本發(fā)明涉及顯微組織切片和組織化學(xué)成分胼胝質(zhì)的快速檢測(cè)技術(shù)，具體涉及一種基于石蠟切片和苯胺藍(lán)熒光染色法觀察匍匐翦股穎葉片組織胼胝質(zhì)的沉積的方法。

背景技術(shù)：

胼胝質(zhì)是一種具有1，6分支的線性β-1，3葡聚糖，加熱后為加粗變短的膠狀結(jié)構(gòu)。在植物發(fā)育過(guò)程中，在很多地方都可以發(fā)現(xiàn)胼胝質(zhì)，包括細(xì)胞板、花粉、花粉管、種子、葉以及莖、表皮、篩板、胞間連絲、木質(zhì)部形成過(guò)程中的次生壁等。胼胝質(zhì)具有迅速聚合和解聚的物理和生理特性。此外，作為應(yīng)激反應(yīng)的一部分，在植物受傷、遭受病原菌感染或受到各種脅迫時(shí)快速而大量地合成，來(lái)應(yīng)答外界的機(jī)械損傷、各種病原菌入侵引起的生物脅迫，以及物理、化學(xué)、環(huán)境因子等引起的生物脅迫等。逆境下，篩管分子內(nèi)會(huì)迅速合成胼胝質(zhì)并沉積到篩板的表面或篩孔內(nèi)堵塞，一旦外界刺激解除，沉積到篩板表面或篩孔內(nèi)的胼胝質(zhì)則會(huì)迅速消失，使篩管恢復(fù)正常的運(yùn)輸功能。因此，胼胝質(zhì)在植物的生命活動(dòng)中起重要調(diào)節(jié)作用。

匍匐剪股穎是多年生草本植物，主要用于草坪草、高爾夫球場(chǎng)、足球場(chǎng)等地方，但是在生長(zhǎng)過(guò)程中面對(duì)多種病害的威脅，對(duì)于銀元斑病、褐斑病、蠕孢菌病害、棉腐病、灰雪霉病、粉紅雪霉病都感染。當(dāng)植物遭受病原菌侵染時(shí)，胼胝質(zhì)能快速積累在某些細(xì)胞間的通道上，將病原菌限制在某一區(qū)域，阻止其進(jìn)一步擴(kuò)展。而作為應(yīng)對(duì)，病原物也能通過(guò)蛋白互作募集寄主的胼胝質(zhì)降解酶將阻礙運(yùn)動(dòng)的胼胝質(zhì)降解掉，恢復(fù)其運(yùn)動(dòng)能力。因此，監(jiān)測(cè)匍匐剪股穎染病情況下維管束中的胼胝質(zhì)的合成及其含量是衡量匍匐剪股穎染病狀況以及篩選出具有較強(qiáng)抗病性植株的關(guān)鍵指標(biāo)。目前，對(duì)于匍匐剪股穎葉片組織中胼胝質(zhì)的研究相關(guān)的報(bào)道在國(guó)內(nèi)尚無(wú)相關(guān)文獻(xiàn)。

石蠟切片是組織學(xué)常規(guī)制片技術(shù)中經(jīng)典、應(yīng)用最為廣泛的方法。但是常規(guī)的石蠟切片方法耗時(shí)長(zhǎng)，從取材固定到封片制成永久片標(biāo)本至少需要連續(xù)一周的時(shí)間，并在實(shí)際應(yīng)用中受到諸多因素的限制，而且在制片過(guò)程中涉及到一些對(duì)人體有害藥品的使用，長(zhǎng)時(shí)間實(shí)驗(yàn)會(huì)危害實(shí)驗(yàn)人員的身體健康以及造成環(huán)境污染。最重要的是因其實(shí)驗(yàn)周期過(guò)長(zhǎng)不能及時(shí)的檢測(cè)匍匐剪股穎的生長(zhǎng)狀況并對(duì)病害情況及時(shí)的采取補(bǔ)救措施。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種基于石蠟切片和苯胺藍(lán)熒光染色法觀察匍匐翦股穎葉片組織胼胝質(zhì)的沉積的方法，首次利用石蠟切片和苯胺藍(lán)熒光染色法觀察匍匐翦股穎葉片組織胼胝質(zhì)的沉積，石蠟制片全程耗時(shí)2天，極大的縮了短匍匐剪股穎石蠟制片的實(shí)驗(yàn)時(shí)間，突破了材料本身、環(huán)境因素所帶來(lái)的限制，可快速高效的完成石蠟制片過(guò)程。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：

基于石蠟切片和苯胺藍(lán)熒光染色法觀察匍匐翦股穎葉片組織胼胝質(zhì)的沉積的方法，包括如下步驟：

S1、進(jìn)行藥品的配制；

S11、將福爾馬林10ml、乙酸3ml、50％的乙醇87ml、5ml甘油混合均勻，得FAA固定液；

S12、將無(wú)水乙醇與二甲苯以1：1的比例混合配制成1/2二甲苯；

S13、稱(chēng)取0.1g水溶性苯胺藍(lán)溶解于100ml濃度為0.07mol/L，pH＝7的磷酸緩沖液中，得0.1％的苯胺藍(lán)熒光染色劑。

S2、制作石蠟切片；

S21、用鋒利的刀片快速取下寬度約0.8mm的匍匐剪股穎葉片，將葉片切割成長(zhǎng)度約5mm左右小段，放入青霉素小瓶中，加入步驟S11所得的FAA固定液，固定12h；

S22、經(jīng)FAA固定后，依次置換15％、30％、50％、70％、85％乙醇中進(jìn)行梯度脫水，各脫水20min，于95％乙醇中脫水30mim，無(wú)水乙醇中脫水兩次，各20min；然后依次置換1/2二甲苯、二甲苯進(jìn)行透明，于1/2二甲苯中透明1h，二甲苯中透明兩次，每次30min，至材料完全透明為止；

S23、在裝有所得透明材料的青霉素小瓶中加碎蠟兩次，第一次加入與瓶中二甲苯等量的碎蠟，放入電熱鼓風(fēng)干燥箱中溫度36℃保持1h至所加碎蠟完全融化后，加入瓶中液體一半的碎蠟，放入電熱鼓風(fēng)干燥箱中調(diào)節(jié)溫度至36℃過(guò)夜后，調(diào)節(jié)溫度至42℃，置換50％石蠟保持1h后，溫度調(diào)至50℃，置換75％的石蠟保持30min后，調(diào)節(jié)溫度至60℃，依次置換純石蠟A、純石蠟B、純石蠟C各30min，然后采用TKY-BMB型石蠟包埋機(jī)進(jìn)行包埋，一個(gè)蠟塊中一個(gè)材料，蠟塊的尺寸為：0.5cm×0.5cm×0.5cm，將包埋好的蠟塊冷卻后直接修塊，進(jìn)行切片或保存到4℃冰箱備用；

S24、采用輪式手動(dòng)切片機(jī)進(jìn)行連續(xù)切片，厚度10μm；將HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋溫度調(diào)節(jié)至45℃，在500ml大燒杯加入蒸餾水放入水浴鍋中，將切好的蠟帶放入燒杯中，待蠟帶完全展開(kāi)后，將涂抹好蛋清甘油的載玻片伸入燒杯中，使蠟帶粘到載玻片上，將粘有蠟帶的載玻片自然晾干后，在光學(xué)顯微鏡下觀察展片效果，取展片效果好的片子置于電熱鼓風(fēng)干燥箱中于38℃下烘烤，直到片子完全干燥；

S25、取干燥的片子，依次放到分別加有二甲苯、1/2二甲苯、95％的乙醇、85％的乙醇、70％的乙醇、50％的乙醇、30％的乙醇、磷酸緩沖液、0.1％的苯胺藍(lán)染色劑的立式染缸中；在二甲苯、1/2二甲苯中各5min，95％的乙醇、85％的乙醇、70％的乙醇、50％的乙醇、30％的乙醇中各5S，磷酸緩沖液中10min，0.1％的苯胺藍(lán)染色劑中30min；然后將染色后的片子取出，置于蒸餾水中30S，洗凈片子上的雜質(zhì)后，過(guò)1/2二甲苯、二甲苯各10S，待片子干燥后采用中性樹(shù)膠封片；

S26、將所得的片子自然風(fēng)干后，置于LeiCaDM6000B熒光顯微鏡下觀察并拍照。

其中，所述鋒利的刀片為剃須刀片或單面刀片。

其中，所述步驟S4中的磷酸緩沖液的濃度為0.07mol/L，pH＝7。

本發(fā)明具有以下有益效果：

首次利用石蠟切片和苯胺藍(lán)熒光染色法觀察匍匐翦股穎葉片組織胼胝質(zhì)的沉積，同時(shí)極大的縮了短匍匐剪股穎石蠟制片的實(shí)驗(yàn)時(shí)間，突破了材料本身、環(huán)境因素所帶來(lái)的限制，可快速高效的完成石蠟制片過(guò)程，且染色效果好，染色結(jié)果較穩(wěn)定。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

本發(fā)明實(shí)施例提供了基于石蠟切片和苯胺藍(lán)熒光染色法觀察匍匐翦股穎葉片組織胼胝質(zhì)的沉積的方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1、進(jìn)行藥品的配制；

S11、將福爾馬林10ml、乙酸3ml、50％的乙醇87ml、甘油5ml混合均勻，得FAA固定液；

S12、將無(wú)水乙醇與二甲苯以1∶1的比例混合配制成1/2二甲苯；

S13、稱(chēng)取0.1g水溶性苯胺藍(lán)溶解于100ml濃度為0.07mol/L，pH＝7的磷酸緩沖液中，得0.1％的苯胺藍(lán)熒光染色劑。

S2、制作石蠟切片；

S21、用鋒利的刀片快速取下直徑約0.8mm的匍匐剪股穎葉片，，將葉片切割成長(zhǎng)度約5mm左右的小段，放入青霉素小瓶中，加入步驟S11所得的FAA固定液，固定12h；

S22、經(jīng)FAA固定后，依次置換15％、30％、50％、70％、85％、95％、100％的乙醇中進(jìn)行梯度脫水，各脫水20min，于95％乙醇中脫水30mim，無(wú)水乙醇中脫水兩次，各30min；然后依次置換1/2二甲苯、二甲苯進(jìn)行透明，于1/2二甲苯中透明兩次，每次1h，二甲苯中透明1h，至材料完全透明為止；

S23、在裝有所得透明材料的青霉素小瓶中加碎蠟兩次，第一次加入與瓶中二甲苯等量的碎蠟，放入電熱鼓風(fēng)干燥箱中溫度36℃保持1h至所加碎蠟完全融化后，加入瓶中液體一半的碎蠟，放入電熱鼓風(fēng)干燥箱中調(diào)節(jié)溫度至36℃過(guò)夜后，調(diào)節(jié)溫度至42℃，置換50％石蠟保持1h后，溫度調(diào)至50℃，置換75％的石蠟保持30min后，調(diào)節(jié)溫度至60℃，依次置換純石蠟A、純石蠟B、純石蠟C各30min，然后采用TKY-BMB型石蠟包埋機(jī)進(jìn)行包埋，一個(gè)蠟塊中一個(gè)材料，蠟塊的尺寸為：0.5cm×0.5cm×0.5cm，將包埋好的蠟塊冷卻后直接修塊，進(jìn)行切片或保存到4℃冰箱備用；

S24、采用輪式手動(dòng)切片機(jī)(KD-2508浙江省金華市科迪儀器有限公司)進(jìn)行連續(xù)切片，厚度10μm；將HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市順華儀器有限公司)溫度調(diào)節(jié)至45℃(低于石蠟熔點(diǎn)15℃)，在500ml大燒杯加入蒸餾水放入水浴鍋中，將切好的蠟帶放入燒杯中，待蠟帶完全展開(kāi)后，將涂抹好蛋清甘油的載玻片伸入燒杯中，使蠟帶粘到載玻片上，將粘有蠟帶的載玻片自然晾干后，在光學(xué)顯微鏡(Motic B3 Professional Series)下觀察展片效果，取展片效果好的片子置于電熱鼓風(fēng)干燥箱中于36℃下烘烤，直到片子完全干燥；

S25、取干燥的片子，依次放到分別加有二甲苯、1/2二甲苯、95％的乙醇、85％的乙醇、70％的乙醇、50％的乙醇、30％的乙醇、磷酸緩沖液、0.1％的苯胺藍(lán)染色劑的立式染缸中；在二甲苯、1/2二甲苯中各5min，95％的乙醇、85％的乙醇、70％的乙醇、50％的乙醇、30％的乙醇中各5S，磷酸緩沖液中10min，0.1％的苯胺藍(lán)染色劑中30min；然后將染色后的片子取出，置于蒸餾水中30S，洗凈片子上的雜質(zhì)后，過(guò)1/2二甲苯、二甲苯各10S，待片子干燥后采用中性樹(shù)膠封片；

S26、將所得的片子自然風(fēng)干后，置于LeiCaDM6000B熒光顯微鏡下觀察并拍照，在熒光顯微鏡下拍照后，照片中淡黃綠色亮斑即為胼胝質(zhì)。

所述鋒利的刀片為剃須刀片或單面刀片。所述步驟S4中的磷酸緩沖液的濃度為0.07mol/L，pH＝7。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以作出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。