一種庫爾勒香梨花絲細(xì)胞立體染色方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物細(xì)胞技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種關(guān)于庫爾勒香梨花絲細(xì)胞立體染色的技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]庫爾勒香梨是薔薇科梨亞科梨屬新疆梨的一種，是新疆巴州地區(qū)和阿克蘇地區(qū)的主栽果樹品種，因香味濃郁、皮薄肉脆、清甜可口、細(xì)嫩多汁、營養(yǎng)豐富而聞名于世，已成為新疆重要的出口創(chuàng)匯果品之一。新疆林果辦2011年數(shù)據(jù)顯示，新疆庫爾勒香梨栽培面積已達(dá)5.10萬hm2，掛果面積約3.64萬hm2，年產(chǎn)量約70萬噸，銷售以國內(nèi)市場為主，產(chǎn)值約20億元。庫爾勒香梨有“果中王子”之稱，具有保護(hù)心臟，減輕疲勞，增強(qiáng)心肌活力，降血壓等多重功效，尤其能祛痰止咳，消熱解暑，滋陰潤肺，深受消費者青睞。庫爾勒香梨果皮表面蠟質(zhì)厚，成熟后微帶紅暈，肉白酥脆，多汁且果香濃郁，耐貯藏，甜度高，皮薄汁多，果點和銹斑少且小，肉質(zhì)細(xì)脆，無公害或綠色產(chǎn)品逐年增多，是庫爾勒香梨國內(nèi)外市場的競爭優(yōu)勢。
[0003]研究發(fā)現(xiàn)，近幾年香梨種植者為了追求高產(chǎn)，在管理過程中授粉樹種搭配不合理，人工授粉時選用花粉種類不當(dāng)，往往導(dǎo)致庫爾勒香梨果實大小不一，果形不規(guī)則，粗皮現(xiàn)象嚴(yán)重，果皮著色不均勻，石細(xì)胞較多，可食用部分較少，果心微酸等現(xiàn)象發(fā)生。庫爾勒香梨出現(xiàn)的上述現(xiàn)象和花粉發(fā)育狀況、花粉質(zhì)感有很重要的關(guān)系，而花絲是花粉發(fā)育過程中營養(yǎng)物質(zhì)、水分、礦質(zhì)元素以及激素等物質(zhì)的重要運輸通道，所以很有必要對花絲的細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，為探明花粉發(fā)育過程奠定基礎(chǔ)，為庫爾勒香梨的繁殖生物學(xué)研究提供基礎(chǔ)方法。
[0004]目前，國內(nèi)科研工作者在研究庫爾勒香梨花絲細(xì)胞結(jié)構(gòu)中所使用的方法主要采用常見的艾氏蘇木精整體染色法，但艾氏蘇木精整體染色法配制溶液較為復(fù)雜，一般需要敞口后熟2個月以上，染色時間不宜把握，而且對纖維素染色較重，不能很好地觀察花絲內(nèi)部各種細(xì)胞的結(jié)構(gòu)。
[0005]目前，關(guān)于操作簡便的庫爾勒香梨花絲細(xì)胞立體染色方法，能使庫爾勒香梨花絲的表皮細(xì)胞、中層細(xì)胞和輸導(dǎo)組織結(jié)構(gòu)清楚著色，各部分細(xì)胞區(qū)分明顯的研究還未見報道。在中國專利公開號CN1280193A、CN103323313A、CN 103033409 A等這些文獻(xiàn)中公開了細(xì)胞或某一種細(xì)胞的染色方法，但是，本領(lǐng)域熟知不同的植物其細(xì)胞結(jié)構(gòu)差異性極大，對于同一植物不同器官的細(xì)胞結(jié)構(gòu)也是具有明顯的差異，現(xiàn)有報道的現(xiàn)有技術(shù)并不適用于庫爾勒香梨花絲細(xì)胞的染色。因此在研究庫爾勒香梨花絲細(xì)胞的立體染色方法時需要經(jīng)過大量的勞動，并且需要付出創(chuàng)造性的勞動才能夠獲得，提供一種操作方法簡單，染色時間易于控制，可適用于大規(guī)模機(jī)械化處理，同時節(jié)約時間和材料的庫爾勒香梨花絲細(xì)胞立體染色方法，具有現(xiàn)實的意義和作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對目前未見操作簡便的庫爾勒香梨花絲細(xì)胞立體染色方法，使庫爾勒香梨花絲的表皮細(xì)胞、中層細(xì)胞和輸導(dǎo)組織結(jié)構(gòu)清楚著色，各部分細(xì)胞區(qū)分明顯的研究的技術(shù)現(xiàn)狀，以及現(xiàn)有常見的艾氏蘇木精整體染色法配制溶液較為復(fù)雜，一般需要敞口后熟2個月以上，染色時間不宜把握，而且對纖維素染色較重，不能很好地觀察花絲內(nèi)部各種細(xì)胞結(jié)構(gòu)的缺點和不足，本發(fā)明旨在于提供一種庫爾勒香梨花絲細(xì)胞立體染色方法，能夠?qū)鞝柪障憷婊ńz細(xì)胞的表皮細(xì)胞、花絲中層細(xì)胞和輸導(dǎo)組織細(xì)胞清楚著色，明顯區(qū)分，有立體染色效果，且操作方法簡單，染色時間易于控制，可適用于大規(guī)模機(jī)械化處理，同時節(jié)約時間和材料，不需要加蓋載玻片即可直接觀察，也可以經(jīng)酒精溶液、二甲苯處理后制作成永久切片，用于研究庫爾勒香梨花絲內(nèi)部結(jié)構(gòu)以及花絲在花粉發(fā)育過程中的作用。
[0007]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
通過在庫爾勒香梨花期時，從樹體上采摘花絲固定在FAA液體中，更換三次FAA液體，并將裝有花絲的固定液保存在4±0.5°C冰箱中，利用浸泡、包埋、修蠟塊等技術(shù)制備獲得樣品切片，通過改進(jìn)的蘇木精染液對樣品切片進(jìn)行染色，使得切片呈現(xiàn)黑色，并利用蒸餾水對切片進(jìn)行洗色和利用氯化鋁溶液對切片進(jìn)行分色，從而制作永久切片，在溫度為380C -420C的烘箱烘烤永久切片12-24h，直至永久切片烘干，用高倍顯微鏡拍照，并觀測庫爾勒香梨花絲的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。其中，改進(jìn)的蘇木精染液為4%蘇木精無水酒精溶液、30%過氧化氫溶液、碘-碘化鉀溶液和10%硫酸鋁鉀溶液按照體積比20:1:15:10進(jìn)行混合，靜置Ih制備而成，并且碘-碘化鉀溶液制備為將30ml蒸餾水加熱，加入Ig碘化鉀，待碘化鉀充分溶解后，再加入Ig碘，靜置一個星期后獲得。通過利用本發(fā)明方法對庫爾勒香梨花絲細(xì)胞進(jìn)行立體染色，并對其染色效果進(jìn)行分析，能夠?qū)鞝柪障憷婊ńz細(xì)胞的表皮細(xì)胞、花絲中層細(xì)胞和輸導(dǎo)組織細(xì)胞清楚著色，明顯區(qū)分，有立體染色效果，且操作方法簡單，染色時間易于控制，可適用于大規(guī)模機(jī)械化處理，同時節(jié)約時間和材料，可見，本發(fā)明方法獲得了顯著的技術(shù)效果。
[0008]具體地，本發(fā)明提供了一種庫爾勒香梨花絲細(xì)胞立體染色方法，具體的染色方法步驟如下:
(I)樣品固定:在庫爾勒香梨花期時，從樹體上采摘花絲固定在FAA液體中，第3天更換一次FAA液體，第7天再更換一次FAA液體，第15天再更換一次FAA液體，并將裝有花絲的固定液保存在4 ± 0.5 °C冰箱中。
[0009]所述的FAA液體為:分別配置60%酒精溶液和40%甲醛溶液，并按照體積比為60%酒精溶液:冰乙酸:40%甲醛溶液=90:5:5，將這三種液體混合，即為制備的FAA液體。
[0010](2)切片處理:取出步驟(I)FAA液體中的樣品，用50%的乙醇浸洗15min，50%的乙醇浸泡1.5h，70%的乙醇浸泡1.5h，80%的乙醇浸泡1.5h，90%的乙醇浸泡1.5h，更換90%的乙醇，再次浸泡1.5h，無水乙醇浸泡lh，更換無水乙醇，再次浸泡lh，無水乙醇和二甲苯混合溶液浸泡2h，二甲苯浸泡50 min，更換二甲苯溶液，再次浸泡50min，二甲苯和石蠟混合溶液在39 0C恒溫箱內(nèi)浸泡12h，在62-63 °C恒溫箱內(nèi)石蠟溶液中浸泡，每6 h換一次干凈的、過濾過的石蠟溶液，一共更換3-5次，包埋，待紙盒內(nèi)蠟液凝固后，自來水浸泡8h，晾干，修蠟塊，用石蠟切片機(jī)將庫爾勒香梨花絲切成12-14um厚，放到干凈的載玻片上，滴水展片，40°C展片臺展片l_2h，至蠟片完全展開，二甲苯脫蠟lOmin，在二甲苯和無水乙醇的混合溶液浸泡5min，95%體積的乙醇浸泡3min，90%的乙醇浸泡3min，80%的乙醇浸泡3min，70%的乙醇浸泡3min，50%的乙醇浸泡3min，30%的乙醇浸泡3min，蒸饋水浸泡lmin。
[0011]所述的無水乙醇和二甲苯混合溶液:按照體積比為無水乙醇:二甲苯溶液=1:1的比例混合后的溶液。
[0012]所述的二甲苯和石蠟混合溶液混合溶液:按照體積比為二甲苯:石蠟溶液=1:1的比例混合后的溶液。
[0013]所述的包埋為:將蠟液中的庫爾勒香梨花絲連同蠟液倒到紙盒中。
[0014](3)染色:利用改良的蘇木精染液對步驟(2)中處理好的切片進(jìn)行染色，染色時間為20-30min，顏色呈現(xiàn)黑色。
[0015]所述的改進(jìn)的蘇木精染液:將4%蘇木精無水酒精溶液、30%過氧化氫溶液、碘-碘化鉀溶液和10%硫酸鋁鉀溶液按照體積比20:1:15:10進(jìn)行混合，靜置lh，即為制備獲得改進(jìn)的蘇木精染液；其中碘-碘化鉀溶液制備為將30ml蒸餾水加熱，加入Ig碘化鉀，待碘化鉀充分溶解后，再加入Ig碘，靜置一個星期后即可制備所得。