1.基于石蠟切片和苯胺藍(lán)熒光染色法觀察匍匐翦股穎葉片組織胼胝質(zhì)的沉積方法,其特征在于,包括如下步驟:
S1、藥品的配制;
S11、將福爾馬林10ml、乙酸3ml、50%的乙醇87ml、5ml甘油混合均勻,得FAA固定液;
S12、將無水乙醇與二甲苯以1∶1的比例混合配制成1/2二甲苯;
S13、稱取0.1g水溶性苯胺藍(lán)溶解于100ml濃度為0.07mol/L,pH=7的磷酸緩沖液中,得0.1%的苯胺藍(lán)熒光染色劑。
S2、制作石蠟切片;
S21、用鋒利的刀片快速取下寬度約0.8mm的匍匐剪股穎葉片,將葉片切割成長度約5mm左右的小段,放入青霉素小瓶中,加入步驟S11所得的FAA固定液,固定12h;
S22、經(jīng)FAA固定后,依次置換15%、30%、50%、70%、85%的乙醇中進(jìn)行梯度脫水,各脫水20min,于95%乙醇中脫水30mim,無水乙醇中脫水兩次,各20min;然后依次置換1/2二甲苯、二甲苯進(jìn)行透明,于1/2二甲苯中透明1h,二甲苯中透明兩次,每次30min,直至材料完全透明為止;
S23、在裝有所得透明材料的青霉素小瓶中加碎蠟兩次,第一次加入與瓶中二甲苯等量的碎蠟,放入電熱鼓風(fēng)干燥箱中溫度36℃保持1h至所加碎蠟完全融化后,加入瓶中液體一半的碎蠟,放入電熱鼓風(fēng)干燥箱中調(diào)節(jié)溫度至36℃過夜后,調(diào)節(jié)溫度至42℃,置換50%石蠟保持1h后,溫度調(diào)至50℃,置換75%的石蠟保持30min后,調(diào)節(jié)溫度至60℃,依次置換純石蠟A、純石蠟B、純石蠟C各30min,TKY-BMB型石蠟包埋機(jī)進(jìn)行包埋,一個蠟塊中一個材料,蠟塊的尺寸為:0.5cm×0.5cm×0.5cm,將包埋好的蠟塊冷卻后直接修塊,進(jìn)行切片或保存到4℃冰箱備用;
S24、采用輪式手動切片機(jī)進(jìn)行連續(xù)切片,厚度10μm;將HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋溫度調(diào)節(jié)至45℃,在500ml大燒杯加入蒸餾水放入水浴鍋中,將切好的蠟帶光面朝下放入燒杯中,待蠟帶完全展開后,將涂抹好蛋清甘油的載玻片伸入燒杯中,使蠟帶粘到載玻片上,將粘有蠟帶的載玻片自然晾干后,在光學(xué)顯微鏡下觀察展片效果,取展片效果好的片子置于電熱鼓風(fēng)干燥箱中于38℃下烘烤,直到片子完全干燥;
S25、取干燥的片子,依次放到分別加有二甲苯、1/2二甲苯、95%的乙醇、85%的乙醇、70%的乙醇、50%的乙醇、30%的乙醇、磷酸緩沖液、0.1%的苯胺藍(lán)染色劑的立式染缸中;在二甲苯、1/2二甲苯中各5min,95%的乙醇、85%的乙醇、70%的乙醇、50%的乙醇、30%的乙醇中各5S,磷酸緩沖液中10min,0.1%的苯胺藍(lán)染色劑中30min;然后將染色后的片子取出,置于蒸餾水中30S,洗凈片子上的雜質(zhì)后,過1/2二甲苯、二甲苯各10S,待片子干燥后采用中性樹膠封片;
S26、將所得的片子自然風(fēng)干后,置于LeiCaDM6000B熒光顯微鏡下觀察并拍照。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于石蠟切片和苯胺藍(lán)熒光染色法觀察匍匐翦股穎葉片組織胼胝質(zhì)的沉積的方法,其特征在于,所述鋒利的刀片為剃須刀片或單面刀片。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于石蠟切片和苯胺藍(lán)熒光染色法觀察匍匐翦股穎葉片組織胼胝質(zhì)的沉積的方法,其特征在于,所述步驟S4中的磷酸緩沖液的濃度為0.07mol/L,pH=7。