專利名稱：一種用光子晶體微球流式芯片檢測真菌毒素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及農(nóng)產(chǎn)品、飼料和食品中的真菌毒素快速、高通量、低成本檢測技術(shù)方法。具體通過谷物中典型的黃曲霉毒素(AFB1X伏馬毒素(FB1)和桔青霉毒素(CIT)真菌毒素為檢測對象，利用三種光子晶體微球反射峰位置的差異對三種光子晶體微球進行物理編碼，通過競爭免疫方法在光子晶體微球表面構(gòu)建液相芯片檢測新技術(shù)。
背景技術(shù)：
真菌毒素是產(chǎn)毒真菌分泌產(chǎn)生的，能引起人畜各種損害的次生代謝產(chǎn)物。到目前為至，已發(fā)現(xiàn)的真菌毒素高達500多種，并不斷有新的真菌毒素被發(fā)現(xiàn)。其中，對人畜危害大、毒性強和污染頻率高的真菌毒素主要包括黃曲霉毒素B1和M1、展青霉素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素、伏馬毒素、桔霉素和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇等?；谡婢舅氐膰?yán)重危害，世界糧農(nóng)組織和各國都嚴(yán)格制定了農(nóng)產(chǎn)品、飼料和食品的真菌毒素殘留最大允許殘留量。人 們一直努力采取各種預(yù)防措施，防止真菌毒素進入人類食物鏈。其中檢測技術(shù)方法發(fā)揮著越來越重要的作用。一般地，真菌毒素的檢測技術(shù)概括起來大體上分為三類第一類是儀器分析法，包括薄層層析法、紫外、熒光分光光度法、高效液相色譜法、氣相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用、氣質(zhì)聯(lián)用等。第二類是生物學(xué)檢測方法，包括皮膚毒性實驗、致嘔吐實驗、種子發(fā)芽實驗等。第三類是基于免疫化學(xué)反應(yīng)的檢測方法，包括放射性免疫法、酶聯(lián)免疫法(ELISA)、熒光偏振免疫分析、免疫凝聚法和免疫層析法等。這些技術(shù)方法在分析真菌毒素中起到非常重要的作用。然而，隨著科技水平的提高，一些新的有毒有害物質(zhì)不斷被發(fā)現(xiàn)；同時，人們生活水平的不斷提高，食品安全意識不斷增強。這些都要求增加食品中有毒有害成分的檢測種類，降低最大允許含量。另外，目前許多國家基于保護消費者健康或/和制造技術(shù)性貿(mào)易壁壘的目的，規(guī)定(或正在規(guī)定)必須同時檢測農(nóng)產(chǎn)品、食品和飼料中常見的多種真菌毒素。我國國家標(biāo)準(zhǔn)中也規(guī)定了農(nóng)產(chǎn)品、食品和飼料中的黃曲霉毒素BI、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、伏馬毒素、赭曲霉毒素和桔青霉素的限量標(biāo)準(zhǔn)，其它更多真菌毒素的限量正在制定中。由于農(nóng)產(chǎn)品樣品及其污染源的多樣性，對農(nóng)產(chǎn)品及其制品的真菌毒素檢測帶來了巨大考驗，尤其是對于大批量的樣品檢測，僅靠常規(guī)的上述檢測方法已不能滿足現(xiàn)場、快速、靈敏、穩(wěn)定且低成本的需要。基于這些要求，研究和開發(fā)對儀器設(shè)備要求簡單，試劑使用量少，對操作人員要求低，分析方法簡便，成本低廉，準(zhǔn)確、快速的真菌毒素多元檢測技術(shù)和方法具有重要的現(xiàn)實意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于開發(fā)一種高靈敏度、高通量、成本低、檢測時間快、特異性好的同時檢測食品中多種真菌毒素新技術(shù)，以替代傳統(tǒng)色譜技術(shù)或酶聯(lián)免疫法(ELISA)真菌毒素檢測的方法。本發(fā)明的原理如圖I所示，在同一體系中，分別在粒徑大小相同，反射光譜位置不同的光子晶體微球表面用雙氧水濃硫酸溶液進行羥基化修飾，用Y-縮水甘油氧丙基三甲氧基硅烷(GPTMS)環(huán)氧基修飾，固定不同真菌毒素包被抗原，牛血清蛋白(BSA)封閉。包被的抗原與真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品或試樣中真菌毒素競爭結(jié)合異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的各真菌毒素抗體。用熒光共聚焦掃描儀拾取各微球的熒光信號，用微球的反射光譜或其結(jié)構(gòu)色識別不同的真菌毒素探針。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測食品中的真菌毒素。本發(fā)明所述用光子晶體微球流式芯片檢測真菌毒素的方法，是采用光子晶體微球為真菌毒素探針載體，在微球表面進行直接競爭免疫檢測多個真菌毒素，以黃曲霉毒素(AFB1X伏馬毒素(FB1)和桔青霉毒素(CIT)為檢測對象,通過異硫氰酸突光素(FITC)標(biāo)記抗體與微球表面固定抗原競爭各自的抗原，利用共聚焦熒光掃描儀和光子晶體的反射光譜進行解碼，對三種真菌毒素同時檢測。
上述方法包括以下步驟( I)光子晶體微球的制備(2)光子晶體微球表面的修飾通過體積比3 7的雙氧水與濃硫酸對步驟(I)得到的微球表面進行羥基化修飾，再用Y-縮水甘油氧丙基三甲氧基硅烷(GPTMS)對微球表面進行環(huán)氧基修飾；(3)抗體標(biāo)記通過化學(xué)鍵合方法將黃曲霉毒素(AFB1X伏馬毒素(FB1)和桔青霉毒素(CIT)人工抗原固定于經(jīng)步驟(2)表面修飾的微球表面；(4)用光子晶體微球流式芯片對待測樣品進行競爭免疫檢測；利用共聚焦熒光掃描儀和光子晶體的反射光譜進行解碼。光子晶體微球的制備首先將甲基硅油倒入培養(yǎng)皿中，175°C加熱lOmin，然后冷卻至室溫備用。內(nèi)裝二氧化硅單分散乳液的I號注射器和內(nèi)裝甲基硅油的2號注射器中的液體通過三通管連接，利用兩蠕動泵分別將甲基硅油和二氧化硅單分散乳液混合包裹進入已經(jīng)處理好的盛有甲基硅油培養(yǎng)皿，在界面力的作用下二氧化硅單分散乳液會形成球狀結(jié)構(gòu)。以不同納米二氧化硅顆粒自組裝技術(shù)制備上述的粒徑相同的光子晶體微球。各微球具有不同的光反射光譜。將制備好的微球放入70°C烘箱中加熱9h，其中的水分完全蒸發(fā)的同時也會使納米微球進一步組裝。微球成型后，使用正己烷多次清洗小球，每次沖洗前先浸泡lOmin，接著用無水乙醇沖洗3次，然后再放入馬弗爐中進行煅燒，升溫(2°C /min)至300°C后恒溫3h，降溫(I. 5°C /min)。光子晶體微球表面的修飾修飾羥基把IOml (30%雙氧水和70%濃硫酸)加入到放置有光子晶體微球的燒杯中，室溫下過夜，然后用雙蒸水多次洗滌后置于氮氣流下吹干。處理后微球表面的有機物質(zhì)等雜質(zhì)被清除干凈，同時二氧化硅表面的硅羥基水解生成生成更多的羥基(-0H)。修飾環(huán)氧基把上述處理過的微球浸入含1% (V/V) Y -縮水甘油氧丙基三甲氧基硅烷(GPTMS)的甲苯溶液中反應(yīng)過夜，待偶合反應(yīng)結(jié)束后，移去上述反應(yīng)液，然后分別用甲苯和無水乙醇洗滌微球至少三次以去除微球表面物理吸附的Y-縮水甘油氧丙基三甲氧基硅烷(GPTMS)，氮氣流下吹干，然后在110°C下烘干45-60mins。修飾后的二氧化硅微球用于下一步的生物檢測?？贵w的標(biāo)記
抗體的標(biāo)記采用Sigma公司的異硫氰酸熒光素(FITC)試劑盒進行。谷物試樣的處理玉米、小麥和花生通過高速粉碎機粉碎為粒度小于1mm，稱取5克各自試樣于IOOml的容量瓶中。以甲醇為溶劑準(zhǔn)備不同濃度梯度真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品，充分混合試樣。這些試樣放入通風(fēng)櫥內(nèi)過夜，蒸發(fā)完溶劑。加入的標(biāo)準(zhǔn)品通過6ml三氯甲烷提取。振蕩Ih后，用whatman過濾紙過濾。收集濾液并放入干燥箱中65°C下蒸發(fā)溶劑。提取的毒素試樣溶解于2mL，O. 01M, pH7. 4PBS緩沖液中。同時，按照上述方法提取沒有加入標(biāo)準(zhǔn)品的對照試樣。競爭免疫檢測將修飾后的微球置于反應(yīng)管中(每管五個),然后分別加入10 μ L濃度為240,250和260ng/mL的黃曲霉毒素-牛血清蛋白連接物(AFB1-BSA),伏馬毒素-牛血清蛋白連接物(FB1-BSA)和桔青霉毒素-卵清蛋白連接物(CIT-OVA)的三種不同微球的PBS (O. 01M, PH7. 4)緩沖液，37°C水浴中反應(yīng)lh。PBST多次洗滌后，用20 μ L含有1%BSA的PBS緩沖液對微球上面未和抗原結(jié)合的活性基團進行封閉，接著再用PBST緩沖溶液進行洗滌。在每個反應(yīng)管中分別加入10 μ L不同濃度梯度的各自真菌毒素的標(biāo)準(zhǔn)溶液(標(biāo)準(zhǔn)曲線)或提取的谷物試樣，緊接著再加入10 μ L異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記過的濃度分別為I. 65，O. 95和I. 40μ g/mL各自毒素單克隆抗體，37°C水浴中反應(yīng)lh，用PBST多次洗滌微球，然后將微球置于清洗干凈的載玻片上進行固定，待載玻片上面的液體基本揮發(fā)完后放入芯片掃描儀進行分析，測其熒光強度。用光反射光譜儀分辨不同的微球。各真菌毒素的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2.。本發(fā)明采用StOber法合成了單分散性的納米二氧化硅顆粒，通過納米二氧化硅顆粒自組裝技術(shù)，制備了結(jié)構(gòu)和粒徑均一的光子晶體微球。選擇了三種光子晶體微球作為光編碼載體。將光子晶體微球放在蒸餾水中用超聲波清洗后將其浸入食人魚洗液(30%雙氧水和70%濃硫酸)進行清洗，使其表面發(fā)生水解以產(chǎn)生更多的羥基，然后再用1%γ-縮水甘油氧丙基三甲氧基硅烷(GPTMS)的甲苯溶液浸泡光子晶體微球，在其表面修飾環(huán)氧基。通過優(yōu)化固定黃曲霉毒素抗原、伏馬毒素抗原以及桔青霉毒素抗原包被濃度，各自抗體濃度，微球表面修飾溫度，確定了最佳包被濃度分別為240ng/mL、250ng/mL、260ng/mL,各自抗體反應(yīng)濃度為1.65，0.95和1.4“/1^。光子晶體微球在110°C下與Y _ (2，3-環(huán)氧丙氧基)丙基三甲氧基硅烷反應(yīng)45-60mins，可以使微球表面形成的末端修飾更多，更穩(wěn)定的環(huán)氧基團，提高真菌毒素的檢測靈敏度和檢測線性范圍。不同溫度對檢測信號的影響見圖3。利用三種光子晶體微球最大反射峰位置的差異對三種光子晶體微球進行物理編碼，然后再分別包被不同的偶聯(lián)抗原，通過異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記抗體與微球表面固定抗原競爭各自的標(biāo)準(zhǔn)品，利用共聚焦熒光掃描儀和光子晶體的反射光譜進行解碼，構(gòu)建農(nóng)產(chǎn)品中三種真菌毒素同時檢測的液相芯片檢測技術(shù)。建立三種毒素線性檢測范圍在O. 1-0. 001ng/ml之間；對三種毒素在玉米、小麥和花生中的回收率在74. 7% 127. 9%之間；各微球載體之間無干擾，具有良好的特異性。特異性見圖4。本發(fā)明中通過提高Y-縮水甘油氧丙基三甲氧基硅烷(GPTMS)修飾溫度，可以提高近3倍的檢測熒光信號，擴大檢測線性范圍。這一技術(shù)對三種真菌毒素的檢測靈敏度達到了 pg/ml，檢測線性范圍到3-4個數(shù)量級，各個毒素檢測分別在各自微球表面進行不存在互相干擾問題，具有很好的檢測特異性。而且，檢測樣品試劑僅僅需要10 μ L，節(jié)省了試劑和樣品，檢測時間小于3小時。該技術(shù)可以高通量、快速、靈敏、穩(wěn)定地檢測樣本，成本低廉。


圖I為光子晶體微球流式芯片檢測真菌毒素原理圖；圖2三種真菌毒素同時檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖3環(huán)氧基修飾溫度對檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線的影響；圖4三種真菌毒素同時檢測的特異性。
具體實施例方式本發(fā)明所用真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品黃曲霉毒素(AFB1),伏馬毒素(FB1),和桔青霉毒素(CIT)，黃曲霉毒素-牛血清蛋白連接物(AFB1-BSA)，吐溫-20，Y -縮水甘油氧丙基三甲氧基硅烷(GPTMS )，牛血清白蛋白(BSA)，交聯(lián)葡聚糖G-25M和異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記試 劑盒購于Sigma-Aldrich。四氧乙基娃燒(TEOS)購于AlfaAesar公司。鼠單克隆抗黃曲霉毒素(AFB1)抗體，鼠單克隆抗伏馬毒素(FB1)抗體和伏馬毒素-牛血清蛋白連接物(FB1-BSA)購于Abcam(UK)公司。兔單克隆抗桔青霉毒素(CIT)抗體和桔青霉毒素-卵清蛋白連接物(CIT-OVA)由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)陳福生教授惠贈。甲基硅油購于宇諾公司。氨水、無水乙醇購于南京化學(xué)試劑公司。谷物包括玉米、小麥和花生購于南京金潤發(fā)超市。本發(fā)明所用的儀器主要有AM-3250B型磁力攪拌器廣州北銳精密儀器有限公司DHG-9140型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海精宏實驗設(shè)備有限公司BX51型偏光金相顯微鏡、光纖光譜儀OLYMPUSKQ-300B型超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司LSP01-1A型蠕動泵保定蘭格恒流泵有限公司高分辨率掃描電子顯微鏡(JSM-5610LV)日本電子公司，QL-866微型漩渦混合儀海門麒麟醫(yī)用儀器廠SW-CJ-2凈化工作臺蘇州凈化儀器有限公司YXQ-LS-30SII全自動立式高壓滅菌器上海博訊實業(yè)有限公司722型紫外可見分光光度計上海精密科學(xué)儀器有限公司LuxScanlOK激光共聚焦生物芯片掃描儀北京博奧生物有限公司5425R型高速冷凍離心機EffendrofPHS-3C型精密pH計上海雷磁儀器廠二氧化硅納米顆粒的制備采用SWber方法合成。實施例I玉米、小麥和花生通過高速粉碎機粉碎為粒度小于1mm，稱取5克各自試樣于IOOml的容量瓶中。以甲醇為溶劑準(zhǔn)備不同濃度梯度真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品，充分混合試樣。這些試樣放入通風(fēng)櫥內(nèi)過夜，蒸發(fā)完溶劑。加入的標(biāo)準(zhǔn)品通過6ml三氯甲烷提取。振蕩Ih后，用whatman過濾紙過濾。收集濾液并放入干燥箱中65°C下蒸發(fā)溶劑。提取的毒素試樣溶解于2mL，O. 01M, pH7. 4PBS緩沖液中。同時，按照上述方法提取沒有加入標(biāo)準(zhǔn)品的對照試樣。競爭免疫檢測將修飾后的微球置于反應(yīng)管中(每管五個),然后分別加入10 μ L濃度為240,250和260ng/mL的黃曲霉毒素-牛血清蛋白連接物(AFB1-BSA),伏馬毒素-牛血清蛋白連接物(FB1-BSA)和桔青霉毒素-卵清蛋白連接物(CIT-OVA)的三種不同微球的PBS (O. 01M,PH7. 4)緩沖液，37°C水浴中反應(yīng)lh。PBST多次洗滌后，用20 μ L含有1%BSA的PBS緩沖液對微球上面未和抗原結(jié)合的活性基團進行封閉，接著再用PBST緩沖溶液進行洗滌。在每個反應(yīng)管中分別加入10 μ L不同濃度梯度的各自真菌毒素的標(biāo)準(zhǔn)溶液(標(biāo)準(zhǔn)曲線)或提取的谷物試樣，緊接著再加入10 μ L異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記過的濃度分別為I. 65，O. 95，和I. 40μ g/mL各自毒素單克隆抗體，37°C水浴中反應(yīng)lh，用PBST多次洗滌微球，然后將微球置于清洗干凈的載玻片上進行固定，待載玻片上面的液體基本揮發(fā)完后放入芯片掃描儀進行分析，測其熒光強度。用光反射光譜儀分辨不同的微球。檢測結(jié)果見表I :表I
權(quán)利要求
1.一種用光子晶體微球流式芯片檢測真菌毒素的方法，其特征在于，采用光子晶體微球為真菌毒素探針載體，在微球表面進行直接競爭免疫檢測多個真菌毒素，以黃曲霉毒素、伏馬毒素和桔青霉毒素為檢測對象，通過異硫氰酸熒光素標(biāo)記抗體與微球表面固定抗原競爭各自的抗原，利用共聚焦熒光掃描儀和光子晶體的反射光譜進行解碼，對三種真菌毒素同時檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，包括以下步驟 (O光子晶體微球的制備； (2)光子晶體微球表面的修飾通過體積比37的雙氧水與濃硫酸對步驟(I)得到的微球表面進行羥基化修飾，再用Y-縮水甘油氧丙基三甲氧基硅烷對微球表面進行環(huán)氧基修飾； (3)抗體標(biāo)記通過化學(xué)鍵合方法將黃曲霉毒素、伏馬毒素和桔青霉毒素人工抗原固定于經(jīng)步驟(2)表面修飾的微球表面； (4)用光子晶體微球流式芯片對待測樣品進行競爭免疫檢測；利用共聚焦熒光掃描儀和光子晶體的反射光譜進行解碼。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于步驟(2)中Y-縮水甘油氧丙基三甲氧基娃燒微球表面進行環(huán)氧基修飾時，IlCTC下烘干45_60mins。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述黃曲霉毒素、伏馬毒素和桔青霉毒素人工抗原包被濃度分別為240ng/mL、250ng/mL、260ng/mL，各自抗體反應(yīng)濃度為I. 65,0. 95和 I · 4 μ g/mL。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用光子晶體微球流式芯片檢測真菌毒素的方法，該方法采用光子晶體微球為真菌毒素探針載體，在微球表面進行直接競爭免疫檢測多個真菌毒素，以黃曲霉毒素、伏馬毒素和桔青霉毒素為檢測對象，通過異硫氰酸熒光素標(biāo)記抗體與微球表面固定抗原競爭各自的抗原，利用共聚焦熒光掃描儀和光子晶體的反射光譜進行解碼，對三種真菌毒素同時檢測。該方法對黃曲霉毒素、伏馬毒素和桔霉素的檢測限為0.001ng/mL，線性檢測范圍為0.001到10ng/mL之間，僅僅需要10μL試樣，整個分析過程小于3小時。
文檔編號G01N33/577GK102879570SQ20121035957
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月25日
發(fā)明者李建林, 鄧國哲, 徐坤, 孫越, 陳宇 申請人:南京師范大學(xué)