一種紅葉植物防止葉片花色苷流失的石蠟切片方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及植物葉片切片標(biāo)本制作方法，特別涉及一種紅葉植物防止葉片花色苷 流失的石蠟切片方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 顯微觀測(cè)是了解植物內(nèi)部特征的主要途徑，其主要方法是植物制片。常用的植物 制片方法有徒手切片、冰凍切片和石蠟切片。徒手切片法的特點(diǎn)是簡(jiǎn)便快捷，要求設(shè)備簡(jiǎn) 單，不經(jīng)過(guò)化學(xué)藥物的處理，基本上保留了植物組織的自然色澤和活體結(jié)構(gòu)，但切片較厚， 很難切到非常薄的切片。石蠟切片法是用石蠟作為包埋劑的一種顯微制片方法，是顯微技 術(shù)中最重要的方法之一。它的優(yōu)點(diǎn)是能夠切出薄而均勻的連續(xù)切片，便于器官的三維重構(gòu)。 但是步驟繁瑣，耗時(shí)較長(zhǎng)，包含取材、固定、洗滌和脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、展片與粘 片、脫蠟、染色、封片。冰凍切片的特點(diǎn)是簡(jiǎn)便、快速、用時(shí)短，可以不需要對(duì)組織進(jìn)行固定、 脫水、透明、包埋等步驟即可進(jìn)行切片，減少了一些中間環(huán)節(jié)，能很好保存脂肪、類脂、及各 種抗原活性及酶類，特別是對(duì)于那些對(duì)有機(jī)溶劑或熱溫度耐受能力較差的細(xì)胞膜表面抗原 和水解酶保存較好。但是不容易制作較薄的切片，切取的組織不能過(guò)大，組織塊在凍結(jié)過(guò)程 中容易產(chǎn)生冰晶而影響細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)及抗原物質(zhì)的定位，并且組織結(jié)構(gòu)也不如石蠟切片 清晰。
[0003] 紅葉植物是葉片呈現(xiàn)顯著紫紅色的植物統(tǒng)稱，其呈色物質(zhì)主要是花色苷，其易溶 于水、乙醇及丙酮等溶劑。不同紅葉植物呈色組織不同，在研究中常需進(jìn)行顯色組織定位， 進(jìn)而了解其在細(xì)胞內(nèi)生成及運(yùn)輸過(guò)程。而在進(jìn)行切片的過(guò)程中，徒手切片法和冰凍切片法 難以切到足夠薄的切片以觀察到理想的組織結(jié)構(gòu)，而石蠟切片法在固定、脫水等必要環(huán)節(jié) 需使用乙醇和甲醛等溶液，會(huì)造成花色苷流失，無(wú)法進(jìn)行顯色組織定位觀測(cè)。因此，傳統(tǒng)的 制片方法均無(wú)法有效的實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)花色苷形成與積累過(guò)程的動(dòng)態(tài)觀測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 有鑒于此，本發(fā)明在于提供一種避免水、乙醇、丙酮及甲醛等溶劑使用的紅葉植物 防止葉片花色苷流失的石蠟切片方法。
[0005] 本發(fā)明是采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的： 一種紅葉植物防止葉片花色苷流失的石蠟切片方法，包括如下步驟： 第一步、準(zhǔn)備原料：采集富含花色苷的植物新鮮葉片作為材料； 第二步、材料干燥：將采集葉片放置在干燥器中干燥24小時(shí)以上； 第三步、浸蠟：將干燥后的葉片裁成方塊，放入60-70°C的石蠟中，維持0. 1-0. 15個(gè)大 氣壓，處理時(shí)間在6個(gè)小時(shí)以上； 第四步、包埋； 第五步、切片； 第六步、粘片與脫蠟； 第七步、封片。
[0006] 進(jìn)一步，本發(fā)明的一種優(yōu)選方案：所述的第二步中的干燥時(shí)間為24_36h。本發(fā)明 的中的干燥實(shí)在室溫下進(jìn)行的，一般根據(jù)室溫的高低決定干燥時(shí)間。選擇24_36h，是在室溫 25-35Γ做出的最優(yōu)選擇，干燥時(shí)間不長(zhǎng)，可以保證干燥合適，植物葉片脫水合適，最大限度 的保護(hù)植物組織不發(fā)生大的變形。
[0007] 進(jìn)一步，本發(fā)明的一種優(yōu)選方案：所述的第三步、浸蠟：將干燥后的葉片放入65°C 的石蠟中，維持〇. 1個(gè)大氣壓，處理時(shí)間6-8個(gè)小時(shí) 進(jìn)一步，本發(fā)明的一種優(yōu)選方案：所述的第四步、包埋：將浸蠟后的溶解的石蠟倒入 小正長(zhǎng)方體的包埋盒中，再將經(jīng)石蠟浸透的葉片放入盒中，調(diào)整葉片的位置，并迅速放入 8-15 °C冷水中使之快速冷卻。
[0008] 進(jìn)一步，本發(fā)明的一種優(yōu)選方案：所述的第五步、切片：將包埋好的蠟塊經(jīng)分割、 修整、固著，后經(jīng)旋轉(zhuǎn)切片機(jī)切成8~1〇μπι厚的蠟帶。
[0009] 進(jìn)一步，本發(fā)明的一種優(yōu)選方案：所述的第六步、粘片與脫蠟；將分割成小段的蠟 帶放在涂有柴油的載玻片上使蠟片展平，并在葉片位置滴上柴油，3分鐘后使用濾紙吸收， 重復(fù)操作，直至石蠟全部去除。
[0010] 進(jìn)一步，本發(fā)明的一種優(yōu)選方案：所述的第七步、封片：將封藏劑均勻、布滿在葉 片上，然后輕輕蓋上干凈的蓋玻片。
[0011] 本發(fā)明的有益效果是： 1、本發(fā)明在制片的過(guò)程中沒(méi)有使用乙醇、丙酮、甲醛及水等極性溶劑，較好的保存了花 色苷在細(xì)胞中的位置及含量。
[0012] 2、通過(guò)本發(fā)明的實(shí)施，可以切出8~10um的葉片組織切片，有利于進(jìn)行顯微觀測(cè)。
[0013] 3、本發(fā)明簡(jiǎn)化了普通石蠟切片的步驟，降低了實(shí)驗(yàn)人員的工作強(qiáng)度，縮短了實(shí)驗(yàn) 時(shí)間，將切片的整個(gè)過(guò)程由原來(lái)的102小時(shí)縮短至現(xiàn)在的30小時(shí)，工作量不足原來(lái)的1/3。
[0014] 4、本發(fā)明操作方法簡(jiǎn)便、規(guī)范，生產(chǎn)過(guò)程中使用對(duì)人體無(wú)害的有機(jī)溶劑，對(duì)保證實(shí) 驗(yàn)室人員健康有積極意義。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將通過(guò)實(shí)施例對(duì) 本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明的一 些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些 實(shí)施例獲得其他的實(shí)施例。
[0016] 實(shí)施例1 第一步、材料采集：采集'紅葉'杜仲（價(jià)co蕭ia i/hoiofes 'Hongye'）新鮮葉片作為材 料； 第二步、材料干燥：將采集葉片在干燥器中放置24小時(shí)； 第三步、浸蠟：將干燥后的葉片和液態(tài)石蠟放入小錐形瓶中，置于65°C的水浴鍋內(nèi)，使 用真空栗抽維持0. 1個(gè)大氣壓6個(gè)小時(shí)。
[0017] 第四步、包埋：將浸蠟后的溶解的石蠟倒入體積為2cmX2cmX Icm的小正長(zhǎng)方體 的包埋盒中，再將經(jīng)石蠟浸透的葉片放入盒中，調(diào)整葉片的位置，并迅速放入8°C冷水中使 之快速冷卻； 第五步、切片：將包埋好的蠟塊經(jīng)分割、修整、固著，后經(jīng)旋轉(zhuǎn)切片機(jī)切成8~1〇μπι厚的 蠟帶。
[0018] 第六步、粘片與脫蠟：將切下的蠟片放在涂有柴油的載玻片上使蠟片展平，在材料 位置滴上柴油，3分鐘后使用濾紙吸收，重復(fù)操作，直至石蠟全部去除。
[0019] 第七步、封片：將封藏劑均勻地布滿在葉片上，然后輕輕蓋上干凈的蓋玻片。
[0020] 實(shí)施例2 第一步、材料采集：采集紫葉碧桃jOersica L. var. per sica f. atropurpurea Schneid.)新鮮葉片作為材料。
[0021] 第二步、材料干燥：將采集葉片在干燥器中放置36小時(shí)； 第三步、浸蠟：將干燥后的葉片和液態(tài)石蠟放入小錐形瓶中，置于70°C的水浴鍋內(nèi)，使 用真空栗抽維持0. 15個(gè)大氣壓7個(gè)小時(shí)。
[0022] 第四步、包埋：將浸蠟后的溶解的石蠟倒入體積為2cmX2cmX Icm的小正長(zhǎng)方體 的包埋盒中，再將經(jīng)石蠟浸透的葉片放入盒中，調(diào)整葉片的位置，并迅速放入KTC冷水中使 之快速冷卻； 第五步、切片：將包埋好的蠟塊經(jīng)分割、修整、固著，后經(jīng)旋轉(zhuǎn)切片機(jī)切成8~1〇μπι厚的 蠟帶。
[0023] 第六步、粘片與脫蠟：將切下的蠟片放在涂有柴油的載玻片上使蠟片展平，在材料 位置滴上柴油，3分鐘后使用濾紙吸收，重復(fù)操作，直至石蠟全部去除。
[0024] 第七步、封片：將封藏劑均勻地布滿在葉片上，然后輕輕蓋上干凈的蓋玻片。
[0025] 實(shí)施例3 第一步、材料采集：采集紅葉石楠?jiǎng)傉归_(kāi)的紅色葉片作為材料。
[0026] 第二步、材料干燥：將采集葉片在干燥器中放置30小時(shí)； 第三步、浸蠟：將干燥后的葉片和液態(tài)石蠟放入小錐形瓶中，置于60°C的水浴鍋內(nèi)，使 用真空栗抽維持0. 12個(gè)大氣壓8個(gè)小時(shí)。
[0027] 第四步、包埋：將浸蠟后的溶解的石蠟倒入體積為2cmX2cmX Icm的小正長(zhǎng)方體 的包埋盒中，再將經(jīng)石蠟浸透的葉片放入盒中，調(diào)整葉片的位置，并迅速放入15°C冷水中使 之快速冷卻； 第五步、切片：將包埋好的蠟塊經(jīng)分割、修整、固著