí)行分子結(jié)構的構建，結(jié)構模擬和分析。QUANTA使得分子相互之間相互作用構建，修飾，成形和分析。
例如，一旦鑒定了促進p53家族蛋白質(zhì)野生型活性的化合物，可以利用該化合物來提出假設。正如下面將詳細描述的，一個優(yōu)選的假設是平面多環(huán)疏水性基團，其與極性胺間隔大約5-9埃，更優(yōu)選6-8埃。利用程序Catalyst(Molecular Simulations Inc.，San Diego，CA)可以從任何一種本發(fā)明的化合物提出這樣一種假設。此外，Catalyst可以利用該假設來檢索專利數(shù)據(jù)庫，劍橋小分子數(shù)據(jù)庫(Cambridge，英國)，以及上文提到的其它數(shù)據(jù)庫，來鑒定本發(fā)明化合物的另外的例子。
本發(fā)明的化合物可以進一步被用來利用模擬軟件包設計更有效的變體，例如Ludi，Insight II，C2-Minimizer and Affinity(Molecular Simulations Inc.，San Diego，CA)。一種特別優(yōu)選的模擬軟件包是MacroModel(Columbia University，NY，NY)。
本發(fā)明的化合物可以進一步被用作開發(fā)合理組合庫的基礎。這樣一種庫可以篩選更有效的化合物。組合庫的本質(zhì)取決于一些因素，例如從本發(fā)明的優(yōu)選化合物選擇特殊化合物來構成該庫的基礎，和期望使用一種樹脂來合成該庫，要認識到本發(fā)明的化合物提供了適合組合設計程序例如C2-QSAR(Molecular Simulations Inc.，San Diego，CA)的必要數(shù)據(jù)。
以詳細說明而非限制性提供下面的實施例描述本發(fā)明。
VI.實施例1p53DBD熱穩(wěn)定性測試開發(fā)使用野生型p53DBD的高通量測試。應用該測試篩選藥物化合物，并且對穩(wěn)定DBD的活性構象的那些化合物記分為命中。
A.材料和方法熱穩(wěn)定性測試。根據(jù)(Pavietich等，1993，基因和發(fā)育(Genesand Dev.)7，2556-2564；Bullock等，1997，上文)所述從野生型和突變型p53蛋白和FLAG-標記p53DBD制備重組DBD(殘基94-312)。使用的突變蛋白是143A，173A，175S.249S，和273H。測試了多種小分子有機化合物。以10mg/ml將化合物原料溶解于DMSO并且在使用前稀釋。在含有25mM HEPES，pH6.8，150mM KCl，10mM二硫蘇糖醇的緩沖液中稀釋該蛋白質(zhì)(0.25-1.0ng/孔)，并且50μl在冰上接觸ReactiBind微量滴定板(Pieree)35分鐘。用25mMHEPES，pH6.8，150mM KCl沖洗孔，加入化合物或稀釋的DMSO賦形劑，板在指定溫度下溫育。通過將孔置于冰上終止溫育；進行ELISA測試，同時將板保留在冰上以避免表位的進一步改變。在加入第一抗體之前用冷的HEPES/KCl緩沖液中的5％脫脂奶(Difco)將孔封閉1小時。以1∶100-1∶250在HEPES/KCl中稀釋單克隆抗體mAb1620，mAb240(Calbiochem)和抗-FLAG M2抗體(Eastman KodakCompany)，并且以100μl/孔加入30分鐘。這些板用冷的HEPES/KCl緩沖液沖洗兩次并且與辣根過氧化物酶(HRP)-偶聯(lián)的抗-小鼠IgG(Boehringer Mannheim)溫育另外30分鐘。使用TMB顯色劑(Pierce)顯示HRP信號并且在BioRad微板讀數(shù)器上在450 nm處讀取信號。
B.結(jié)果p53DBD的構象是不耐熱的。mAb1620識別的表位是構象依賴性的，它在p53上存在與蛋白質(zhì)腫瘤抑制劑活性密切相關(Ball等，1984，上文； Gamble和Milner，1988，上文)。相反，mAb240識別的表位是線性表位，當p53被突變滅活或者當野生型p53變性時，其是暴露的(Bartek等，1990，致癌基因(Oncogene)5，893-899；Stephen和Lane，1992，分子生物學雜志(J.Mol.Biol.)225，577-583)。重組人p53DBD(殘基94-312)體外經(jīng)歷了從活性至失活構象的轉(zhuǎn)變，逐漸失去1620表位同時蓄積240表位。在微量滴定板上固定的純化的p53DBD被加熱至接近生理溫度并且在ELISA測試中用mAb1620探測。1620表位以溫度和時間依賴方式失去(圖1A)。1620表位的失去與構象的失去特異性相關，因為與DBD連接的FLAG表位完全保持穩(wěn)定(圖1B)。此外，1620表位的失去與240表位增強的出現(xiàn)協(xié)調(diào)一致發(fā)生，使人相信1620表位的失去反映出p53DBD中的構象變化而不是固定化蛋白質(zhì)的失去。
野生型p53DBD上1620表位的半壽期在23℃下大約是35分鐘并且在更高的溫度下逐漸縮短至在45℃下小于5分鐘(圖1A)。平行地，在凝膠遷移試驗中p53DBD的DNA結(jié)合能力在溶液中加熱時降低(沒有給出數(shù)據(jù))。37℃下野生型p53DBD上1620表位的半壽期大約是143位點突變體DBD的兩倍(圖1C)。該項發(fā)現(xiàn)與先前對于幾種其它突變體p53蛋白的降低的熱力學穩(wěn)定性的報道相一致，并且確信1620表位可以用來監(jiān)測p53DBD的構象(Bullock等，1997，上文)。
化合物穩(wěn)定p53構象。利用ELISA測試來鑒定穩(wěn)定活性p53構象并且使突變蛋白更好地保持野生型功能的化合物。幾種化合物在生理溫度下抑制對于mAb1620的表位的損耗(例如參見圖2A)。通過測定穩(wěn)定50％對于mAb1620的表位需要的濃度的滴定實驗中確定化合物的相對效力?；钚曰衔镆詣┝恳蕾嚪绞椒€(wěn)定表位(圖2B)。DMSO溶劑和活性化合物的幾種類似物不能穩(wěn)定(圖2B，見表1和2)。如同來自幾種突變體p53蛋白的DBD一樣，化合物也穩(wěn)定全長野生型p53(沒有給出數(shù)據(jù)，圖2C)。在化合物的存在下，突變蛋白和不存在化合物的野生型蛋白質(zhì)一樣穩(wěn)定。
這些化合物保留對于mAb1620的表位的同時，它們不恢復已經(jīng)損耗的表位的p53。例如，當在加入化合物Y之前加熱p53 DBD時mAb1620反應性沒有提高。盡管化合物的存在降低了表位損耗的速度，但是延長的加熱導致1620-正構象最終損耗。此外，該化合物不表現(xiàn)出可逆性結(jié)合p53，因為在37℃下溫育之前加入和洗出化合物Y不阻止表位的損耗(沒有給出數(shù)據(jù))。這些發(fā)現(xiàn)與p53DBD和化合物的相互作用使得該蛋白質(zhì)更穩(wěn)定地保持mAb1620識別的功能構象的模型相一致。
活性化合物的結(jié)構。鑒定的所有活性化合物通過一個特定長度的連接物將一個疏水基團(平面多環(huán))和一個陽離子基團(經(jīng)常是一個胺)連接在一起。在疏水位置(R1)的苯并咪唑，苯并喹啉，吩噻嗪，和苯乙烯基喹唑啉是活性的，而這些基團和簡單的雙環(huán)或單環(huán)基團的微妙變化在實驗的特殊條件下是沒有活性的(表1)。如果穩(wěn)定50％對于mAb1620的表位需要的化合物的量的兩個匹配對(見表1)之間的差異大于10倍時，在該項測試中化合物稱為“活性的”。因此，應該注意到，在該項測試中稱為沒有活性的化合物不絕對是沒有活性的，只是相對沒有活性。因此，活性陽離子基團(R2)包括二甲基胺，二乙基胺，二乙醇胺，甲胺，甲基哌嗪，和嗎啉(表1)。當在吩噻嗪系列中測試時，一些更大的胺相應地更具活性。在R2位置帶負電荷或者不帶電荷的基團例如羧基或苯基根據(jù)在該項測試中確定的沒有活性(表1)。R1和R2基團之間的間距對于在該項測試中化合物的活性也是重要的，因為比丙基長度短的連接物降低相對化合物活性(表2)。丁基連接物比丙基連接物能力稍微小一些，而在該項測試中其中存在更長連接物的化合物表現(xiàn)出更小活性(表2，沒有給出數(shù)據(jù))。保持正確距離的支化連接體一般比相應的線性連接物更具活性。
這些一般性發(fā)現(xiàn)不限制本發(fā)明的范圍，而是可以在實施本發(fā)明中使用來設計其它分子。
表1活性對化合物的結(jié)構特征的依賴性 *活性和沒有活性指匹配的化合物對的效力差別＞10倍。在滴定實驗中通過穩(wěn)定50％對于mAb1620的表位需要的化合物的量確定相對效力。
表2活性對R1和R2基團之間的間距的依賴性 *在45℃加熱30分鐘的0.5ng的p53DBD上保存50％的對于mAb1620的表位需要的化合物的濃度。
C.討論這些結(jié)果證實恢復突變體p53功能和開發(fā)抗癌治療的新的策略的原理的證據(jù)。該實施例報道了能對分離的DBD起作用來促進其構象穩(wěn)定性的第一類化合物的發(fā)現(xiàn)。
VII.實施例2測定細胞和腫瘤中p53構象在該實施例和下面的實施例中，證明原型化合物在低微摩爾濃度下起作用，在活細胞和腫瘤中調(diào)節(jié)突變體p53，并且抑制自然攜帶突變的p53的腫瘤的生長。
A.材料和方法細胞培養(yǎng).從ATCC獲得所有的細胞系，并且在含有10％胎牛血清的推薦的培養(yǎng)基(Gibco BRL)中培養(yǎng)。
p53構象的測定。將大約1×107H1299/報道子+突變體p53細胞處理過夜，用冷的Tris緩沖鹽水淋洗三次，并且在1.5ml of低滲溶胞緩沖液(20mM HEPES，pH7.4，10mM NaCl，20％甘油，0.2mM EDTA，0.1％Triton-X 100，10mM含有蛋白水解酶抑制劑的二硫蘇糖醇)中裂解。4℃下以2000rpm離心5分鐘使細胞在微離心管中成丸狀，通過將該丸狀物再次懸浮于含有0.5M NaCl的相同的緩沖液中制備細胞核提取物。在Dounce勻漿器中用三體積的上述含有0.5MNaCl的緩沖液將腫瘤樣品勻漿。通過在4℃下以10000rpm離心10分鐘使細胞裂解液澄清。根據(jù)從使用mAbDO-1抗體和p53的蛋白質(zhì)印跡定量的使細胞核提取物的p53含量標準化并且捕獲到MaxiSorpF96平板(Nunc)的孔中，所述MaxiSorp F96平板已經(jīng)在4℃下用mAbDO-1以0.05M碳酸緩沖液，pH9.6中1μg/ml的濃度包被過夜。這些孔用冷的PBS洗滌，在4℃下用4％脫脂奶的PBS溶液封閉3小時，并且使用脫脂奶中HRP-偶聯(lián)的mAb1620抗體探測。在冰上將抗體溫育1小時，然后用含有0.05％Tween 20的PBS洗滌三次，并且使用TMB底物顯示信號。利用裂解物隨溫度變化的表達大量1620-陽性p53的(32℃)H1299/報道子+突變體p53細胞作出標準曲線。樣品的量在標準曲線的線性范圍內(nèi)，并且在每一個樣品校正總的p53和在未處理的裂解物中校正1620-陽性p53級份。
B.結(jié)果細胞中構象的穩(wěn)定化作用。使用專門地表達突變體p53的活細胞測定化合物穩(wěn)定細胞p53的1620-正構象的能力。H1299細胞，其不存在p53，用來自腫瘤的突變體p53(173位點)轉(zhuǎn)染，并且在蛋白質(zhì)印跡中使用非構象敏感性p53抗體(mAbDO-1)來篩選表達大量該突變蛋白的克隆。在從轉(zhuǎn)染子獲得的提取物中檢測到具有對于mAb1620的表位的低穩(wěn)定狀態(tài)水平的p53，證明小部分的突變體p53可以保持活性構象(Chen等，1993，致癌基因(Oneogene)8，2159-2166)。低微摩爾濃度的化合物X將細胞中1620陽性p53的穩(wěn)定狀態(tài)部分增加大約5-倍(圖3A)。在處理后4-6小時表位富集達到最大水平。根據(jù)通過與mAbDO-1反應性測定的總量的p53沒有改變，所述mAbDO-1針對位于該蛋白質(zhì)的氨基末端的非構象敏感性表位。
C.討論這些結(jié)果證明通過本發(fā)明方法鑒定的穩(wěn)定構象的化合物可以在活細胞中穩(wěn)定p53的活性構象。在腫瘤中恢復突變體p53的化合物可以靶向總的非功能p53集合或者靶向具有對于mAb1620的表位的p53子集。這里描述的化合物的關鍵靶物看起來是新合成的仍然保持活性構象的突變體p53。事實上，化合物增強1620表位的持久性，但是不能恢復在體外加熱之前就損耗的1620表位。增強在新合成的p53上的活性構象的穩(wěn)定性的化合物將使以時間依賴性方式累集功能p53的穩(wěn)定狀態(tài)水平。觀察到的細胞中實現(xiàn)最大1620表位增強的4小時延遲與該假設相一致(圖3A)。
VIII.實施例3p53功能的恢復A.材料和方法。用編碼突變體p53蛋白(173A，249S)和新霉素可選擇標記物的表達質(zhì)粒和使用DOTAP陽離子脂質(zhì)轉(zhuǎn)染-試劑(Boehringer Mannheim)或磷酸鈣轉(zhuǎn)染細胞。也用編碼潮霉素抗性標記和p53報道基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞，所述報道基因由置于驅(qū)動熒光素酶基因的SV40基礎啟動子上游的相應于單純皰疹病毒胸苷激酶基因的啟動子區(qū)中的p53結(jié)合序列的p53結(jié)合序列的4個拷貝組成(GenBank登記號S57428胸苷激酶堿基編號26-58，其以序列GCCTTGCCT開始并且以序列TGCCTTTTC終止)。通過攜帶突變體p53表達的另外的構建體的報道構建體轉(zhuǎn)染細胞的克隆來制備匹配的細胞對。選擇轉(zhuǎn)染的克隆用于在根據(jù)需要在含有潮霉素或G418的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。用化合物處理96-孔組織培養(yǎng)平板(Costar)中的細胞單層，并且利用底物轉(zhuǎn)化測試(Promega)和利用Dynatech微量板發(fā)光計定量測定熒光素酶活性。
WAF1和p53表達。將培養(yǎng)的細胞處理21小時，用冷的Tris緩沖鹽水沖洗三次，敲碎，并且以10,000rpm離心30秒沉積，然后將它們再懸浮于50mM HEPES，pH7.5，0.1％NP40，250mM NaCl，5mM EDTA，50mM NaF，1mM DTT，50μg/ml抑肽酶，1mg/ml Pefabloc(Boehringer Mannheim)。使用Bradford試劑(BioRad)測定蛋白質(zhì)濃度，并且將5或10μg的細胞裂解物加載到8-16％梯度聚丙烯酰胺/SDS凝膠(Novex)上。將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到含有20％甲醇的Towbin’s緩沖液(Towbin等，1979，美國國家科學院院刊(Proc.Nat.Acad.Sci.USA)76，4350)中的Immobilon P膜(Millipore)上。將膜分成32.5和47.5kDa之間分子量標記物兩部分，并且在室溫下在SuperBlock(Pierce)加3％脫脂奶中封閉1小時。使用單克隆抗體EA 10(Calbiochem WAF I Ab-1)WAF 1表達，并且用mAbDO-1(Calbiochem p53 Ab-6)對印跡的上一半探測總的p53表達。用含有0.1％Tween 20的Tris緩沖鹽水將印跡淋洗1小時，三次更換洗滌液，然后加入第二抗體，HRP-偶聯(lián)的抗-小鼠IgG。使用RenaissanceECL(DuPont)觀察泳帶并且暴露給Hyperfilm ECL(Amersharn LifeScience)。
B.結(jié)果在細胞中恢復p53功能。為了測定p53構象的穩(wěn)定性是否導致更好地保留野生型功能，我們檢查了p53的序列特異性轉(zhuǎn)錄活性。用p53可誘導的熒光素酶報道基因轉(zhuǎn)染H1299細胞，并且用突變體p53第二次轉(zhuǎn)染穩(wěn)定的克隆(HI299/報道基因)，獲得表達報道基因和173位點突變p53兩者的匹配克隆(H1299/報道基因+突變p53)。通過報道基因誘導測定化合物增強的突變體p53的轉(zhuǎn)錄活性(圖3B)。在H1299/報道基團細胞中觀察到低水平的轉(zhuǎn)錄激活，這是可能由于存在p53同系物，p73(沒有給出數(shù)據(jù))。盡管我們還沒有確定這些化合物是否能增強p73活性，廣泛的p53依賴性增強報道基因誘導提示p53是這些細胞中主要的靶物。由于細胞分離限制了作為較高劑量下化合物的效力，在相對小的濃度范圍內(nèi)發(fā)生報道基因p53-依賴性激活。處理后12-16小時轉(zhuǎn)錄活性的增強達到最大(沒有給出數(shù)據(jù))。該觀察與處理后4-6小時發(fā)生的功能p53構象穩(wěn)定化作用之后作為次級事件發(fā)生的報道基因表達相一致。
在報道基因誘導測試中化合物Y優(yōu)于化合物X。這可能歸因于涉及DNA損傷并且導致p53蛋白質(zhì)水平提高的化合物Y的第二作用(圖3B)?；衔颵，而不是化合物X，在細胞活性需要的濃度下提高總的p53蛋白質(zhì)水平。為了確認DNA損傷不只是負責化合物Y對p53報道基因的誘導，我們測定了DNA損傷劑阿霉素的作用。盡管阿霉素有在細胞中誘導突變體p53蓄積的能力(沒有給出數(shù)據(jù))，但是在寬濃度范圍內(nèi)(0.4-40μg/ml)阿霉素不誘導報道基因。這些結(jié)果證明構象穩(wěn)定化作用，而不是突變體p53的蓄積，可以促進特異性轉(zhuǎn)錄活性。特別地，化合物X，其不提高總的p53蛋白質(zhì)的穩(wěn)定狀態(tài)水平，表現(xiàn)出通過構象穩(wěn)定化作用獨特地恢復p53轉(zhuǎn)錄功能。
在突變體p53的存在下化合物X正調(diào)節(jié)WAF1，一種p53-響應性細胞基因產(chǎn)物。用突變體p53表達載體轉(zhuǎn)染不表達p53的Saos-2骨肉瘤細胞，并且分離表達兩個突變體之一的克隆(173位點或249位點)。與親本Saos-2細胞相比，這些克隆表達更低基礎水平的WAF1，可能反映出我們對較快生長克隆的選擇。用化合物X將這些細胞處理16小時并且在蛋白質(zhì)印跡上對代表等量蛋白質(zhì)的裂解物分析p53和WAF1。不是親本Saos-2細胞的表達兩種突變體p53蛋白質(zhì)之一的細胞經(jīng)處理提高了WAF1的表達水平(圖4)。這些裂解物中p53蛋白質(zhì)的總量基本上沒有變化。阿霉素在攜帶突變體p53的Saos-2細胞中不誘導WAF-1表達，但是它在表達野生型p53的U20S細胞中確實提高了WAF-1表達(沒有給出數(shù)據(jù))。
C.討論這里描述的穩(wěn)定構象試劑的作用模式明顯與對于傳統(tǒng)的細胞毒性抗腫瘤藥物所發(fā)現(xiàn)的不同。在癌癥化療中使用的細胞毒性藥物在攜帶突變體p53的細胞中一般是無效的(Lowe等，1993，Nature 362，847-849；O’Connor等，1997，癌癥研究(Cancer Res.)57,4285300)。事實上，DNA損傷物質(zhì)，阿霉素，在我們的試驗中不恢復突變體p53的轉(zhuǎn)錄活性。通過在正常細胞和腫瘤細胞中總p53蛋白質(zhì)的顯著誘導也證明細胞毒性化合物。化合物X在細胞或腫瘤中不誘導總p53蛋白質(zhì)水平。因為p53誘導是細胞DNA損傷的敏感量度，在有效濃度下化合物X可以損傷DNA是不可能的。總而言之，我們的發(fā)現(xiàn)表明通過一種DNA損傷-非依賴性機理可以發(fā)生1620正構象的穩(wěn)定化作用和突變體p53活性的功能恢復。
幾條證據(jù)排除了對蛋白質(zhì)穩(wěn)定化作用的非特異性作用。甘油，一種蛋白質(zhì)變性的非特異性抑制劑，其通過置換水并且產(chǎn)生圍繞蛋白質(zhì)分子的疏水性微觀環(huán)境，可以在600mM的濃度下恢復突變小鼠p53細胞中核定位(Brown等，1997，臨床研究雜志(J.Clin.Invest.)99,1432-1444)。在該項測試中化合物X在0.03mM時是有活性的，提示該化合物和p53之間發(fā)生涉及特異性接觸的精確得多的相互作用(沒有給出數(shù)據(jù))。此外，在培養(yǎng)物和體內(nèi)在大量其它蛋白質(zhì)存在下化合物X可以影響p53構象的觀察(見下文)與p53的選擇性識別相一致。此外，化合物與p53相互作用的本質(zhì)可能不涉及與天然蛋白質(zhì)的緊密結(jié)合。與處于過渡狀態(tài)的小子集蛋白質(zhì)分子的強的相互作用可能起作用來阻止活性構象的進一步偏向或者有利于反轉(zhuǎn)為天然構象。
IX.實施例4腫瘤生長測定A.材料和方法腫瘤生長測定.用PBS洗滌培養(yǎng)的細胞，并且在20克雌性NU/NU-nuBR小鼠(Charles River Laboratories)的右側(cè)腹單側(cè)地接種在90％Matrigel(Becton Dickinson)中的1X 106A375.S2或5X106DLD1細胞。腹膜內(nèi)施用含有0.1％Pluronic P-105(BASF)的鹽水溶液中的化合物X。利用雙腳規(guī)測定二維的腫瘤直徑，并且轉(zhuǎn)化為腫瘤體積(Buhus等，1986，J.Surg.Oncol.31，229-234)。
B.結(jié)果體內(nèi)調(diào)節(jié)p53.化合物X在攜帶突變的p53的腫瘤中增強具有對于mAb1620的表位的p53級分的穩(wěn)定狀態(tài)水平。以100mg/Kg對攜帶由注射的H1299/報道基因+突變體p53細胞產(chǎn)生的皮下腫瘤的小鼠腹膜內(nèi)施用化合物。單一劑量的化合物后殺死動物并且對腫瘤裂解物分析全和1620-陽性p53表達。根據(jù)用mAbDO-1的蛋白質(zhì)印跡分析測定，總的p53水平?jīng)]有變化。裂解物對總p53含量的細微變化進行標準化并在表達mAb1620的表位的ELISA檢測中測定。處理后3-5小時內(nèi)表位增加(圖5)。體內(nèi)反應的時間過程類似于培養(yǎng)的細胞(圖3A)。
為了體內(nèi)評價突變體p53的功能恢復，我們評價了來自處理和未處理動物的腫瘤中熒光素酶報道基因的表達。在給藥后8小時時觀察到報道基因的最大4.5-倍誘導(圖5)。構象和功能響應之間的滯后可以反映熒光素酶轉(zhuǎn)錄體的翻譯和該蛋白質(zhì)的蓄積需要的時間。小鼠體內(nèi)最大血漿濃度是大約10μg/ml，低于細胞中報道基因的最大誘導需要的水平(沒有給出數(shù)據(jù))。因此，與培養(yǎng)的細胞相比的腫瘤中的低水平的報道基因誘導可能由于次最優(yōu)暴露。
C.討論結(jié)果證明穩(wěn)定構象的化合物功能上可以恢復很多隨機選擇的突變體。因此，本發(fā)明的方法和化合物廣泛適用于不同的p53突變體。例如，DLD-1細胞中241位點突變，其影響次要的DNA接觸位點，可以通過化合物X的穩(wěn)定活性得以功能性補充。因此，很多種p53突變體，包括DNA接觸位點處的一些，可以在活性構象的穩(wěn)定化作用時得以恢復。
雖然體外穩(wěn)定野生型和突變體p53兩者的構象，化合物X證明體內(nèi)治療選擇性。實際上，以200mg/kg/天(100mg/kg b.i.d.)連續(xù)對小鼠給藥14天時觀察到表現(xiàn)出安全而且不致死的該化合物(沒有給出數(shù)據(jù))。該選擇性可能歸因于與腫瘤細胞中高得多的水平相比在正常細胞中非常低穩(wěn)定狀態(tài)水平的p53(Lassos等，1996，EMBO J.15，4566-4573)。而且，腫瘤特異性應激反應例如DNA損害和氧或營養(yǎng)物缺乏可能優(yōu)先啟動腫瘤細胞的對p53的編程性細胞死亡作用(Chen等，1996，基因和發(fā)育(Genes and Dev.)10，2438-2451)。如果是這樣，通過將穩(wěn)定p53的化合物和放射療法或基因毒性治療相結(jié)合，可能實現(xiàn)協(xié)同的抗腫瘤效果。
上述說明書足以使本領域技術人員實施本發(fā)明。實際上，對于分子生物學，藥學領域或相關領域的技術人員顯而易見的進行本發(fā)明的上述方法的各種變化在下面的權利要求書的范圍內(nèi)。
權利要求
1.一種促進人p53家族蛋白質(zhì)突變體形式中野生型活性的方法，其中該蛋白質(zhì)的一種或多種功能活性至少部分被所述蛋白質(zhì)的在生理條件下保持功能構象的無能而損害，所述方法包括下面的步驟(a)使所述突變蛋白接觸能在生理條件下結(jié)合所述突變蛋白中的一個或多個結(jié)構域并且穩(wěn)定其中的功能構象的一種有機非肽化合物，和(b)允許所述穩(wěn)定化的蛋白質(zhì)與參與所述野生型活性的一個或多個大分子相互作用。
2.權利要求1的方法，其中所述蛋白質(zhì)選自p53，p63，和p73。
3.權利要求2的方法，其中所述蛋白質(zhì)是p53。
4.權利要求1的方法，其中所述有機非肽化合物選自 其中，對于第I組， R5是-N-R18R19，其中R18是H，(C1-C6)烷基，或苯基，和R19是H，(C1-C6)烷基，(C3-C10)環(huán)烷基，或苯基，其中所述烷基，環(huán)烷基或苯基任選被羥基，(C3-C8)環(huán)雜烷基，-CONR18(CH2)pNR20R21，-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21，或-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21取代，其中p是0-5，m是0-5，n是0-5，R22是羥基或(C1-C6)烷基，和R20和R21各自獨立地選自(a)H，(C1-C12)烷基，(C3-C12)環(huán)烷基，(C3-C10)雜環(huán)烷基，(C6-C10)芳基，(C5-C9)雜芳基，(C1-C6)烷基(C6-C12)芳基，其中所述基團任選被一個或多個羥基，鹵基，氨基，三氟甲基，(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷氧基，(C1-C6)烷基(C3-C10)雜環(huán)烷基，或(C1-C6)烷基(C6-C12)芳基取代；或(b)NR20R21一起代表氫，嗎啉，或4-(C1-C6)烷基哌嗪；R6是(a)(C1-C6)烷基或(C2-C8)鏈烯基，各自任選被一個或多個苯基取代，或者(b)被鹵基，(C1-C6)烷氧基取代的苯基；和R7和R8是相同或不同的，并且選自H，硝基，(C1-C6)烷氧基，或選自氟，氯和溴的鹵素；其中，對于第II組， R9是(C1-C6)烷基，(C3-C10)環(huán)烷基，或苯基，其中所述烷基，環(huán)烷基或苯基任選被羥基，(C3-C8)環(huán)雜烷基，-CONR18(CH2)pNR20R21，-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21，或-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21取代，其中p是0-5，m是0-5，n是0-5，R22是羥基或(C1-C6)烷基，和R20和R21各自獨立地選自H，(C1-C12)烷基，(C3-C12)環(huán)烷基，(C3-C10)雜環(huán)烷基，(C6-C10)芳基，(C5-C9)雜芳基，(C1-C6)烷基(C6-C12)芳基，其中所述基團任選被一個或多個羥基，鹵基，氨基，三氟甲基，(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷氧基，(C1-C6)烷基(C3-C10)雜環(huán)烷基，(C1-C6)烷基(C5-C9)雜芳基，或(C1-C6)烷基(C6-C10)芳基取代；其中，對于第III組， R10是-N-R18R19，其中R18是H，(C1-C6)烷基，或苯基，和R19是H，(C1-C6)烷基，(C3-C10)環(huán)烷基，或苯基，其中所述烷基，環(huán)烷基或苯基任選被羥基，(C3-C8)環(huán)雜烷基，-CONR18(CH2)pNR20R21，-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21，或-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21取代，其中p是0-5，m是0-5，n是0-5，R22是羥基或(C1-C6)烷基，和R20和R21各自獨立地選自(a)H，(C1-C12)烷基，(C3-C12)環(huán)烷基，(C3-C10)雜環(huán)烷基，(C6-C10)芳基，(C5-C9)雜芳基，(C1-C6)烷基(C6-C12)芳基，其中所述基團任選被一個或多個羥基，鹵基，氨基，三氟甲基，(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷氧基，(C1-C6)烷基(C3-C10)雜環(huán)烷基，(C1-C6)烷基(C5-C9)雜芳基或(C1-C6)烷基(C6-C10)芳基取代；或(b)NR20R21一起代表氫，嗎啉，或4-(C1-C6)烷基哌嗪；A和B是相同或不同的并且各自代表碳或氮；和R11和R12是相同或不同的，并且選自H，硝基，(C1-C6)烷氧基，或選自氟，氯和溴的鹵素；其中，對于第IV組， R13是-N-R18R19，其中R18是H，(C1-C6)烷基，或苯基，和R19是H，(C1-C6)烷基，(C3-C10)環(huán)烷基，或苯基，其中所述烷基，環(huán)烷基或苯基任選被羥基，(C3-C8)環(huán)雜烷基，-CONR18(CH2)pNR20R21，-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21，或-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21取代，其中p是0-5，m是0-5，n是0-5，R22是羥基或(C1-C6)烷基，和R20和R21各自獨立地選自(a)H，(C1-C12)烷基，(C3-C12)環(huán)烷基，(C3-C10)雜環(huán)烷基，(C1-C6)烷基(C5-C9)雜芳基，(C5-C9)雜芳基，(C6-C10)芳基，和(C1-C6)烷基(C6-C10)芳基，其中所述基團任選被一個或多個羥基，鹵基，氨基，三氟甲基，(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷氧基，(C1-C6)烷基(C3-C10)雜環(huán)烷基，(C1-C6)烷基(C5-C9)雜芳基或(C1-C6)烷基(C6-C10)芳基取代；或(b)NR20R21一起代表氫，嗎啉，或4-(C1-C6)烷基哌嗪；A和B是相同或不同的并且各自代表碳或氮；和R14和R15是相同或不同的，并且選自H，硝基，(C1-C6)烷氧基，或選自氟，氯和溴的鹵素；和其中，對于第V組， A是碳或氮；R16是-N-R18R19，其中R18是H，(C1-C6)烷基，或苯基，和R19is H，(C1-C6)烷基，(C3-C10)環(huán)烷基，或苯基，其中所述烷基，環(huán)烷基或苯基任選被羥基，(C3-C8)環(huán)雜烷基，-CONR18(CH2)pNR20R21，-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21，或-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21取代，其中p是0-5，m是0-5，n是0-5，R22是羥基或(C1-C6)烷基，和R20和R21各自獨立地選自(a)H，(C1-C12)烷基，(C3-C12)環(huán)烷基，(C3-C10)雜環(huán)烷基，(C6-C10)芳基，(C5-C9)雜芳基，(C1-C6)烷基(C6-C10)芳基，和(C1-C6)烷基(C5-C9)雜芳基，或者其中所述基團任選被一個或多個羥基，鹵基，氨基，三氟甲基，(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷氧基，(C1-C6)烷基(C3-C10)雜環(huán)烷基，(C1-C6)烷基(C5-C9)雜芳基或(C1-C6)烷基(C6-C10)芳基取代；或(b)NR20R21一起代表氫，嗎啉，或4-(C1-C6)烷基哌嗪；R17選自H，硝基，(C1-C6)烷氧基，或選自氟，氯和溴的鹵素。
5.權利要求1的方法，其中所述有機非肽化合物結(jié)合人p53蛋白的DNA結(jié)合域，殘基94-312。
6.權利要求5的方法，其中所述p53蛋白質(zhì)的DNA結(jié)合域包括選自下面的氨基酸位點的錯義突變殘基143，173，175，241和249。
7.權利要求1的方法，其中同時進行步驟(a)和(b)。
8.權利要求1的方法，其中順序進行步驟(a)和(b)。
9.一種對人受治療者治療一種與具有一種或幾種減小的野生型活性的p53家族突變蛋白質(zhì)的擁有有關的疾病狀態(tài)的方法，包括下面的步驟(a)對受所述受治療者施用一種能在生理條件下結(jié)合所述突變蛋白中的一個或多個結(jié)構域并且穩(wěn)定其中的功能構象的有機非肽化合物，并且(b)允許所述患者內(nèi)穩(wěn)定化的蛋白質(zhì)與參與所述野生型活性的一個或多個大分子相互作用。
10.權利要求9的方法，其中所述蛋白質(zhì)選自p53，p63，和p73。
11.權利要求10的方法，其中所述蛋白質(zhì)是p53。
12.權利要求10的方法，其中所述有機非肽化合物結(jié)合人p53蛋白的DNA結(jié)合域，殘基94-312。
13.權利要求12的方法，其中所述p53蛋白質(zhì)的DNA結(jié)合域包括選自下面的氨基酸位點的錯義突變殘基143，173，175，241和249。
14.權利要求9的方法，其中同時進行步驟(a)和(b)。
15.權利要求9的方法，其中順序進行步驟(a)和(b)。
16.權利要求10的方法，其中所述疾病是癌癥。
17.一種對人受治療者治療癌癥的方法，包括下面的步驟(a)對受所述受治療者施用一種能在生理條件下結(jié)合人p53家族蛋白中的一個或多個結(jié)構域并且穩(wěn)定其中的功能構象的有機非肽化合物，并且(b)允許所述穩(wěn)定化的蛋白質(zhì)與參與所述蛋白質(zhì)野生型活性的一個或多個大分子相互作用。
18.權利要求17的方法，其中所述蛋白質(zhì)選自p53，p63，和p73。
19.權利要求17的方法，其中所述蛋白質(zhì)是p53。
20.權利要求17的方法，其中所述有機非肽化合物選自 其中，對于第I組， R5是-N-R18R19，其中R18是H，(C1-C6)烷基，或苯基，和R19是H，(C1-C6)烷基，(C3-C10)環(huán)烷基，或苯基，其中所述烷基，環(huán)烷基或苯基任選被羥基，(C3-C8)環(huán)雜烷基，-CONR18(CH2)pNR20R21，-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21，或-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21取代，其中p是0-5，m是0-5，n是0-5，R22是羥基或(C1-C6)烷基，和R20和R21各自獨立地選自(a)H，(C1-C12)烷基，(C3-C12)環(huán)烷基，(C3-C10)雜環(huán)烷基，(C6-C10)芳基，(C5-C9)雜芳基，(C1-C6)烷基(C6-C12)芳基，其中所述基團任選被一個或多個羥基，鹵基，氨基，三氟甲基，(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷氧基，(C1-C6)烷基(C3-C10)雜環(huán)烷基，或(C1-C6)烷基(C6-C12)芳基取代；或(b)NR20R21一起代表氫，嗎啉，或4-(C1-C6)烷基哌嗪；R6是(a)(C1-C6)烷基或(C2-C8)鏈烯基，各自任選被一個或多個苯基取代，或者(b)被鹵基，(C1-C6)烷氧基取代的苯基；和R7和R8是相同或不同的，并且選自H，硝基，(C1-C6)烷氧基，或選自氟，氯和溴的鹵素；其中，對于第II組， R9是(C1-C6)烷基，(C3-C10)環(huán)烷基，或苯基，其中所述烷基，環(huán)烷基或苯基任選被羥基，(C3-C8)環(huán)雜烷基，-CONR18(CH2)pNR20R21，-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21，或-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21取代，其中p是0-5，m是0-5，n是0-5，R2是羥基或(C1-C6)烷基，和R20和R21各自獨立地選自H，(C1-C12)烷基，(C3-C12)環(huán)烷基，(C3-C10)雜環(huán)烷基，(C6-C10)芳基，(C5-C9)雜芳基，(C1-C6)烷基(C6-C12)芳基，其中所述基團任選被一個或多個羥基，鹵基，氨基，三氟甲基，(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷氧基，(C1-C6)烷基(C3-C10)雜環(huán)烷基，(C1-C6)烷基(C5-C9)雜芳基，或(C1-C6)烷基(C6-C10)芳基取代；其中，對于第III組， R10是-N-R18R19，其中R18是H，(C1-C6)烷基，或苯基，和R19是H，(C1-C6)烷基，(C3-C10)環(huán)烷基，或苯基，其中所述烷基，環(huán)烷基或苯基任選被羥基，(C3-C8)環(huán)雜烷基，-CONR18(CH2)pNR20R21，-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21，或-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21取代，其中p是0-5，m是0-5，n是0-5，R22是羥基或(C1-C6)烷基，和R20和R21各自獨立地選自(a)H，(C1-C12)烷基，(C3-C12)環(huán)烷基，(C3-C10)雜環(huán)烷基，(C6-C10)芳基，(C5-C9)雜芳基，(C1-C6)烷基(C6-C12)芳基，其中所述基團任選被一個或多個羥基，鹵基，氨基，三氟甲基，(C1-C1)烷基，(C1-C6)烷氧基，(C1-C6)烷基(C3-C10)雜環(huán)烷基，(C1-C6)烷基(C5-C9)雜芳基或(C1-C6)烷基(C6-C10)芳基取代；或(b)NR20R21一起代表氫，嗎啉，或4-(C1-C6)烷基哌嗪；A和B是相同或不同的并且各自代表碳或氮；和R11和R12是相同或不同的，并且選自H，硝基，(C1-C6)烷氧基，或選自氟，氯和溴的鹵素；其中，對于第IV組， R13是-N-R18R19，其中R18是H，(C1-C6)烷基，或苯基，和R19是H，(C1-C6)烷基，(C3-C10)環(huán)烷基，或苯基，其中所述烷基，環(huán)烷基或苯基任選被羥基，(C3-C8)環(huán)雜烷基，-CONR18(CH2)pNR20R21，-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21，或-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21取代，其中p是0-5，m是0-5，n是0-5，R22是羥基或(C1-C6)烷基，和R20和R21各自獨立地選自(a)H，(C1-C12)烷基，(C3-C12)環(huán)烷基，(C3-C10)雜環(huán)烷基，(C1-C6)烷基(C5-C9)雜芳基，(C5-C9)雜芳基，(C6-C10)芳基，和(C1-C6)烷基(C6-C10)芳基，其中所述基團任選被一個或多個羥基，鹵基，氨基，三氟甲基，(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷氧基，(C1-C6)烷基(C3-C10)雜環(huán)烷基，(C1-C6)烷基(C5-C9)雜芳基或(C1-C6)烷基(C6-C10)芳基取代；或(b)NR20R21一起代表氫，嗎啉，或4-(C1-C6)烷基哌嗪；A和B是相同或不同的并且各自代表碳或氮；和R14和R15是相同或不同的，并且選自H，硝基，(C1-C6)烷氧基，或選自氟，氯和溴的鹵素；和其中，對于第V組， A是碳或氮；R16是-N-R18R19，其中R18是H，(C1-C6)烷基，或苯基，和R19是H，(C1-C6)烷基，(C3-C10)環(huán)烷基，或苯基，其中所述烷基，環(huán)烷基或苯基任選被羥基，(C3-C8)環(huán)雜烷基，-CONR18(CH2)pNR20R21，-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21，或-(CH2)p-(CHR22)m-(CH2)n-NR20R21取代，其中p是0-5，m是0-5，n是0-5，R22是羥基或(C1-C6)烷基，和R20和R21各自獨立地選自(a)H，(C1-C12)烷基，(C3-C12)環(huán)烷基，(C3-C10)雜環(huán)烷基，(C6-C10)芳基，(C5-C9)雜芳基，(C1-C6)烷基(C6-C10)芳基，和(C1-C6)烷基(C5-C9)雜芳基，或者其中所述基團任選被一個或多個羥基，鹵基，氨基，三氟甲基，(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷氧基，(C1-C6)烷基(C3-C10)雜環(huán)烷基，(C1-C6)烷基(C5-C9)雜芳基或(C1-C6)烷基(C6-C10)芳基取代；或(b)NR20R21一起代表氫，嗎啉，或4-(C1-C6)烷基哌嗪；和R17選自H，硝基，(C1-C6)烷氧基，或選自氟，氯和溴的鹵素。
21.權利要求17的方法，其中所述有機非肽化合物結(jié)合人p53蛋白的DNA結(jié)合域，殘基94-312。
22.權利要求17的方法，其中所述有機非肽化合物靶向的p53家族蛋白質(zhì)是野生型的。
23.權利要求17的方法，其中所述有機非肽化合物靶向的p53家族蛋白質(zhì)是等位基因變異體編碼的突變體。
24.權利要求1的方法，其中所述有機非肽化合物選自 (1-芐基-哌啶-4-基)-(3-吩噻嗪-10-基-丙基)-胺 [2-(4-氯-苯基)-乙基]-(3-吩噻嗪-10-基-丙基)-胺 (3-吩噻嗪-10-基-丙基)-二氫苯并噻喃-4-基-胺 [1-甲基-3-(2，6，6-三甲基-環(huán)己-2-烯基)-烯丙基]-(3-吩噻嗪-10-基-丙基)-胺 (7-乙氧基-1，2，3，4-四氫-萘-2-基)-(3-吩噻嗪-10-基-丙基)-胺 N’-(9-氟-苯并[c]吖啶-7-基)-N，N-二甲基-丙烷-1，3-二胺 N’-吖啶-9-基-N，N-二甲基-丙烷-1，3-二胺 2-{4-[4-(苯并[g]喹啉-4-基氨基)-苯基]-哌嗪-1-基}-乙醇 N4-{2-[2-(4-溴-苯基)-乙烯基]-7-氯-喹唑啉-4-基}-N1，N1-二乙基-戊烷-1，4-二胺 N-苯并[g]喹啉-5-基-N’-環(huán)己基-丙烷-1，3-二胺 2-[(2-羥基-乙基)-(3-{2-[2-(4-甲氧基-苯基)-乙烯基]-喹唑啉-4-基氨基}-丙基)-氨基]-乙醇。
25.權利要求17的方法，其中所述有機非肽化合物選自 (1-芐基-哌啶-4-基)-(3-吩噻嗪-10-基-丙基)-胺 [2-(4-氯-苯基)-乙基]-(3-吩噻嗪-10-基-丙基)-胺 (3-吩噻嗪-10-基-丙基)-二氫苯并噻喃-4-基-胺 [1-甲基-3-(2，6，6-三甲基-環(huán)己-2-烯基)-烯丙基]-(3-吩噻嗪-10-基-丙基)-胺 (7-乙氧基-1，2，3，4-四氫-萘-2-基)-(3-吩噻嗪-10-基-丙基)-胺 N’-(9-氟-苯并[c]吖啶-7-基)-N，N-二甲基-丙烷-1，3-二胺 N’-吖啶-9-基-N，N-二甲基-丙烷-1，3-二胺 2-{4-[4-(苯并[g]喹啉-4-基氨基)-苯基]-哌嗪-1-基}-乙醇 N4-2-[2-(4-溴-苯基)-乙烯基]-7-氯-喹唑啉-4-基}-N1，N1-二乙基-戊烷-1，4-二胺 N-苯并[g]喹啉-5-基-N’-環(huán)己基-丙烷-1，3-二胺 2-[(2-羥基-乙基)-(3-{2-[2-(4-甲氧基-苯基)-乙烯基]-喹唑啉-4-基氨基}-丙基)-氨基]-乙醇。
全文摘要
本發(fā)明提供了能與P
文檔編號A61P25/00GK1329493SQ99814010
公開日2002年1月2日 申請日期1999年12月1日 優(yōu)先權日1998年12月2日
發(fā)明者H·A·考菲, R·D·康耐克, B·A·福斯特, F·拉斯廷扎德 申請人:輝瑞產(chǎn)品公司