專利名稱：離子交換色譜介質(zhì)輔助蛋白質(zhì)復(fù)性的方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及離子交換色譜介質(zhì)輔助蛋白質(zhì)復(fù)性技術(shù)，及其在蛋白質(zhì)稀釋復(fù)性中的 應(yīng)用，屬于生物技術(shù)中的蛋白質(zhì)復(fù)性技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
自70年代重組DNA技術(shù)發(fā)明以來，現(xiàn)代生物技術(shù)的迅猛發(fā)展推動了重組蛋白質(zhì)產(chǎn) 品的開發(fā)。由于大腸桿菌表達(dá)體系具有質(zhì)粒結(jié)構(gòu)簡單、營養(yǎng)要求低、生長迅速、蛋白質(zhì)產(chǎn)量 高、容易分離純化的優(yōu)點(diǎn)，所以目前大部分重組蛋白質(zhì)都是采用大腸桿菌為宿主體系。對于 該體系而言，目標(biāo)蛋白質(zhì)產(chǎn)品常常以無活性聚集體-包含體的形式存在。包含體中蛋白質(zhì) 的一級結(jié)構(gòu)正確，但是無三級結(jié)構(gòu)，必須通過復(fù)性才能得到預(yù)期生物活性的蛋白質(zhì)。由于蛋 白質(zhì)自身結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，復(fù)性較為困難，使得復(fù)性成為了基因工程生產(chǎn)生物醫(yī)藥蛋白質(zhì)的 瓶頸。由于蛋白質(zhì)從無活性松散肽鏈折疊復(fù)性到具有活性的天然態(tài)蛋白質(zhì)的過程中，蛋白 質(zhì)聚集沉淀是影響蛋白質(zhì)復(fù)性收率的最重要因素，所以抑制聚集成為促進(jìn)復(fù)性的關(guān)鍵。目前加入復(fù)性添加劑是抑制蛋白質(zhì)聚集的一個極為重要的方法。如應(yīng)用人工分 子伴侶，用表面活性劑分子抑制變性分子聚集，通過加入環(huán)糊精來剝離蛋白質(zhì)使其復(fù) 性；應(yīng)用甘油、聚乙二醇、甜菜堿、精氨酸、鹽酸胍、尿素等添加劑來削弱分子間的疏水作用 (Effectof Additives on Refolding of a denatured protein. Biotechnology Progress, 2008,14,601-606 ；Chaperonin and osmolyte protein folding and related screening methods, US patent, US6887682, 2005)而使得蛋白質(zhì)不易聚集。然而，應(yīng)用這些添加劑在 抑制聚集輔助復(fù)性中存在如下問題它們的加入都會在復(fù)性體系中引入新的“雜質(zhì)”，需要 進(jìn)一步進(jìn)行其與復(fù)性后天然蛋白質(zhì)的分離操作，而且分離困難，添加劑不能夠重復(fù)利用。迄今所報道的色譜介質(zhì)對蛋白質(zhì)的復(fù)性作用主要是在色譜柱內(nèi)，通過疏水作用或 者靜電作用對變性蛋白進(jìn)行吸附抑制蛋白分子之間的疏水相互作用及聚集。目前還沒有直 接將色譜介質(zhì)作為有效添加劑來輔助蛋白質(zhì)復(fù)性的報道。關(guān)于蛋白質(zhì)的色譜復(fù)性，人們已 經(jīng)有了非常詳細(xì)的研究。色譜復(fù)性包括過柱復(fù)性(尺寸排阻色譜)和吸附洗脫復(fù)性(疏水 相互作用色譜、離子交換色譜、親和層析色譜)。對于離子交換色譜，人們關(guān)注于與蛋白質(zhì)帶 有相反電荷的色譜介質(zhì)對蛋白質(zhì)的輔助復(fù)性效果(Folding and refolding of proteins inchromatographic beds. Current Opinion in Biotechnology,2004,15,487-494), O=L^ 并沒有人研究與蛋白質(zhì)帶有同種電荷的色譜介質(zhì)輔助蛋白質(zhì)復(fù)性的效果。色譜復(fù)性方法具 有的優(yōu)勢是在復(fù)性的同時實(shí)現(xiàn)分離，不會引入其它雜質(zhì)分子，然而此法需要應(yīng)用比較昂貴 的色譜設(shè)備，操作條件苛刻，處理量小，放大困難，而且在輔助包含體蛋白質(zhì)復(fù)性的過程中 蛋白質(zhì)聚集易造成管路堵塞等問題。為了克服添加劑輔助復(fù)性以及色譜復(fù)性的不足，本發(fā)明提出了一種新型的離子交 換色譜介質(zhì)輔助蛋白質(zhì)復(fù)性的方法，所有操作簡單，不需要昂貴的大型設(shè)備，不會對復(fù)性蛋 白質(zhì)造成污染，而且作為添加劑的離子交換色譜介質(zhì)經(jīng)適當(dāng)處理后可重復(fù)利用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于建立一種通過抑制變性蛋白質(zhì)聚集從而輔助變性蛋白質(zhì)有效 復(fù)性的技術(shù)方法。本方法利用與復(fù)性條件下蛋白質(zhì)帶有同種電荷的離子交換色譜介質(zhì)為添 加劑，通過離子交換色譜介質(zhì)與蛋白質(zhì)間的靜電排斥作用抑制變性蛋白質(zhì)的聚集，從而輔 助蛋白質(zhì)高效復(fù)性。本方法具有無需液相色譜系統(tǒng)、操作簡單、無污染等特點(diǎn)，此外作為添 加劑的離子交換色譜介質(zhì)可以重復(fù)使用。本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案加以實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明的離子交換色譜介質(zhì)輔助蛋白質(zhì)復(fù)性方法，步驟如下1)采用與蛋白質(zhì)帶有同種電荷的離子交換色譜介質(zhì)；2)離子交換色譜介質(zhì)預(yù)處理，用鹽洗沖掉雜質(zhì)離子后，再用去離子水沖掉鹽溶 液；3)將色譜介質(zhì)加入復(fù)性液中，然后再將變性蛋白質(zhì)加入復(fù)性緩沖液開始復(fù)性，4)復(fù)性完成后，采用離心或重力沉降方法收集上清液；獲得復(fù)性蛋白溶液。所述的的離子交換色譜介質(zhì)為帶有正電荷的陰離子交換色譜介質(zhì)或帶有負(fù)電荷 的陽離子交換色譜介質(zhì)。帶有正電荷的陰離子交換色譜介質(zhì)為DEAE-S印haroes Fast Flow 或Q-S^harose Fast Flow。帶有負(fù)電荷的陽離子交換色譜介質(zhì)為SP-S印harose Fast Flow 或 CM-Sepharose Fast Flow。所述的復(fù)性緩沖液為0. 02-0. IM三羥甲基氨基甲烷(Tris) ,0-0. 003M乙二胺四乙 酸二鈉(EDTA)、0-2M 尿素；pH 值為 7. 5-9. 0。復(fù)性緩沖液中無無機(jī)鹽或無機(jī)鹽含量不高于0. 05M。所述的步驟2)方法是將所選的離子交換色譜介質(zhì)移入燒結(jié)玻璃漏斗抽濾除去 液體后，依次用摩爾濃度為0. 2-2M氯化鈉溶液和去離子水各沖洗3-8次，每次沖洗所用的 液體體積為離子交換色譜介質(zhì)沉降體積的20-30倍。所述的步驟3)方法是復(fù)性緩沖液中色譜介質(zhì)的濃度為0. 025-0. 5g/mL ；混合 物置于溫度為20-37°C的恒溫水浴中振蕩預(yù)平衡直至溫度恒定；然后，加入待復(fù)性蛋白 質(zhì)溶液，復(fù)性液中蛋白的終濃度為0. 07-4mg/mL ；振蕩混勻后，放入恒溫水浴中在轉(zhuǎn)速為 50-170rpm條件下復(fù)性，復(fù)性溫度與此前復(fù)性液預(yù)平衡的溫度相同。本發(fā)明的離子交換色譜介質(zhì)輔助蛋白質(zhì)復(fù)性方法，應(yīng)用于復(fù)性過程中易于聚集的 蛋白質(zhì)，包括不含二硫鍵的蛋白質(zhì)、含有二硫鍵但是二硫鍵未斷開或未發(fā)生錯配的蛋白質(zhì) 以及含二硫鍵并且二硫鍵被還原斷開或發(fā)生錯配的蛋白質(zhì)的復(fù)性。具體說明如下本發(fā)明所述的離子交換色譜介質(zhì)輔助蛋白質(zhì)復(fù)性方法，根據(jù)復(fù)性液pH值下變性 蛋白質(zhì)所帶電荷性質(zhì)選擇帶有同類電荷的離子交換色譜介質(zhì)；所選的離子交換色譜介質(zhì)移 入燒結(jié)玻璃漏斗抽濾除去液體后，依次用摩爾濃度為0. 2-2M氯化鈉溶液和去離子水各沖 洗3-8次，每次沖洗所用的液體體積為離子交換色譜介質(zhì)沉降體積的20-30倍；經(jīng)上述處理 后離子交換色譜介質(zhì)移入由0.02-0. IM三羥甲基氨基甲烷(Tris)、0-0. 003M乙二胺四乙酸 二鈉(EDTA)、0-2M尿素組成且pH為7. 5-9. 0的復(fù)性緩沖液中，使最終復(fù)性緩沖液中色譜介 質(zhì)的濃度為0. 025-0. 5g/mL ；上述混合物置于溫度為20_37°C的恒溫水浴中振蕩預(yù)平衡直 至溫度恒定；然后，加入待復(fù)性蛋白質(zhì)溶液，復(fù)性液中蛋白的終濃度為0. 07-4mg/mL ；振蕩
4混勻后，放入恒溫水浴中在轉(zhuǎn)速為50-170rpm條件下復(fù)性，復(fù)性溫度與此前復(fù)性液預(yù)平衡 的溫度相同；復(fù)性完成后，采用離心或重力沉降方法收集上清液；沉降的色譜介質(zhì)進(jìn)一步 用復(fù)性緩沖液沖洗3-5次，每次復(fù)性液的用量為色譜介質(zhì)沉降體積的1. 5-3倍；用離心或重 力沉降方法收集每次沖洗后的上清液，所收集的上清液合并后獲得復(fù)性蛋白溶液；使用后 的離子交換色譜介質(zhì)依次用0. 5-2M氯化鈉溶液和去離子水徹底沖洗后可重復(fù)利用。本發(fā)明的離子交換色譜介質(zhì)輔助蛋白質(zhì)復(fù)性的方法應(yīng)用于變性蛋白質(zhì)復(fù)性中。變 性失活的蛋白質(zhì)樣品使用本發(fā)明的方法進(jìn)行復(fù)性可以保證較高的復(fù)性收率。復(fù)性過程中易 于聚集的蛋白質(zhì)均可使用本專利的復(fù)性方法進(jìn)行復(fù)性。本發(fā)明的方法可用于含有二硫鍵蛋白質(zhì)的復(fù)性和不含二硫鍵的蛋白質(zhì)的復(fù)性。對 于不含二硫鍵的蛋白質(zhì)，復(fù)性過程可選擇偏離蛋白質(zhì)等電點(diǎn)1.0以上的PH進(jìn)行復(fù)性。對于 含二硫鍵并且二硫鍵被還原斷開的變性蛋白質(zhì)可以在氧化還原劑存在下使用本專利方法 進(jìn)行復(fù)性，優(yōu)選的PH為偏離蛋白質(zhì)等電點(diǎn)1. 0以上，并且不小于7. 5的pH條件。本發(fā)明的離子交換色譜介質(zhì)輔助蛋白質(zhì)復(fù)性方法中，復(fù)性緩沖液中可以含有其它 抑制聚集的添加劑尿素，二者具有協(xié)同的效果，可以共同促進(jìn)復(fù)性收率的提高。本發(fā)明的關(guān)鍵技術(shù)有四點(diǎn)首先，離子交換色譜介質(zhì)的選用方法，根據(jù)蛋白質(zhì)所帶 的電荷性質(zhì)，采用與蛋白質(zhì)帶有同種電荷的離子交換色譜介質(zhì)，溶液中的色譜介質(zhì)與變性 蛋白質(zhì)分子間的靜電斥力可以有效地抑制變性蛋白質(zhì)分子在復(fù)性溶液中的聚集；其次，離 子交換色譜介質(zhì)預(yù)處理，用鹽洗沖掉雜質(zhì)離子后，再用去離子水沖掉鹽溶液，防止鹽在復(fù)性 過程中會削弱蛋白質(zhì)和色譜介質(zhì)之間的靜電斥力；關(guān)鍵之三色譜介質(zhì)和變性蛋白質(zhì)加入復(fù) 性液的順序，在輔助蛋白質(zhì)復(fù)性時，要先將色譜介質(zhì)加入復(fù)性液中，然后再將變性蛋白質(zhì)加 入復(fù)性液開始復(fù)性，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)由變性液稀釋到復(fù)性液過程的最初階段是聚集的最重要階 段，在此階段里變性蛋白質(zhì)疏水殘基暴露相對較多，比較容易發(fā)生分子間聚集；關(guān)鍵之四復(fù) 性完成后離子交換色譜介質(zhì)的處理，由于蛋白質(zhì)和離子交換色譜介質(zhì)之間具有靜電斥力， 使得通過簡單的離心就可以使色譜介質(zhì)和蛋白質(zhì)得到很好的分離，色譜介質(zhì)可以很容易進(jìn) 行重復(fù)利用。本發(fā)明所介紹的離子交換色譜介質(zhì)作為添加劑輔助蛋白質(zhì)復(fù)性的方法與其它的 添加劑輔助復(fù)性方法以及離子交換色譜輔助復(fù)性方法相比有如下優(yōu)點(diǎn)第一，本發(fā)明所采 用的添加劑是不溶于水的離子交換色譜介質(zhì)，不會污染蛋白質(zhì)；第二，本發(fā)明所采用的添加 劑在復(fù)性完成后，易與蛋白質(zhì)分離；第三，本發(fā)明介紹的離子交換色譜介質(zhì)復(fù)性方法，不需 要色譜柱或色譜系統(tǒng)等昂貴的大型設(shè)備，操作簡單，成本低廉，易于應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)。


圖1 實(shí)施例1中的強(qiáng)陰離子交換色譜介質(zhì)Q-S印harose Fast Flow輔助4mg/mL 還原變性溶菌酶的復(fù)性；圖2 實(shí)施例2中的弱陰離子交換色譜介質(zhì)DEAE-S印harose Fast Flow輔助4mg/ mL還原變性溶菌酶的復(fù)性；圖3 實(shí)施例3中的強(qiáng)陰離子交換色譜介質(zhì)Q-S印harose Fast Flow在含NaCl條 件下輔助4mg/mL還原變性溶菌酶的復(fù)性；圖4 實(shí)施例4中的強(qiáng)陰離子交換色譜介質(zhì)Q-S印harose Fast Flow在0. 025g/mL和0. 5g/mL濃度下輔助還原變性溶菌酶的復(fù)性；圖5 實(shí)施例5中的強(qiáng)陰離子交換色譜介質(zhì)Q-S印harose Fast Flow輔助0. 07mg/ mL還原變性溶菌酶的復(fù)性；圖6 實(shí)施例6中的強(qiáng)陰離子交換色譜介質(zhì)Q-S印harose Fast Flow在氧化型谷 胱甘肽為氧化劑時輔助4mg/mL還原變性溶菌酶的復(fù)性；圖7 實(shí)施例7中的強(qiáng)陽離子交換色譜介質(zhì)SP-S印harose Fast Flow輔助2mg/mL 還原變性牛血清白蛋白的復(fù)性；圖8 實(shí)施例8中的弱陽離子交換色譜介質(zhì)CM-S印harose Fast Flow輔助2mg/mL 還原變性牛血清白蛋白的復(fù)性；圖9 實(shí)施例9中的強(qiáng)陽離子交換色譜介質(zhì)SP-S印harose Fast Flow輔助0. 4mg/ mL變性碳酸酐酶II的復(fù)性；圖10 實(shí)施例10中的弱陽離子交換色譜介質(zhì)CM-S印harose Fast Flow輔助 0. 4mg/mL變性碳酸酐酶II的復(fù)性。
具體實(shí)施例方式下面的實(shí)例將對本發(fā)明提供的方法予以進(jìn)一步的說明。實(shí)施例1 強(qiáng)陰離子交換色譜介質(zhì)Q-S印harose Fast Flow輔助4mg/mL還原變性 溶菌酶的復(fù)性由于溶菌酶在復(fù)性pH 8. 5條件下帶正電，所以離子交換色譜介質(zhì)選擇為帶有正 電荷的陰離子交換色譜介質(zhì)Q-Sepharose Fast Flow0在燒結(jié)玻璃砂濾漏斗中放入2mL儲 存于20%乙醇中的離子交換色譜介質(zhì)Q-S印harose Fast Flow，首先抽濾掉20%的乙醇溶 液，再用160mL 0. 5M NaCl溶液分4次對色譜介質(zhì)進(jìn)行沖洗，每次加入40mL 0. 5M NaCl溶 液，用玻璃棒攪拌均勻，然后抽去水溶液。之后用去離子水200mL分5次沖洗色譜介質(zhì)，每 次加入40mL去離子水后用玻璃棒攪拌均勻，然后抽去水溶液。最后用去離子水洗完之后， 持續(xù)抽干lOmin，放入4°C冰箱備用。變性蛋白質(zhì)樣品:60mg/mL溶菌酶在含有8M尿素，0. IM DTT, 0. IM Tris-HCl和 0. 00IMEDTA, pH 8. 5的變性緩沖溶液中于40°C還原變性3小時。復(fù)性緩沖液為含有IM尿 素、0. 0054M胱胺和0. 00IMEDTA的0. IM Tris-HCl緩沖液，溶液pH為8. 5。對于不含色譜 介質(zhì)的復(fù)性是將復(fù)性緩沖液溫度平衡使其達(dá)到20°C形成ImL復(fù)性液，對于含有色譜介質(zhì)的 復(fù)性是向復(fù)性緩沖液中加入0. 2g色譜介質(zhì)，溫度平衡使含有色譜介質(zhì)的復(fù)性緩沖液達(dá)到 20°C并振蕩混合均勻形成ImL復(fù)性液；然后，在復(fù)性液中加入變性蛋白質(zhì)，迅速振蕩混勻， 然后放入恒溫?fù)u床170rpm開始復(fù)性，復(fù)性過程中恒溫?fù)u床的溫度也為20°C。溶菌酶的活性 檢測以微球菌為底物，1. 30mL 0. 25mg/mL底物的pH 6. 2的磷酸鹽緩沖液與0. IOmL稀釋后 的蛋白質(zhì)復(fù)性液充分混合，測定反應(yīng)液在450nm下的吸光度變化。活性測定溫度25°C。通 過0-90s間吸光值降低速率與天然酶催化條件下的降低速率的比值來計算溶菌酶活性收 率。復(fù)性完成后IOOOOrpmX Imin離心，取上清，向沉降的色譜介質(zhì)中加入復(fù)性緩沖液0. 4mL 沖洗，然后離心、取上清，反復(fù)4次沖洗，可將復(fù)性蛋白質(zhì)回收近100%。其它條件相同，加入 色譜介質(zhì)和不加色譜介質(zhì)的復(fù)性收率隨時間變化比較如圖1所示。由圖可知，在上述實(shí)驗(yàn) 條件下陰離子交換色譜介質(zhì)Q-S印harose Fast Flow的加入可以極大地提高帶正電荷的變性還原溶菌酶的復(fù)性收率，在最終蛋白質(zhì)濃度達(dá)到4mg/mL高濃度的條件下仍然可以獲得 94%的活性收率，而不加入色譜介質(zhì)的復(fù)性收率只能達(dá)到40%。將沉降的0. 2g Q-Sepharose Fast Flow 色譜介質(zhì)用 0· 5M NaCl 溶液平衡 15min， lOOOOrpmX Imin離心去除上清，將吸附的雜質(zhì)洗脫；將色譜介質(zhì)放入燒結(jié)玻璃砂濾漏斗， 先用16mL IM NaCl溶液分4次清洗，然后用去離子水16mL分4次沖洗；最后用20%的乙
醇保存?zhèn)溆?。?shí)施例2 弱陰離子交換色譜介質(zhì)DEAE-S^harose Fast Flow輔助4mg/mL還原 變性溶菌酶的復(fù)性由于溶菌酶在復(fù)性pH 8. 5條件下帶正電，所以離子交換色譜介質(zhì)為陰離子交換 色譜介質(zhì)DEAE-S印harose Fast Flow。在燒結(jié)玻璃砂濾漏斗中放入2mL儲存于20%乙醇中 的離子交換色譜介質(zhì)DEAE-S印harose Fast Flow，首先抽濾掉20%的乙醇溶液，再用120mL 2MNaCl溶液分3次對色譜介質(zhì)進(jìn)行沖洗，每次加入40mL 2M NaCl溶液，用玻璃棒攪拌均勻， 然后抽去水溶液。之后用去離子水ISOmL分3次沖洗色譜介質(zhì)，每次加入60mL去離子水后 用玻璃棒攪拌均勻，然后抽去水溶液。最后用去離子水洗完之后，持續(xù)抽干lOmin，放入4°C 冰箱備用。變性蛋白質(zhì)樣品:60mg/mL溶菌酶在含有8M尿素，0. IM DTT, 0. IM Tris-HCl和 0. 001M EDTA，pH 8. 5的變性緩沖溶液中于40°C變性3小時。復(fù)性緩沖液為:pH 8. 5的0. 02M Tris-HCl含IM尿素、0. 0054M胱胺和0. 003M EDTA。對于不含色譜介質(zhì)的復(fù)性是將復(fù)性緩 沖液溫度平衡使其達(dá)到37°C形成ImL復(fù)性液，對于含有色譜介質(zhì)的復(fù)性是向復(fù)性緩沖液中 加入0. 2g色譜介質(zhì)，溫度平衡使含有色譜介質(zhì)的復(fù)性緩沖液達(dá)到37°C并振蕩混合均勻形 成ImL復(fù)性液；然后，在溫度平衡后的復(fù)性液中加入變性蛋白質(zhì)，迅速振蕩混勻，然后放入 恒溫?fù)u床50rpm開始復(fù)性，復(fù)性過程中恒溫?fù)u床的溫度也為37°C?；钚詸z測應(yīng)用的是微球 菌為底物，1. 30mL 0. 25mg/mL底物的pH 6. 2的磷酸鹽緩沖液與0. IOmL稀釋后的蛋白質(zhì)復(fù) 性液充分混合，測定反應(yīng)液在450nm下的吸光度變化?；钚詼y定溫度25°C。通過0_90s間 吸光值降低速率與天然酶催化條件下的降低速率的比值來計算溶菌酶活性收率。采用本專 利所述方法復(fù)性，復(fù)性液中色譜介質(zhì)加入量為0. 2g/mL。復(fù)性完成后lOOOOrpmX Imin離心， 取上清，向沉降的色譜介質(zhì)中加入復(fù)性緩沖液0. 6mL沖洗，然后IOOOOrpmX Imin離心、取上 清，反復(fù)3次沖洗，可將復(fù)性蛋白質(zhì)回收近100%。其它條件相同，加入色譜介質(zhì)和不加色 譜介質(zhì)的復(fù)性收率隨時間變化比較如圖2所示。由圖可知，在上述實(shí)驗(yàn)條件下陰離子交換 色譜介質(zhì)DEAE-S印harose Fast Flow的加入可以極大地提高變性還原的溶菌酶的復(fù)性收 率，在最終蛋白質(zhì)濃度達(dá)到4mg/mL高濃度的條件下仍然可以獲得85%的活性收率，而不加 入色譜介質(zhì)的復(fù)性收率只能達(dá)到40%。將DEAE-S印harose Fast Flow 色譜介質(zhì)用 2M NaCl 溶液平衡 5min， lOOOOrpmX Imin離心去除上清，將吸附的雜質(zhì)洗脫；將色譜介質(zhì)放入燒結(jié)玻璃砂濾漏斗， 先用0. 5M NaCl溶液16mL分3次清洗，然后用去離子水16mL分4次清洗，最后用20%的乙
醇保存?zhèn)溆?。?shí)施例3 強(qiáng)陰離子交換色譜介質(zhì)Q-S印harose Fast Flow在含NaCl條件下輔助 4mg/mL還原變性溶菌酶的復(fù)性離子交換色譜介質(zhì)為實(shí)施例1準(zhǔn)備的陰離子交換色譜介質(zhì)Q-S印harose Fast
7Flow。變性蛋白質(zhì)樣品:60mg/mL溶菌酶在含有8M尿素，0. IM DTT, 0. IM Tris-HCl,pH 8.5 的變性緩沖溶液中于40°C變性3小時。復(fù)性緩沖液為pH 8. 5的0. IMTris-HCl含IM尿 素、0. 0054M胱胺、0. 025或0. 05M NaCl和0. OOlM EDTA。實(shí)驗(yàn)過程中復(fù)性恒溫?fù)u床的溫度 為25°C?；钚詸z測應(yīng)用的是微球菌為底物，1. 30mL 0. 25mg/mL底物的pH 6. 2的磷酸鹽緩沖 液與0. IOmL稀釋后的蛋白質(zhì)復(fù)性液充分混合，測定反應(yīng)液在450nm下的吸光度變化。通過 0-90s間吸光值降低速率與天然酶催化條件下的降低速率的比值來計算溶菌酶活性收率。 活性測定溫度25°C。采用本專利所述方法復(fù)性，復(fù)性液中色譜介質(zhì)加入量為0和0. 2g/mL。 復(fù)性完成后自然沉降5min，取上清，向沉降的色譜介質(zhì)中加入復(fù)性緩沖液0. 3mL沖洗，然后 IOOOOrpmX Imin離心、取上清，反復(fù)5次沖洗，可將復(fù)性蛋白質(zhì)回收近100%。其它條件相 同，復(fù)性4小時后加入色譜介質(zhì)和不加色譜介質(zhì)的復(fù)性收率比較如圖3所示。由圖可知，在 上述實(shí)驗(yàn)條件下陰離子交換色譜介質(zhì)Q-S印harose Fast Flow的加入可以極大地提高變性 還原溶菌酶的復(fù)性收率，在最終蛋白質(zhì)濃度達(dá)到4mg/mL高濃度的條件下有0. 025M NaCl存 在時可以獲得75%的活性收率，有0. 05M NaCl存在時可以獲得63%的活性收率，而不加入 色譜介質(zhì)的復(fù)性收率只能達(dá)到45%以下。將沉降的Q-S^harose Fast Flow色譜介質(zhì)用IM NaCl溶液平衡lOmin， IOOOOrpmX Imin離心去除上清，然后將色譜介質(zhì)放入燒結(jié)玻璃砂濾漏斗，先用0. 5M NaCl 溶液16mL分6次清洗，然后用去離子水16mL分6次清洗，最后用20%的乙醇保存?zhèn)溆?。?shí)施例4 強(qiáng)陰離子交換色譜介質(zhì)Q-S印harose Fast Flow在0. 025g/mL和0. 5g/ mL濃度下輔助還原變性溶菌酶的復(fù)性離子交換色譜介質(zhì)為實(shí)施例1所準(zhǔn)備的陰離子交換色譜介質(zhì)Q-S印harose Fast Flow。變性蛋白質(zhì)樣品:60mg/mL溶菌酶在含有8M尿素，0. IM DTT, 0. IM Tris-HCl,pH 8.5 的變性緩沖溶液中于40°C變性3小時。復(fù)性緩沖液為pH 8. 5的0. IMTris-HCl含IM尿 素、0. 0054M胱胺和0. 001MEDTA。實(shí)驗(yàn)過程中復(fù)性恒溫?fù)u床的溫度為25°C?；钚詸z測應(yīng)用 的是微球菌為底物，1. 30mL 0. 25mg/mL底物的pH 6. 2的磷酸鹽緩沖液與0. IOmL稀釋后的 蛋白質(zhì)復(fù)性液充分混合，測定反應(yīng)液在450nm下的吸光度變化。通過0_90s間吸光值降低 速率與天然酶催化條件下的降低速率的比值來計算溶菌酶活性收率。活性測定溫度25°C。 采用本專利所述方法復(fù)性，復(fù)性液中不加入色譜介質(zhì)或加入終濃度為0. 025g/mL和0. 5g/ mL的色譜介質(zhì)。對含有色譜介質(zhì)的復(fù)性，復(fù)性完成后自然沉降5min，取上清，向沉降的色譜 介質(zhì)中分別加入復(fù)性緩沖液0. 075mL和ImL沖洗，然后IOOOOrpmX Imin離心、取上清，反復(fù) 5次沖洗，可將復(fù)性蛋白質(zhì)回收近100%。其它條件相同，復(fù)性4小時后加入色譜介質(zhì)和不 加色譜介質(zhì)的復(fù)性收率比較如圖4所示。由圖可知，在上述實(shí)驗(yàn)條件下陰離子交換色譜介 質(zhì)Q-S印harose Fast Flow的加入可以極大地提高變性還原溶菌酶的復(fù)性收率，即使在較 低的色譜介質(zhì)濃度條件下也具有很好的輔助蛋白復(fù)性的效果，在最終蛋白質(zhì)濃度達(dá)到4mg/ mL高濃度的條件下，不加色譜介質(zhì)的復(fù)性收率僅為40%，而在0. 025g/mL色譜介質(zhì)的輔助 下復(fù)性收率達(dá)到60%，在0. 5g/mL色譜介質(zhì)的輔助下，復(fù)性收率可以達(dá)到幾乎100%。將沉降的Q-S印harose Fast Flow色譜介質(zhì)用IM NaCl溶液平衡lOmin， IOOOOrpmX Imin離心去除上清，然后將色譜介質(zhì)放入燒結(jié)玻璃砂濾漏斗，先用0. 5M NaCl 溶液16mL分6次清洗，然后用去離子水16mL分6次清洗，最后用20%的乙醇保存?zhèn)溆?。?shí)施例5 強(qiáng)陰離子交換色譜介質(zhì)Q-S印harose Fast Flow輔助0. 07mg/mL還原變性溶菌酶的復(fù)性離子交換色譜介質(zhì)為實(shí)施例1準(zhǔn)備的陰離子交換色譜介質(zhì)Q-Si^pharose Fast Flow。變性蛋白質(zhì)樣品:14. 3mg/mL溶菌酶在含有8M尿素，0. IM DTT,0. IM Tris-HCl, pH 8. 5的變性緩沖溶液中于40°C變性3小時。復(fù)性緩沖液為:pH 8. 5的0. IM Tris-HCl含2M 尿素、0.0005M胱胺和0. OOlM EDTA。實(shí)驗(yàn)過程中復(fù)性恒溫?fù)u床的溫度為25°C。活性檢測應(yīng) 用的是微球菌為底物，1. 30mL 0. 25mg/mL底物的pH 6. 2的磷酸鹽緩沖液與0. IOmL稀釋后 的蛋白質(zhì)復(fù)性液充分混合，測定反應(yīng)液在450nm下的吸光度變化。通過0-90s間吸光值降低 速率與天然酶催化條件下的降低速率的比值來計算溶菌酶活性收率?；钚詼y定溫度25°C。 采用本專利所述方法復(fù)性，復(fù)性液中色譜介質(zhì)加入量為0和0. 2g/mL。復(fù)性完成后自然沉 降5min，取上清，向沉降的色譜介質(zhì)中加入復(fù)性緩沖液0. 4mL沖洗，然后IOOOOrpmX Imin 離心、取上清，反復(fù)5次沖洗，可將復(fù)性蛋白質(zhì)回收近100%。其它條件相同，復(fù)性3小時后 加入色譜介質(zhì)和不加色譜介質(zhì)的復(fù)性收率比較如圖5所示。由圖可知，在上述實(shí)驗(yàn)條件下 0. 2g/mL陰離子交換色譜介質(zhì)Q-S印harose Fast Flow的加入可以極大地提高變性還原溶 菌酶的復(fù)性收率，在最終蛋白濃度為0. 07mg/mL的條件下可獲得幾乎100%的活性收率，而 不加入色譜介質(zhì)的復(fù)性收率只能達(dá)到20%。將沉降的Q-S印harose Fast Flow色譜介質(zhì)用IM NaCl溶液平衡lOmin， IOOOOrpmX Imin離心去除上清，然后將色譜介質(zhì)放入燒結(jié)玻璃砂濾漏斗，先用0. 5M NaCl 溶液16mL分6次清洗，然后用去離子水16mL分6次清洗，最后用20%的乙醇保存?zhèn)溆?。?shí)施例6 強(qiáng)陰離子交換色譜介質(zhì)Q-S印harose Fast Flow輔助4mg/mL還原變性 溶菌酶的復(fù)性離子交換色譜介質(zhì)為陰離子交換色譜介質(zhì)Q-S印harose Fast Flow0在燒結(jié)玻璃 砂濾漏斗中放入2mL儲存于20%乙醇中的離子交換色譜介質(zhì)Q-S印harose Fast Flow，首 先抽濾掉20%的乙醇溶液，再用160mL 0. 5M NaCl溶液分4次對色譜介質(zhì)進(jìn)行沖洗，每次加 入40mL0. 5M NaCl溶液，用玻璃棒攪拌均勻，然后抽去水溶液。之后用去離子水200mL分5 次沖洗色譜介質(zhì)，每次加入40mL去離子水后用玻璃棒攪拌均勻，然后抽去水溶液。最后用 去離子水洗完之后，持續(xù)抽干lOmin，放入4°C冰箱備用。變性蛋白質(zhì)樣品:60mg/mL溶菌酶在含有8M尿素，0. IM DTT, 0. IM Tris-HCl和 0. 00IMEDTA, pH 8. 5的變性緩沖溶液中于40°C還原變性3小時。復(fù)性緩沖液為含有2M尿 素、0. 0054M氧化性谷胱甘肽(GSSG)和0. 00IMEDTA的0. IM Tris-HCl緩沖液，溶液pH為 8. 5。對于不含色譜介質(zhì)的復(fù)性是將復(fù)性緩沖液溫度平衡使其達(dá)到20°C形成ImL復(fù)性液，對 于含有色譜介質(zhì)的復(fù)性是向復(fù)性緩沖液中加入0. 2g色譜介質(zhì)，溫度平衡使含有色譜介質(zhì) 的復(fù)性緩沖液達(dá)到20°C并振蕩混合均勻形成ImL復(fù)性液；然后，在復(fù)性液中加入變性蛋白 質(zhì)，迅速振蕩混勻，然后放入恒溫?fù)u床170rpm開始復(fù)性，復(fù)性過程中恒溫?fù)u床的溫度也為 200C。溶菌酶的活性檢測以微球菌為底物，1. 30mL 0. 25mg/mL底物的pH6. 2的磷酸鹽緩沖 液與0. IOmL稀釋后的蛋白質(zhì)復(fù)性液充分混合，測定反應(yīng)液在450nm下的吸光度變化?；钚?測定溫度25°C。通過0-90s間吸光值降低速率與天然酶催化條件下的降低速率的比值來 計算溶菌酶活性收率。復(fù)性完成后lOOOOrpmXlmin離心，取上清，向沉降的色譜介質(zhì)中加 入復(fù)性緩沖液0. 4mL沖洗，然后離心、取上清，反復(fù)4次沖洗，可將復(fù)性蛋白質(zhì)回收近100%。 其它條件相同，加入色譜介質(zhì)和不加色譜介質(zhì)在復(fù)性3h之后的比較如圖6所示。由圖可知，以GSSG作為氧化劑時，在上述實(shí)驗(yàn)條件下陰離子交換色譜介質(zhì)Q-S印harose Fast Flow 的加入也可以極大地提高帶正電荷的變性還原溶菌酶的復(fù)性收率，在最終蛋白質(zhì)濃度達(dá)到 4mg/mL高濃度的條件下仍然可以獲得91 %的活性收率，而不加入色譜介質(zhì)的復(fù)性收率只 能達(dá)到59%。將沉降的0. 2g Q-Sepharose Fast Flow 色譜介質(zhì)用 0· 5M NaCl 溶液平衡 15min， lOOOOrpmX Imin離心去除上清，將吸附的雜質(zhì)洗脫；將色譜介質(zhì)放入燒結(jié)玻璃砂濾漏斗， 先用16mL IM NaCl溶液分4次清洗，然后用去離子水16mL分4次沖洗；最后用20%的乙
醇保存?zhèn)溆谩?shí)施例7 強(qiáng)陽離子交換色譜介質(zhì)SP-S^harose Fast Flow輔助2mg/mL還原變 性牛血清白蛋白的復(fù)性由于牛血清白蛋白在復(fù)性pH 9條件下帶負(fù)電，所以離子交換色譜介質(zhì)選擇為帶 有負(fù)電荷的陽離子交換色譜介質(zhì)SP-S印harose Fast Flow0在燒結(jié)玻璃砂濾漏斗中放入 2mL儲存于20%乙醇中的離子交換色譜介質(zhì)SP-S^harose Fast Flow，首先抽濾掉20% 的乙醇溶液，再用400mL 0. 2M NaCl溶液分8次對色譜介質(zhì)進(jìn)行沖洗，每次加入50mL 0. 2M NaCl溶液，用玻璃棒攪拌均勻，然后抽去水溶液。之后用去離子水400mL分8次沖洗色譜介 質(zhì)，每次加入50mL去離子水后用玻璃棒攪拌均勻，然后抽去水溶液。最后用去離子水洗完 之后，持續(xù)抽干lOmin，放入4°C冰箱備用。變性蛋白質(zhì)樣品60mg/mL牛血清白蛋白在含有8M尿素，0. IM DTT, 0. 05MTris-HCl和0. 001MEDTA，pH 8. 5的變性緩沖溶液中于25°C變性3小時。復(fù)性緩沖液 為:pH 9的0. 05M Tris-HCl.O. 0027M胱胺和0. 001M EDTA0對于不含色譜介質(zhì)的復(fù)性樣 品，直接溫度平衡使復(fù)性緩沖液達(dá)到25°C形成2mL復(fù)性液，對于含有色譜介質(zhì)的復(fù)性樣品， 向復(fù)性緩沖液中加入0. 2g色譜介質(zhì)，溫度平衡使含有色譜介質(zhì)的復(fù)性緩沖液達(dá)到25°C并 且振蕩混合均勻形成2mL復(fù)性液；然后，在復(fù)性液中加入變性蛋白質(zhì)樣品，迅速振蕩混勻， 然后放入恒溫?fù)u床IOOrpm開始復(fù)性。復(fù)性過程中恒溫?fù)u床的溫度也為25°C。復(fù)性液中天 然牛血清白蛋白定量通過C18反相色譜分離，根據(jù)峰面積進(jìn)行定量。采用本專利所述方法 復(fù)性，復(fù)性液中色譜介質(zhì)加入量為0. lg/mL。復(fù)性完成后自然沉降15min，取上清，然后向沉 降的色譜介質(zhì)中加入復(fù)性緩沖液0. 3mL沖洗，然后IOOOOrpmX Imin離心、取上清，如此反復(fù) 三次沖洗，可將復(fù)性蛋白質(zhì)回收近100%。其它條件相同，加入色譜介質(zhì)和不加色譜介質(zhì)的 復(fù)性收率隨時間變化比較如圖7所示。由圖可知，在上述實(shí)驗(yàn)條件下陽離子交換色譜介質(zhì) SP-Sepharose Fast Flow的加入可以極大地提高帶負(fù)電荷的變性還原的牛血清白蛋白的 復(fù)性收率，在最終蛋白質(zhì)濃度達(dá)到2mg/mL高濃度的條件下仍然可以獲得85%的復(fù)性收率， 而不加入色譜介質(zhì)的普通稀釋復(fù)性收率只能達(dá)到26%。將沉降的SP-S印harose Fast Flow色譜介質(zhì)用2M NaCl溶液平衡15min， lOOOOrpmX Imin離心去除上清，將吸附的雜質(zhì)洗脫；將色譜介質(zhì)放入燒結(jié)玻璃砂濾漏斗， 先用0. 5MNaCl溶液16mL分5次清洗，然后用去離子水16mL分5次清洗，最后用20%的乙
醇保存?zhèn)溆?。?shí)施例8 弱陽離子交換色譜介質(zhì)CM-S印harose Fast Flow輔助2mg/mL還原變 性牛血清白蛋白的復(fù)性離子交換色譜介質(zhì)為陽離子交換色譜介質(zhì)CM-S印harose Fast Flow。在燒結(jié)玻璃
10砂濾漏斗中放入2mL儲存于20%乙醇中的離子交換色譜介質(zhì)CM-S印harose Fast Flow，首 先抽濾掉20%的乙醇溶液，再用160mL 0. 5M NaCl溶液分4次對色譜介質(zhì)進(jìn)行沖洗，每次加 入40mL 0. 5M NaCl溶液，用玻璃棒攪拌均勻，然后抽去水溶液。之后用去離子水200mL分5 次沖洗色譜介質(zhì)，每次加入40mL去離子水后用玻璃棒攪拌均勻，然后抽去水溶液。最后用 去離子水洗完之后，持續(xù)抽干lOmin，然后放入4°C冰箱備用。變性蛋白質(zhì)樣品60mg/mL牛血清白蛋白在含有8M尿素，0. IM DTT, 0. 05mMTris-HCl和0. OOlM EDTA，pH 8. 5的變性緩沖溶液中于25°C變性3小時。復(fù)性緩沖液 為:pH 8. 5的0. 05M Tris-HCl.O. 0027M胱胺和0. OOlM EDTA0對于不含色譜介質(zhì)的復(fù)性樣 品，直接溫度平衡使復(fù)性緩沖液達(dá)到25°C形成2mL復(fù)性液，對于含有色譜介質(zhì)的復(fù)性樣品， 向復(fù)性緩沖液中加入0. 2g色譜介質(zhì)，溫度平衡使含有色譜介質(zhì)的復(fù)性緩沖液達(dá)到25°C并 且振蕩混合均勻形成2mL復(fù)性液；然后，在溫度平衡后的復(fù)性液中加入變性蛋白質(zhì)樣品，迅 速振蕩混勻，然后放入恒溫?fù)u床IOOrpm開始復(fù)性。復(fù)性過程中恒溫?fù)u床的溫度也為25°C。 復(fù)性液中天然牛血清白蛋白定量通過C18反相色譜分離，根據(jù)峰面積進(jìn)行定量。采用本專 利所述方法復(fù)性，復(fù)性液中色譜介質(zhì)加入量為0. lg/mL。復(fù)性完成后lOOOOrpmX Imin離心， 取上清，然后向沉降的色譜介質(zhì)中加入復(fù)性緩沖液0. 3mL沖洗，然后lOOOOrpmX Imin離心、 取上清，如此反復(fù)三次沖洗，可將復(fù)性蛋白質(zhì)回收近100%。其它條件相同，加入色譜介質(zhì) 和不加色譜介質(zhì)的復(fù)性收率隨時間變化比較如圖8所示。由圖可知，在上述實(shí)驗(yàn)條件下陽 離子交換色譜介質(zhì)CM-S印harose Fast Flow的加入可以極大地提高帶負(fù)電的變性還原的 牛血清白蛋白的復(fù)性收率，在最終蛋白質(zhì)濃度達(dá)到2mg/mL高濃度的條件下仍然可以獲得 82%的復(fù)性收率，而不加入色譜介質(zhì)的復(fù)性收率只能達(dá)到26%。實(shí)施例9 強(qiáng)陽離子交換色譜介質(zhì)SP-S^harose Fast Flow輔助0. 4mg/mL變性 碳酸酐酶II的復(fù)性由于在pH7. 5的復(fù)性條件下CAII帶有負(fù)電荷，所以離子交換色譜介質(zhì)選擇為實(shí)施 例7所準(zhǔn)備的陽離子交換色譜介質(zhì)SP-S印harose Fast Flow0變性蛋白質(zhì)樣品12mg/mL 碳酸酐酶II在含有8M尿素，0. 05M Tris-HCl,pH 7. 5的變性緩沖溶液中于25°C變性24小 時。復(fù)性緩沖液為PH 7.5&0.05M Tris-HCl含2Μ尿素。對于不含色譜介質(zhì)的復(fù)性樣品， 直接溫度平衡使復(fù)性緩沖液達(dá)到25°C形成2mL復(fù)性液，對于含有色譜介質(zhì)的復(fù)性樣品，向 復(fù)性緩沖液中加入0. 2g色譜介質(zhì)，溫度平衡使含有色譜介質(zhì)的復(fù)性緩沖液達(dá)到25°C并且 振蕩混合均勻形成2mL復(fù)性液；然后在復(fù)性液中加入變性蛋白質(zhì)樣品，迅速振蕩混勻，放入 恒溫?fù)u床170rpm開始復(fù)性。復(fù)性過程中恒溫?fù)u床的溫度也為25°C?；钚詸z測方法應(yīng)用 4-硝基苯基乙酸酯為底物的水解反應(yīng)，15 μ L復(fù)性樣品加入到ImL 0. 05Μ Tris-HCl, 0. 005Μ EDTA, pH 7.5，and 10 μ L of 0. IM 4-硝基苯基乙酸酯的乙腈溶液.在400nm波長下檢測 其吸光值變化。通過0-90s間吸光值升高速率與天然酶催化條件下的升高速率的比值來計 算碳酸酐酶II的活性收率?；钚詼y定溫度25°C。采用本專利所述方法復(fù)性，復(fù)性液中色 譜介質(zhì)加入量為0. lg/mL。復(fù)性完成后自然沉降lOmin，取上清，然后向沉降的色譜介質(zhì)中 加入復(fù)性緩沖液0. 3mL沖洗，然后IOOOOrpmX Imin離心、取上清，如此反復(fù)3次沖洗，可將 復(fù)性蛋白質(zhì)回收近100%。其它條件相同，加入色譜介質(zhì)和不加色譜介質(zhì)復(fù)性4小時后收率 比較如圖9所示。由圖可知，在上述實(shí)驗(yàn)條件下陰離子交換色譜介質(zhì)SP-Si^pharose Fast Flow的加入可以極大地提高變性碳酸酐酶II的復(fù)性收率，在最終蛋白質(zhì)濃度達(dá)到0. 4mg/
11mL濃度的條件下仍然可以獲得幾乎100%的復(fù)性收率，而不加入色譜介質(zhì)的復(fù)性收率只能 達(dá)到74%。實(shí)施例10 弱陽離子交換色譜介質(zhì)CM-S^harose Fast Flow輔助0. 4mg/mL變性 碳酸酐酶II的復(fù)性由于在pH 7. 5的復(fù)性條件下CAII帶有負(fù)電荷，所以離子交換色譜介質(zhì)選擇為實(shí) 施例8所準(zhǔn)備的陽離子交換色譜介質(zhì)CM-S印harose Fast Flow。變性蛋白質(zhì)樣品12mg/mL 碳酸酐酶II在含有8M尿素，0. 05M Tris-HCl,pH 7. 5的變性緩沖溶液中于25°C變性24小 時。復(fù)性緩沖液為PH 7.5的0.05M Tris-HCl含2M尿素。含有色譜介質(zhì)的復(fù)性樣品是向復(fù) 性緩沖液中加入0.2g色譜介質(zhì)，溫度平衡使含有色譜介質(zhì)的復(fù)性緩沖液達(dá)到25°C并且振 蕩混合均勻形成2mL復(fù)性液，然后在復(fù)性液中加入變性蛋白質(zhì)樣品，迅速振蕩混勻，放入恒 溫?fù)u床170rpm開始復(fù)性。對于不含色譜介質(zhì)的復(fù)性樣品，將2mL復(fù)性緩沖液恒溫于25°C，然 后直接向其中加入變性蛋白質(zhì)樣品，迅速振蕩混勻，于170rpm復(fù)性。復(fù)性過程中恒溫?fù)u床 的溫度也為25°C?；钚詸z測方法應(yīng)用4-硝基苯基乙酸酯為底物的水解反應(yīng)，15 μ L復(fù)性樣 品加入到 ImL 0. 05Μ Tris-HCl，0. 005Μ EDTA，pH 7. 5, and 10 μ L ofO. IM 4-硝基苯基乙酸 酯的乙腈溶液.在400nm波長下檢測其吸光值變化。通過0_90s間吸光值升高速率與天然 酶催化條件下的升高速率的比值來計算碳酸酐酶II的活性收率?；钚詼y定溫度25°C。采 用本專利所述方法復(fù)性，復(fù)性液中色譜介質(zhì)加入量為0. lg/mL。復(fù)性完成后自然沉降5min， 取上清，然后向沉降的色譜介質(zhì)中加入復(fù)性緩沖液0. 3mL沖洗，然后lOOOOrpmX Imin離心、 取上清，如此反復(fù)三次沖洗，可將復(fù)性蛋白質(zhì)回收近100%。其它條件相同，復(fù)性4小時后加 入色譜介質(zhì)和不加色譜介質(zhì)的復(fù)性收率比較如圖10所示。由圖可知，在上述實(shí)驗(yàn)條件下陰 離子交換色譜介質(zhì)CM-S印harose Fast Flow的加入可以極大地提高變性碳酸酐酶II的復(fù) 性收率，在最終蛋白質(zhì)濃度達(dá)到0. 4mg/mL的濃度的條件下仍然可以獲得92%的復(fù)性收率， 而不加入色譜介質(zhì)的復(fù)性收率只能達(dá)到74%。本發(fā)明提出的離子交換色譜介質(zhì)輔助蛋白質(zhì)復(fù)性的方法及應(yīng)用，并將其用于變性 蛋白質(zhì)樣品的復(fù)性，已通過現(xiàn)場較佳實(shí)施例子進(jìn)行了描述，相關(guān)技術(shù)人員明顯能在不脫離 本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法進(jìn)行改動或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明 技術(shù)。特別需要指出的是，所有相類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的， 他們都被視為包括在本發(fā)明精神、范圍和內(nèi)容中。
權(quán)利要求
離子交換色譜介質(zhì)輔助蛋白質(zhì)復(fù)性方法，其特征在于步驟如下1)采用與蛋白質(zhì)帶有同種電荷的離子交換色譜介質(zhì)；2)離子交換色譜介質(zhì)預(yù)處理，用鹽洗沖掉雜質(zhì)離子后，再用去離子水沖掉鹽溶液；3)將色譜介質(zhì)加入復(fù)性液中，然后再將變性蛋白質(zhì)加入復(fù)性緩沖液開始復(fù)性；4)復(fù)性完成后，采用離心或重力沉降方法收集上清液；獲得復(fù)性蛋白溶液。
2.如權(quán)利要求1所述的復(fù)性方法，其特征在于所述的的離子交換色譜介質(zhì)為帶有正電 荷的陰離子交換色譜介質(zhì)或帶有負(fù)電荷的陽離子交換色譜介質(zhì)。
3.如權(quán)利要求1所述的復(fù)性方法，其特征在于所述的帶有正電荷的陰離子交換色譜介 質(zhì)為 DEAE-Sepharoes Fast Flow 或 Q-Sepharose Fast Flow。
4.如權(quán)利要求1所述的復(fù)性方法，其特征在于所述的帶有負(fù)電荷的陽離子交換色譜介 質(zhì)為 SP-Sepharose Fast Flow 或 CM-Sepharose Fast Flow。
5.如權(quán)利要求1所述的復(fù)性方法，其特征在于所述的復(fù)性緩沖液為0.02-0. IM三羥甲 基氨基甲烷、0-0. 003M乙二胺四乙酸二鈉和0-2. OM尿素；pH值為7. 5-9.0。
6.如權(quán)利要求4或5所述的復(fù)性方法，其特征在于所述的復(fù)性緩沖液中無機(jī)鹽含量不 高于0. 05M。
7.如權(quán)利要求1所述的復(fù)性方法，其特征在于所述的步驟2)方法是將所選的離子 交換色譜介質(zhì)移入燒結(jié)玻璃漏斗抽濾除去液體后，依次用摩爾濃度為0. 2-2. OM氯化鈉溶 液和去離子水各沖洗3-8次，每次沖洗所用的液體體積為離子交換色譜介質(zhì)沉降體積的 20-30 倍。
8.如權(quán)利要求1所述的復(fù)性方法，其特征在于所述的步驟3)方法是復(fù)性緩沖液中色 譜介質(zhì)的濃度為0. 025-0. 5g/mL ；混合物置于溫度為20_37°C的恒溫水浴中振蕩預(yù)平衡直 至溫度恒定；然后，加入待復(fù)性蛋白質(zhì)溶液，復(fù)性液中蛋白的終濃度為0. 07-4mg/mL ；振蕩 混勻后，放入恒溫水浴中在轉(zhuǎn)速為50-170rpm條件下復(fù)性，復(fù)性溫度與此前復(fù)性液預(yù)平衡 的溫度相同。
9.離子交換色譜介質(zhì)輔助蛋白質(zhì)復(fù)性應(yīng)用，其特征是應(yīng)用于本發(fā)明的離子交換色譜介 質(zhì)輔助蛋白質(zhì)復(fù)性方法，應(yīng)用于復(fù)性過程中易于聚集的蛋白質(zhì)，包括不含二硫鍵的蛋白質(zhì) 和含有二硫鍵的蛋白質(zhì)的復(fù)性。
全文摘要
本發(fā)明涉及離子交換色譜介質(zhì)輔助蛋白質(zhì)復(fù)性的方法及應(yīng)用；1)采用與蛋白質(zhì)帶有同種電荷的離子交換色譜介質(zhì)；2)離子交換色譜介質(zhì)預(yù)處理，用鹽洗沖掉雜質(zhì)離子后，再用去離子水沖掉鹽溶液；3)將色譜介質(zhì)加入復(fù)性液中，然后再將變性蛋白質(zhì)加入復(fù)性緩沖液開始復(fù)性；4)復(fù)性完成后，采用離心或重力沉降方法收集上清液；獲得復(fù)性蛋白溶液。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)第一采用的添加劑是不溶于水的離子交換色譜介質(zhì)，不會污染蛋白質(zhì)；第二采用的添加劑在復(fù)性完成后，易與蛋白質(zhì)分離；第三本發(fā)明介紹的離子交換色譜介質(zhì)復(fù)性方法，不需要色譜柱或色譜系統(tǒng)等昂貴的大型設(shè)備，操作簡單，成本低廉，易于應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號C07K1/18GK101948504SQ20101050736
公開日2011年1月19日 申請日期2010年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月14日
發(fā)明者史清洪, 孫彥, 王國珍, 董曉燕 申請人:天津大學(xué)