本發(fā)明涉及一種用于檢測呋喃唑酮的光電化學(xué)傳感器的制備方法，該傳感器集成了電化學(xué)發(fā)光和光電化學(xué)雙重功能。屬于新型納米功能材料與電化學(xué)生物傳感分析技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：
呋喃唑酮（痢特靈）是一種硝基呋喃類抗生素，為廣譜抗菌藥。作為獸藥使用時(shí)，呋喃唑酮對防治某些原蟲病、水霉病、細(xì)菌性爛鰓、赤皮病、出血病等有良好藥效。在養(yǎng)殖業(yè)中，呋喃唑酮可用于治療畜禽腸道感染，如仔豬黃、白痢。在水產(chǎn)業(yè)中，呋喃唑酮對鮭亞目感染腦粘體蟲有一定療效。但我國農(nóng)業(yè)部將呋喃唑酮列為禁止使用的藥物，不得在動(dòng)物性食品中檢出。FDA也于2002年禁止了硝基呋喃類（包括呋喃唑酮）在動(dòng)物性食品中的使用。目前，檢測呋喃唑酮的方法主要有色譜法、質(zhì)譜法等。此類方法儀器貴重、操作復(fù)雜，化驗(yàn)人員需要專業(yè)培訓(xùn)后才能進(jìn)行檢測。因此，研發(fā)成本低、檢測快、靈敏度高、特異性強(qiáng)的呋喃唑酮傳感器具有重要意義。電化學(xué)生物傳感分析技術(shù)由于操作簡便、檢測速度快等優(yōu)勢，日益得到人們的重視。目前，用于檢測呋喃唑酮的電化學(xué)生物傳感分析技術(shù)按照檢測手段來分主要有電化學(xué)傳感器、電化學(xué)發(fā)光傳感器和光電化學(xué)傳感器三種。其中，電化學(xué)發(fā)光傳感器和光電化學(xué)傳感器相對于電化學(xué)傳感器，具有背景信號噪音少、靈敏度高、檢測成本低等特點(diǎn)，近幾年被越來越多的研究者所關(guān)注。電化學(xué)發(fā)光也稱為電致化學(xué)發(fā)光，是指通過電化學(xué)方法在電極表面產(chǎn)生一些特殊的物質(zhì)，這些物質(zhì)之間或者與體系中其他組分之間通過電子傳遞形成激發(fā)態(tài)，由激發(fā)態(tài)返回到基態(tài)產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象。電化學(xué)發(fā)光傳感器即通過改變電極表面的修飾材料，與分析物產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光，在最優(yōu)條件下，根據(jù)分析物濃度與電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的相關(guān)變化實(shí)現(xiàn)對分析物的定性定量分析。光電化學(xué)傳感器是基于外加光源激發(fā)光電敏感材料導(dǎo)致電子-空穴對進(jìn)行分離，在合適的偏電位條件下，實(shí)現(xiàn)電子在電極、半導(dǎo)體及修飾物和分析物上的快速傳遞，并形成光電流。在最優(yōu)條件下，分析物濃度的變化會(huì)直接影響光電流的大小，可以根據(jù)光電流的變化實(shí)現(xiàn)對分析物的定性定量分析。但是，由于電化學(xué)發(fā)光傳感器需要外置光信號捕捉設(shè)備如光電二極管等，而光電化學(xué)傳感器需要外設(shè)光源來激發(fā)光電敏感材料，這在一定程度上影響了二者操作的便捷性，限制了他們在實(shí)際生產(chǎn)、生活中更為廣泛的應(yīng)用。因此，設(shè)計(jì)、制備更為簡便、快捷的檢測呋喃唑酮的電化學(xué)生物傳感分析技術(shù)具有十分重要的實(shí)用價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種操作簡單、攜帶方便、檢測快、成本低的呋喃唑酮傳感器的制備方法，所制備的傳感器，可用于日常生產(chǎn)、生活等領(lǐng)域的對呋喃唑酮的快速、靈敏檢測?；诖四康?，本發(fā)明在同一電解池中，采用四電極系統(tǒng)，即兩個(gè)工作電極、一個(gè)對電極和一個(gè)參比電極，其中工作電極1采用金納米棒溶膠AuNRs和電聚合魯米諾共同進(jìn)行修飾，作為電化學(xué)發(fā)光工作電極W1，工作電極2采用還原石墨烯負(fù)載二氧化鈦納米片溶膠rGO/TiO2和呋喃唑酮抗體共同進(jìn)行修飾，作為光電化學(xué)工作電極W2。進(jìn)行檢測時(shí)，在電解池中加入固定濃度的過氧化氫后，在W1上施加階躍電壓，由于AuNRs的催化作用，魯米諾與過氧化氫反應(yīng)，產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光，這便相當(dāng)于“開燈”，當(dāng)階躍電壓為0時(shí)，電化學(xué)發(fā)光消失，這便相當(dāng)于“關(guān)燈”，與此同時(shí)在W2上一直施加恒定電壓，由于rGO/TiO2會(huì)因?yàn)殡娀瘜W(xué)發(fā)光產(chǎn)生的發(fā)光激發(fā)導(dǎo)致電子-空穴對進(jìn)行分離，標(biāo)記在呋喃唑酮二抗上的氯化血紅素Hemin催化過氧化氫產(chǎn)生氧氣，使過氧化氫成為空穴“給體”，從而在W2上得到光電流，當(dāng)電致化學(xué)發(fā)光消失，即“關(guān)燈”時(shí)，光電流隨即消失。由于在固定過氧化氫濃度的前提下，光電流大小與Hemin濃度正相關(guān)，當(dāng)被測物中呋喃唑酮濃度越大，當(dāng)與一抗免疫結(jié)合到W2上時(shí)，再免疫結(jié)合標(biāo)記有Hemin的呋喃唑酮二抗的濃度就會(huì)越大，產(chǎn)生的光電流也就越大，因此通過記錄光電流的大小即可實(shí)現(xiàn)對呋喃唑酮的檢測。基于以上發(fā)明原理，本發(fā)明采用的具體技術(shù)方案如下：1.一種雙功能呋喃唑酮光電化學(xué)傳感器的制備方法，其特點(diǎn)在于，制備步驟為：（1）電化學(xué)發(fā)光工作電極W1的制備方法，所述的W1是由AuNRs和電聚合魯米諾共同修飾的ITO導(dǎo)電玻璃，其特點(diǎn)是，具體的制備步驟為：1）以ITO導(dǎo)電玻璃為工作電極，在電極表面滴涂AuNRs，覆蓋面積為1cm×1cm，室溫下晾干；2）將1）得到的工作電極，浸入電解液中，浸入面積為AuNRs所覆蓋的面積，利用三電極系統(tǒng)對工作電極進(jìn)行電化學(xué)沉積，沉積后取出工作電極，使用超純水清洗，4℃下避光干燥，制得電化學(xué)發(fā)光工作電極W1；所述的AuNRs為金納米棒的水溶液，所述金納米棒是棒狀金納米粒子，長度為20~40nm；所述的電解液為含有魯米諾的硫酸溶液，所述的電解液中魯米諾的濃度為1~10mmol/L，硫酸濃度為0.1~1.0mol/L；所述的三電極系統(tǒng)，包括工作電極、參比電極和對電極，所述的參比電極為飽和甘汞電極，所述的對電極為鉑絲電極；所述的電化學(xué)沉積過程，采用的電化學(xué)方法為循環(huán)伏安法，起始電壓為-0.2V，終止電壓為1.5V，掃速為100mv/s，循環(huán)20~30圈；（2）光電化學(xué)工作電極W2的制備方法，所述的W2是由rGO/TiO2和呋喃唑酮抗體共同修飾的ITO導(dǎo)電玻璃，其特點(diǎn)是，具體的制備步驟為：1）以ITO導(dǎo)電玻璃為工作電極，在電極表面滴涂8~12μLrGO/TiO2，室溫下晾干；2）將1）中得到的工作電極放入馬弗爐中，在450℃下進(jìn)行退火處理，處理后冷卻至室溫；3）將2）中得到的工作電極表面滴涂8~12μL呋喃唑酮抗體溶液，4℃下干燥，干燥后用超純水清洗，4℃下干燥，制得光電化學(xué)工作電極W2；所述的rGO/TiO2為還原石墨烯負(fù)載二氧化鈦納米片的水溶液，所述二氧化鈦納米片為方形片狀的二氧化鈦納米粒子，邊長為60~80nm；所述的呋喃唑酮抗體溶液的濃度為300μg/mL；（3）雙功能呋喃唑酮光電化學(xué)傳感器的制備方法：1）將W1和W2導(dǎo)電的一面相對插入電解池中，W1與W2間距為0.5cm~1.5cm；2）以Ag/AgCl為參比電極RE、鉑絲電極為對電極CE，插入電解池中，與W1和W2共同組成四電極系統(tǒng)；3）在電解池中加入10mLpH值為11~13的NaOH溶液和0.2mL濃度為1mmol/L的過氧化氫溶液；4）將1）~3）所制得四電極系統(tǒng)以及電解池置于暗盒中，即制得雙功能呋喃唑酮光電化學(xué)傳感器。2.本發(fā)明所述的雙功能呋喃唑酮光電化學(xué)傳感器的應(yīng)用于呋喃唑酮的檢測，其特點(diǎn)是具體的檢測方法為：（1）在W2上滴加10μL不同濃度的呋喃唑酮標(biāo)準(zhǔn)溶液，孵化30min后，呋喃唑酮與W2上的呋喃唑酮抗體進(jìn)行免疫結(jié)合，沖洗后，再滴加10μL氯化血紅素Hemin標(biāo)記的呋喃唑酮二抗，孵化30min后，Hemin標(biāo)記的呋喃唑酮二抗與呋喃唑酮進(jìn)行免疫結(jié)合，沖洗后，制得待測W2；（2）利用電化學(xué)工作站，在W1上采用階躍電壓的方法對W1施加階躍電壓，初始電壓為0v，階躍電壓為0.7~0.9v，階躍時(shí)間為10~30s；同時(shí)，在待測W2上采用時(shí)間-電流方法對待測W2施加恒定電壓，電壓為0~0.6v；待測W2上的電流會(huì)隨著呋喃唑酮濃度的增大而相應(yīng)增大，根據(jù)所得電流增大值與呋喃唑酮濃度之間的關(guān)系，繪制工作曲線；（3）將待測呋喃唑酮溶液代替呋喃唑酮的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照（1）和（2）所述的呋喃唑酮檢測方法進(jìn)行檢測，根據(jù)所得到的電流增大值與所繪制的工作曲線得出待測呋喃唑酮溶液的濃度；所述的Hemin標(biāo)記的呋喃唑酮二抗的濃度為300μg/mL。本發(fā)明的有益成果（1）本發(fā)明所述的雙功能呋喃唑酮光電化學(xué)傳感器制備簡單，操作方便，無需外部輔助設(shè)備，利用檢測設(shè)備的微型化、便攜化，并實(shí)現(xiàn)了對呋喃唑酮的快速、靈敏、高選擇性檢測，具有廣闊的市場發(fā)展前景；（2）本發(fā)明首次在同一電解池中采用四電極系統(tǒng)檢測呋喃唑酮，并實(shí)現(xiàn)了電致化學(xué)發(fā)光與光電化學(xué)雙功能信號放大策略。在電解池中隨著呋喃唑酮濃度的增加，修飾在W2上的Hemin標(biāo)記的呋喃唑酮二抗就會(huì)增加，也就意味著Hemin對過氧化氫催化的提高。如此一來，一方面，使得電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度線性增加，所激發(fā)的光電流線性增大；另一方面，過氧化氫作為電子給體，使得光電化學(xué)反應(yīng)中光電流線性增大。因此，電化學(xué)發(fā)光和光電化學(xué)兩種方法在同一電解池中、同一電化學(xué)工作站下共同反應(yīng)、相互作用，實(shí)現(xiàn)了對呋喃唑酮檢測電信號的雙重放大，極大地提高了檢測靈敏度和檢出限，同時(shí)由于沒有使用生物酶，從而對檢測環(huán)境要求更為寬松，具有重要的科學(xué)意義和市場應(yīng)用價(jià)值。具體實(shí)施方式實(shí)施例1一種雙功能呋喃唑酮光電化學(xué)傳感器，具體的制備步驟為：（1）電化學(xué)發(fā)光工作電極W1的制備：1）以ITO導(dǎo)電玻璃為工作電極，在電極表面滴涂AuNRs，覆蓋面積為1cm×1cm，室溫下晾干；2）將1）得到的工作電極，浸入電解液中，浸入面積為AuNRs所覆蓋的面積，利用三電極系統(tǒng)對工作電極進(jìn)行電化學(xué)沉積，沉積后取出工作電極，使用超純水清洗，4℃下避光干燥，制得電化學(xué)發(fā)光工作電極W1；所述的AuNRs為金納米棒的水溶液，所述金納米棒是棒狀金納米粒子，長度為20nm；所述的電解液為含有魯米諾的硫酸溶液，所述的電解液中魯米諾的濃度為1mmol/L，硫酸濃度為0.1mol/L；所述的三電極系統(tǒng)，包括工作電極、參比電極和對電極，所述的參比電極為飽和甘汞電極，所述的對電極為鉑絲電極；所述的電化學(xué)沉積過程，采用的電化學(xué)方法為循環(huán)伏安法，起始電壓為-0.2V，終止電壓為1.5V，掃速為100mv/s，循環(huán)20圈。（2）光電化學(xué)工作電極W2的制備：1）以ITO導(dǎo)電玻璃為工作電極，在電極表面滴涂8μLrGO/TiO2，室溫下晾干；2）將1）中得到的工作電極放入馬弗爐中，在450℃下進(jìn)行退火處理，處理后冷卻至室溫；3）將2）中得到的工作電極表面滴涂8μL呋喃唑酮抗體溶液，4℃下干燥，干燥后用超純水清洗，4℃下干燥，制得光電化學(xué)工作電極W2；所述的rGO/TiO2為還原石墨烯負(fù)載二氧化鈦納米片的水溶液，所述二氧化鈦納米片為方形片狀的二氧化鈦納米粒子，邊長為60~80nm；所述的呋喃唑酮抗體溶液的濃度為300μg/mL；（3）雙功能呋喃唑酮光電化學(xué)傳感器的制備方法：1）將（1）中制備的W1和（2）中制備的W2面面相對插入電解池中，W1與W2間距為0.5cm；2）以Ag/AgCl為參比電極RE、鉑絲電極為對電極CE，插入電解池中，與W1和W2共同組成四電極系統(tǒng)；3）在電解池中加入10mLpH值為11的NaOH溶液和0.2mL濃度為1mmol/L的過氧化氫溶液；4）將1）~3）所制得四電極系統(tǒng)以及電解池置于暗盒中，即制得雙功能呋喃唑酮光電化學(xué)傳感器。實(shí)施例2一種雙功能呋喃唑酮光電化學(xué)傳感器，具體的制備步驟為：（1）電化學(xué)發(fā)光工作電極W1的制備：制備步驟同實(shí)施例1中W1的制備步驟，不同之處為金納米棒的長度為30nm，電解液中魯米諾的濃度為5mmol/L，硫酸濃度為0.5mol/L，循環(huán)伏安法進(jìn)行電化學(xué)沉積時(shí)，循環(huán)25圈。（2）光電化學(xué)工作電極W2的制備：1）以ITO導(dǎo)電玻璃為工作電極，在電極表面滴涂10μLrGO/TiO2，室溫下晾干；2）將1）中得到的工作電極放入馬弗爐中，在450℃下進(jìn)行退火處理，處理后冷卻至室溫；3）將2）中得到的工作電極表面滴涂10μL呋喃唑酮抗體溶液，4℃下干燥，干燥后用超純水清洗，4℃下干燥，制得光電化學(xué)工作電極W2；其余同實(shí)施例1中W2的制備步驟。（3）雙功能呋喃唑酮光電化學(xué)傳感器的制備方法：制備步驟同實(shí)施例1，不同之處為W1與W2間距為1.0cm，在電解池中加入的NaOH溶液的pH值為12。實(shí)施例3一種雙功能呋喃唑酮光電化學(xué)傳感器，具體的制備步驟為：（1）電化學(xué)發(fā)光工作電極W1的制備：制備步驟同實(shí)施例1中W1的制備步驟，不同之處為金納米棒的長度為40nm，電解液中魯米諾的濃度為10mmol/L，硫酸濃度為1.0mol/L，循環(huán)伏安法進(jìn)行電化學(xué)沉積時(shí)，循環(huán)30圈。（2）光電化學(xué)工作電極W2的制備：1）以ITO導(dǎo)電玻璃為工作電極，在電極表面滴涂12μLrGO/TiO2，室溫下晾干；2）將1）中得到的工作電極放入馬弗爐中，在450℃下進(jìn)行退火處理，處理后冷卻至室溫；3）將2）中得到的工作電極表面滴涂12μL呋喃唑酮抗體溶液，4℃下干燥，干燥后用超純水清洗，4℃下干燥，制得光電化學(xué)工作電極W2；其余同實(shí)施例1中W2的制備步驟。（3）雙功能呋喃唑酮光電化學(xué)傳感器的制備方法：制備步驟同實(shí)施例1，不同之處為W1與W2間距為1.5cm，在電解池中加入的NaOH溶液的pH值為13。實(shí)施例4一種雙功能呋喃唑酮光電化學(xué)傳感器的應(yīng)用實(shí)施例1制備的一種雙功能呋喃唑酮光電化學(xué)傳感器應(yīng)用于呋喃唑酮的檢測，其檢測步驟為：（1）在W2上滴加10μL不同濃度的呋喃唑酮標(biāo)準(zhǔn)溶液，孵化30min后，呋喃唑酮與W2上的呋喃唑酮抗體進(jìn)行免疫結(jié)合，沖洗后，再滴加10μLHemin標(biāo)記的呋喃唑酮二抗，孵化30min后，Hemin標(biāo)記的呋喃唑酮二抗與呋喃唑酮進(jìn)行免疫結(jié)合，沖洗后，制得待測W2；（2）利用電化學(xué)工作站，在W1上采用階躍電壓的方法對W1施加階躍電壓，初始電壓為0v，階躍電壓為0.7v，階躍時(shí)間為10s；同時(shí)，在待測W2上采用時(shí)間-電流方法對待測W2施加恒定電壓，電壓為0v；待測W2上的電流會(huì)隨著呋喃唑酮濃度的增大而相應(yīng)增大，根據(jù)所得電流增大值與呋喃唑酮濃度之間的關(guān)系，繪制工作曲線；（3）將待測呋喃唑酮溶液代替呋喃唑酮的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照（1）和（2）所述的呋喃唑酮檢測方法進(jìn)行檢測，根據(jù)所得到的電流增大值與所繪制的工作曲線得出待測呋喃唑酮溶液的濃度；所述的Hemin標(biāo)記的呋喃唑酮二抗的濃度為300μg/mL。實(shí)施例5一種雙功能呋喃唑酮光電化學(xué)傳感器的應(yīng)用實(shí)施例2制備的一種雙功能呋喃唑酮光電化學(xué)傳感器應(yīng)用于呋喃唑酮的檢測，其檢測步驟除以下步驟外，其余步驟同實(shí)施例4：步驟（2）利用電化學(xué)工作站，在W1上采用階躍電壓的方法對W1施加階躍電壓，初始電壓為0v，階躍電壓為0.8v，階躍時(shí)間為20s；同時(shí)，在待測W2上采用時(shí)間-電流方法對待測W2施加恒定電壓，電壓為0.3v；待測W2上的電流會(huì)隨著呋喃唑酮濃度的增大而相應(yīng)增大，根據(jù)所得電流增大值與呋喃唑酮濃度之間的關(guān)系，繪制工作曲線。實(shí)施例6一種雙功能呋喃唑酮光電化學(xué)傳感器的應(yīng)用實(shí)施例3制備的一種雙功能呋喃唑酮光電化學(xué)傳感器應(yīng)用于呋喃唑酮的檢測，其檢測步驟除以下步驟外，其余步驟同實(shí)施例4：步驟（2）利用電化學(xué)工作站，在W1上采用階躍電壓的方法對W1施加階躍電壓，初始電壓為0v，階躍電壓為0.9v，階躍時(shí)間為30s；同時(shí)，在待測W2上采用時(shí)間-電流方法對待測W2施加恒定電壓，電壓為0.6v；待測W2上的電流會(huì)隨著呋喃唑酮濃度的增大而相應(yīng)增大，根據(jù)所得電流增大值與呋喃唑酮濃度之間的關(guān)系，繪制工作曲線。實(shí)施例7實(shí)施例1-3所制備的呋喃唑酮光電化學(xué)傳感器，按照實(shí)施例4-6的檢測步驟應(yīng)用于呋喃唑酮的檢測，具有優(yōu)良的檢測效果，檢測限為25pmol/L。