本發(fā)明涉及真菌檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別地，涉及一種用于禾草內(nèi)生真菌檢測的無毒染色劑。
背景技術(shù)：
禾草內(nèi)生真菌(grass endophyte)可以在禾草體內(nèi)生存大部分時間或者全部時間都寄生在禾草體內(nèi)，但卻不會引起禾草外部顯示任何病害癥狀(Siegel et al.，1987)。廣泛包括真茵子囊菌門的香柱菌屬(Epichloe)，瘤座菌屬(Balansia)VA菌根菌、真菌半知菌類的一些屬(Clay，1991)，其中研究較多的是與禾本科草類形成一種共生的香柱菌屬及其無性態(tài)Neotyphodium內(nèi)生真菌(黃龍益和黃小龍，2008)
內(nèi)生真菌具有寄主特異性，分離自不同的寄主的內(nèi)生真菌具有不同的特征，這與寄主被真菌侵染的過程有關(guān)(Toti et al.，1992)。檢測禾草內(nèi)生真菌的方法有很多，自上個世紀70年代起，國內(nèi)外對內(nèi)生真菌的檢測方法就在不斷完善，簡化，精確。通過對內(nèi)生真菌進行分離檢測，從形態(tài)學(xué)上鑒定內(nèi)生真菌的形態(tài)從而鑒定屬種，但是相對來說比較費時，檢測周期長，因環(huán)境等不可控因素造成的菌種保存程度等也會對菌種的鑒定產(chǎn)生一定的影響。利用組織染色(Bacon et al.，1977)，在顯微境下觀察組織與組織培養(yǎng)物，其快速、直觀，適用于少量樣本的檢測，但是當檢測樣本組織內(nèi)的內(nèi)生真菌含量少時，依靠染色鏡檢則很難檢測出來。除此之外還有熒光蛋白染色法(GFP)，掃描、透射電子顯微法等其他顯微鏡檢測方法(Christensen et al.，1997)，相比光鏡下檢測染色組織過程更復(fù)雜也更細致，但是成本相對來說偏高。適用于大量樣本的檢測方法有免疫印跡法(immunoblot)(Gwinn et al，1991)，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)(Musgrave，1984)等，通過利用免疫學(xué)上的特點，利用內(nèi)生真菌特異性來鑒定不同的禾草內(nèi)生真菌種類，但這要求檢測的樣品質(zhì)量很高，如果控制不當，植物蛋白就會與抗體反應(yīng)從而影響到結(jié)果。目前，顯微觀察法仍然是最常用的檢測方法，該檢測方法簡敘如下：
一、染色劑配方(聶立影，2004；張盼盼，2010；李春杰，2008)：
1號溶液：5％NaOH和1％苯胺藍混合溶液
2號溶液：100mL乳酸，l00mL甘油，l00mL苯酚，800mg苯胺蘭，500mL蒸餾水
二、內(nèi)生真菌檢測方法
種子中內(nèi)生真菌的檢測：取200粒種子放入50mL燒杯中，室溫下用1號溶浸泡24h，用自來水沖洗干凈后，去除種子的穎片，再轉(zhuǎn)入裝有2號溶液的試管中，在沸水浴中加熱l0min，保證充分染色，取一粒種子置于一滴蒸餾水的載玻片上，壓片，在40倍體視顯微鏡下鏡檢，觀察細胞間的菌絲情況。
葉鞘中內(nèi)生真菌的檢測：將禾草分蘗剪下，用刀片和鑷子剝?nèi)》痔Y葉鞘基部的內(nèi)表皮組織，置于載玻片上，滴一滴苯胺藍溶液，待充分染色后，在40倍顯微鏡下進行鏡檢，觀察細胞間的菌絲情況。
苯酚，又名石炭酸、羥基苯，是德國化學(xué)家龍格(Runge F)于1834年在煤焦油中發(fā)現(xiàn)的，是最簡單的酚類有機物，一種弱酸。常溫下為一種無色晶體，有毒。
1)健康危害：苯酚對皮膚、粘膜有強烈的腐蝕作用，可抑制中樞神經(jīng)或損害肝、腎功能。急性中毒：吸入高濃度蒸氣可致頭痛、頭暈、乏力、視物模糊、肺水腫等。誤服引起消化道灼傷，出現(xiàn)燒灼痛，呼出氣帶酚味，嘔吐物或大便可帶血液，有胃腸穿孔的可能，可出現(xiàn)休克、肺水腫、肝或腎損害，出現(xiàn)急性腎功能衰竭，可死于呼吸衰竭。眼接觸可致灼傷?？山?jīng)灼傷皮膚吸收經(jīng)一定潛伏期后引起急性腎功能衰竭。慢性中毒：可引起頭痛、頭暈、咳嗽、食欲減退、惡心、嘔吐，嚴重者引起蛋白尿?？芍缕ぱ住Ｈ丝诜滤懒繄蟮啦灰?LD為2～15g,或MLD為140mg/kg,14g/kg。國外報道酚液污染皮膚面積為25％,10分鐘死亡,血酚為0.74mmlo/L。
2)環(huán)境危害：對環(huán)境有嚴重危害，對水體和大氣均可造成污染。
3)燃爆危險：該品可燃，高毒，具強腐蝕性。
該檢測方法中2號溶液中含有苯酚，不利于工作人員身體健康，同時廢液易污染大氣和土壤，故有必要研發(fā)一種新的用于禾草內(nèi)生真菌檢測的無毒染色劑。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明目的在于提供一種用于禾草內(nèi)生真菌檢測的無毒染色劑，以解決技術(shù)問題。
一種用于禾草內(nèi)生真菌檢測的無毒染色劑，包括以下成分：苯胺藍、乳酸和溶劑。
優(yōu)選的，所述的無毒染色劑用于種子內(nèi)生真菌檢測時，溶劑為水。
優(yōu)選的，所述的無毒染色劑用于種子內(nèi)生真菌檢測時，包括以下成分：0.325g苯胺藍，100ml水，50ml 85％的乳酸。
優(yōu)選的，所述的無毒染色劑用于葉鞘內(nèi)生真菌檢測或莖髓內(nèi)生真菌檢測時，溶劑為丙三醇和水的混合物。
優(yōu)選的，所述的無毒染色劑用于葉鞘內(nèi)生真菌檢測或莖髓內(nèi)生真菌檢測時，包括以下成分：1份乳酸，2份丙三醇，1份蒸餾水，質(zhì)量分數(shù)為0.05％的苯胺藍。
所述的用于禾草內(nèi)生真菌檢測的無毒染色劑用于種子內(nèi)生真菌檢測法，包括以下步驟：
將100粒種子放入20ml燒杯中，倒入5％的氫氧化鈉溶液浸泡過夜，自來水沖洗掉堿液，加入染色劑，加熱至沸騰再冷卻，取出一粒種子放在滴有苯胺藍無毒染色劑的載玻片上，蓋上蓋玻片，輕輕按壓種子，在物鏡10倍和40倍下觀察菌絲情況。
所述的用于禾草內(nèi)生真菌檢測的無毒染色劑用于葉鞘內(nèi)生真菌檢測法，包括以下步驟：將帶有內(nèi)生真菌的禾草種子播種于營養(yǎng)土中，取6周齡的幼苗進行帶菌率檢測，用鑷子和解剖刀撕取葉鞘部分內(nèi)表皮，放于載玻片上加染色劑進行染色，蓋上蓋玻片，并在酒精燈火焰上加熱5-8秒，靜置片刻后在顯微鏡下觀察內(nèi)生真菌菌絲。
所述的用于禾草內(nèi)生真菌檢測的無毒染色劑用于莖髓內(nèi)生真菌檢測法，包括以下步驟：用解剖刀將禾草成株莖稈縱向剖開，刀尖刮取莖桿髓質(zhì)放于載玻片上，用染色劑進行染色，蓋上蓋玻片，并在酒精燈火焰上加熱5-8秒，靜置片刻后在顯微鏡下觀察內(nèi)生真菌菌絲。
本發(fā)明的染色劑中不需要添加苯酚，在染色過程中僅需要將玻片在酒精燈火焰上加熱數(shù)秒即可；同時染色效果好，原技術(shù)容易將細胞壁染色，影響觀察，而本發(fā)明的染色劑只能將內(nèi)生真菌的菌絲染色，不會對細胞壁染色，便于區(qū)別內(nèi)生真菌菌絲和細胞壁。
本發(fā)明具有以下有益效果：本發(fā)明的用于禾草內(nèi)生真菌檢測的無毒染色劑，包括以下成分：苯胺藍、乳酸和溶劑，該無毒染色劑不含對人體和環(huán)境有危害的苯酚，同時還通過在染色過程中將玻片在酒精燈火焰上簡單加熱，提高了染色效果，便于區(qū)別內(nèi)生真菌菌絲和細胞壁。
除了上面所描述的目的、特征和優(yōu)點之外，本發(fā)明還有其它的目的、特征和優(yōu)點。下面將對本發(fā)明作進一步詳細的說明。
具體實施方式
以下對本發(fā)明的實施例進行詳細說明，但是本發(fā)明可以根據(jù)權(quán)利要求限定和覆蓋的多種不同方式實施。
實施例1
一種用于禾草內(nèi)生真菌檢測的無毒染色劑，包括以下成分：0.325g苯胺藍，100ml水，50ml 85％的乳酸；
所述的用于禾草內(nèi)生真菌檢測的無毒染色劑用于種子內(nèi)生真菌檢測法，包括以下步驟：
將100粒種子放入20ml燒杯中，倒入5％的氫氧化鈉溶液浸泡過夜，自來水沖洗掉堿液，加入染色劑，加熱至沸騰再冷卻室溫，取出一粒種子放在滴有苯胺藍無毒染色劑的載玻片上，蓋上蓋玻片，輕輕按壓種子，在物鏡10倍和40倍下觀察菌絲情況。
實施例2
一種用于禾草內(nèi)生真菌檢測的無毒染色劑，包括以下成分：1份乳酸，2份丙三醇，1份蒸餾水，質(zhì)量分數(shù)為0.05％的苯胺藍。
所述的用于禾草內(nèi)生真菌檢測的無毒染色劑用于葉鞘內(nèi)生真菌檢測法，包括以下步驟：將帶有內(nèi)生真菌的禾草種子播種于營養(yǎng)土中，取6周齡的幼苗進行帶菌率檢測，用鑷子和解剖刀撕取葉鞘部分內(nèi)表皮，放于載玻片上加染色劑進行染色，蓋上蓋玻片，并在酒精燈火焰上加熱7秒，靜置片刻后在顯微鏡下觀察內(nèi)生真菌菌絲。
實施例3
一種用于禾草內(nèi)生真菌檢測的無毒染色劑，包括以下成分：1份乳酸，2份丙三醇，1份蒸餾水，質(zhì)量分數(shù)為0.05％的苯胺藍。
所述的用于禾草內(nèi)生真菌檢測的無毒染色劑用于莖髓內(nèi)生真菌檢測法，包括以下步驟：用解剖刀將禾草成株莖稈縱向剖開，刀尖刮取莖桿髓質(zhì)放于載玻片上，用染色劑進行染色，蓋上蓋玻片，并在酒精燈火焰上加熱6秒，靜置片刻后在顯微鏡下觀察內(nèi)生真菌菌絲。
以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。