本發(fā)明涉及一種基于聚多巴胺復(fù)合膠囊標(biāo)記的凝血酶核酸適配體傳感器的制備方法及應(yīng)用，屬于新型功能納米復(fù)合材料的制備和生物傳感器檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

由絲氨酸蛋白質(zhì)水解而成的凝血酶是一種重要的絲氨酸蛋白酶。在人體生理和病理過程中都發(fā)揮著重要作用，可以作為相關(guān)疾病診斷的生物標(biāo)識(shí)物。衡量凝血機(jī)制的重要指標(biāo)是凝血酶的濃度和活性，對(duì)于揭示腫瘤的發(fā)生機(jī)制及作為早期診斷、治療、療效及愈后的判斷依據(jù)意義重大。

光電化學(xué)免疫傳感器是一種較為新穎、發(fā)展迅速的傳感器，它兼具了光化學(xué)方法和電化學(xué)技術(shù)的優(yōu)勢(shì)；同時(shí)，核酸適配體是通過SELEX技術(shù)篩選出來的，將篩選出來的適配體作為識(shí)別元件與光電化學(xué)傳感器相結(jié)合，具有適配體的高選擇性和特異性結(jié)合的優(yōu)勢(shì)，又具有光電化學(xué)傳感器的體積小，選擇性和靈敏性高、操作簡(jiǎn)單、低成本等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明制備了一種基于聚多巴胺復(fù)合膠囊標(biāo)記的凝血酶核酸適配體光電化學(xué)傳感器。

本發(fā)明采用溶劑熱法制備TiO₂納米材料，利用聚多巴胺膠囊吸附Cd²⁺得到Cd²⁺@聚多巴胺復(fù)合膠囊，用于標(biāo)記凝血酶核酸適配體，通過原位生長方式在聚多巴胺膠囊上原位生成CdS納米粒子，由于TiO₂與原位生成的CdS之間的協(xié)同效應(yīng)顯示出非常優(yōu)異的光電化學(xué)活性，提高了傳感器的靈敏度，擴(kuò)寬了線性范圍，有效地降低了傳感器的檢出限，實(shí)現(xiàn)了對(duì)凝血酶的超靈敏檢測(cè)。該方法結(jié)合光電化學(xué)和核酸適配體技術(shù)，具有靈敏度高、特異性好、操作便捷等優(yōu)點(diǎn)，有效克服了目前凝血酶檢測(cè)方法的不足。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一是利用聚多巴胺膠囊吸附Cd²⁺，得到Cd²⁺@聚多巴胺復(fù)合膠囊，利用原位生長方法，在聚多巴胺膠囊上原位生成CdS納米粒子。

本發(fā)明的目的之二是基于TiO₂與聚多巴胺膠囊上CdS之間協(xié)同效應(yīng)和核酸適配體與目標(biāo)物的特異性識(shí)別功能，構(gòu)建了一種夾心型光電化學(xué)免疫傳感器，實(shí)現(xiàn)凝血酶的超靈敏檢測(cè)。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

1. 一種基于聚多巴胺復(fù)合膠囊標(biāo)記的凝血酶核酸適配體光電化學(xué)傳感器的制備

（1）在聚多巴胺膠囊溶液中滴加1~3 mL的1 mol/L的硝酸鎘溶液，充分振蕩，離心除去上層清液，得到Cd²⁺@聚多巴胺復(fù)合膠囊；加入2 mL凝血酶核酸適配體溶液，在4°C恒溫振蕩箱中振蕩2~6 h，離心去除上清液，得到Cd²⁺@聚多巴胺復(fù)合膠囊標(biāo)記的凝血酶核酸適配體；加入2 mL的質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的牛血清白蛋白BSA溶液，常溫下振蕩1 h，離心除去上清液；再加入超純水2 mL，充分分散，得到Cd²⁺@聚多巴胺復(fù)合膠囊標(biāo)記的凝血酶核酸適配體溶液，4°C冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆茫?/p>

（2）將2.5×0.8 cm²的ITO電極依次浸沒在50°C的丙酮、水、乙醇和水中分別超聲清洗30 min，然后用高純氮?dú)獯蹈?；滴?0 μL的1~6 mg/mL的TiO₂納米粒子懸浮液于ITO電極，用馬弗爐300~600°C煅燒后，得到TiO₂納米粒子修飾的ITO電極，冷卻到室溫；

（3）在TiO₂納米粒子修飾的ITO電極上，依次滴加6 μL的2~7 μmol/L凝血酶核酸適配體，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的牛血清白蛋白，封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，超純水沖洗，4°C冰箱中晾干；

（4）滴加1×10^-15~1×10^-11 mol/L一系列不同濃度的凝血酶溶液，反應(yīng)30 min，超純水沖洗，4°C冰箱中晾干；

（5）滴加6 μL的Cd²⁺@聚多巴胺復(fù)合膠囊標(biāo)記的凝血酶核酸適配體溶液到電極表面，反應(yīng)20~40 min，超純水沖洗，4°C冰箱中晾干；

（6）滴加6 μL的0.1~1.0 mol/L的Na₂S溶液，反應(yīng)10~30 min，用超純水沖洗，4°C冰箱中晾干，制備得到了一種基于聚多巴胺復(fù)合膠囊標(biāo)記的凝血酶核酸適配體光電化學(xué)傳感器。

2. 聚多巴胺膠囊的制備

（1）將1~5 mL的質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為2.5%且直徑為300 nm的聚苯乙烯微球乙醇分散液加入到OP-10乳化劑中乳化5~15 min，然后分散到80 mL的10 mmol/L的pH 8.5三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖溶液中，超聲分散10 min；加入20~60 mg多巴胺，在室溫下磁力攪拌反應(yīng)2~48 h，離心分離，水洗三次，乙醇洗三次，得到聚多巴胺@聚苯乙烯微球，分散在乙醇中備用；

（2）將制備好的聚多巴胺@聚苯乙烯微球溶解分散到50~200 mL四氫呋喃中，磁力攪拌反應(yīng)6~48 h，離心分離，然后依次用四氫呋喃、乙醇和水分別離心洗滌三次，離心結(jié)束后除去上層清液，得到聚多巴胺膠囊，加超純水分散。

3. TiO₂納米粒子的制備

取0.01~0.03 mol原鈦酸四丁酯溶解在20~40 mL乙醇溶液中，然后在磁力攪拌下向上述溶液中逐滴滴加10 mL的超純水，30°C反應(yīng)60~180 min后，將懸濁液轉(zhuǎn)移到聚四氟乙烯內(nèi)襯的高壓釜中，并保持在100~200°C條件下反應(yīng)2~24 h；收集所制備的沉淀物，并分別用無水乙醇和超純水徹底離心洗滌各三次，然后在50°C真空干燥箱中干燥24 h，研磨成粉末備用。

4. 凝血酶的檢測(cè)方法

（1）采用三電極體系進(jìn)行檢測(cè)，如權(quán)利要求1所制備的光電化學(xué)傳感器為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為輔助電極，利用光電化學(xué)工作站進(jìn)行檢測(cè)，光電檢測(cè)采用i-t測(cè)試手段，偏壓設(shè)置為0 V，光源為白光，每隔10 s進(jìn)行開關(guān)燈；

（2）在10 mL含0.1 mol/L抗壞血酸的pH 7.4的PBS緩沖溶液中，通過光電化學(xué)工作站檢測(cè)1×10^-15~1×10^-11 mol/L一系列不同濃度的凝血酶標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過記錄開關(guān)燈前后產(chǎn)生的不同光電流信號(hào)，繪制工作曲線；

（3）將待測(cè)樣品溶液代替凝血酶標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)的結(jié)果可通過工作曲線的查得。

本發(fā)明的有益成果

（1）聚多巴胺的高負(fù)載性能，有利于Cd²⁺的負(fù)載，得到了Cd²⁺@聚多巴胺復(fù)合膠囊，從而制備了新穎的標(biāo)記材料。

（2）基于TiO₂基底材料與聚多巴胺復(fù)合膠囊上原位生長的CdS之間的協(xié)同效應(yīng)，降低了降低了檢測(cè)限，實(shí)現(xiàn)了超靈敏檢測(cè)。

實(shí)施例1一種基于聚多巴胺復(fù)合膠囊標(biāo)記的凝血酶核酸適配體光電化學(xué)傳感器的制備

（1）在聚多巴胺膠囊溶液中滴加1 mL的1 mol/L的硝酸鎘溶液，充分振蕩，離心除去上層清液，得到Cd²⁺@聚多巴胺復(fù)合膠囊；加入2 mL凝血酶核酸適配體溶液，在4°C恒溫振蕩箱中振蕩2 h，離心去除上清液，得到Cd²⁺@聚多巴胺復(fù)合膠囊標(biāo)記的凝血酶核酸適配體；加入2 mL的質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的牛血清白蛋白BSA溶液，常溫下振蕩1 h，離心除去上清液；再加入超純水2 mL，充分分散，得到Cd²⁺@聚多巴胺復(fù)合膠囊標(biāo)記的凝血酶核酸適配體溶液，4°C冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆茫?/p>

（2）將2.5×0.8 cm²的ITO電極依次浸沒在50°C的丙酮、水、乙醇和水中分別超聲清洗30 min，然后用高純氮?dú)獯蹈桑坏渭?0 μL的1 mg/mL的TiO₂納米粒子懸浮液于ITO電極，用馬弗爐300°C煅燒后，得到TiO₂納米粒子修飾的ITO電極，冷卻到室溫；

（3）在TiO₂納米粒子修飾的ITO電極上，依次滴加6 μL的2 μmol/L凝血酶核酸適配體，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的牛血清白蛋白，封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，超純水沖洗，4°C冰箱中晾干；

（4）滴加1×10^-15~1×10^-11 mol/L一系列不同濃度的凝血酶溶液，反應(yīng)30 min，超純水沖洗，4°C冰箱中晾干；

（5）滴加6 μL的Cd²⁺@聚多巴胺復(fù)合膠囊標(biāo)記的凝血酶核酸適配體溶液到電極表面，反應(yīng)20 min，超純水沖洗，4°C冰箱中晾干；

（6）滴加6 μL的0.1 mol/L的Na₂S溶液，反應(yīng)10 min，用超純水沖洗，4°C冰箱中晾干，制備得到了一種基于聚多巴胺復(fù)合膠囊標(biāo)記的凝血酶核酸適配體光電化學(xué)傳感器。

實(shí)施例2 一種基于聚多巴胺復(fù)合膠囊標(biāo)記的凝血酶核酸適配體光電化學(xué)傳感器的制備

（1）在聚多巴胺膠囊溶液中滴加2 mL的1 mol/L的硝酸鎘溶液，充分振蕩，離心除去上層清液，得到Cd²⁺@聚多巴胺復(fù)合膠囊；加入2 mL凝血酶核酸適配體溶液，在4°C恒溫振蕩箱中振蕩4 h，離心去除上清液，得到Cd²⁺@聚多巴胺復(fù)合膠囊標(biāo)記的凝血酶核酸適配體；加入2 mL的質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的牛血清白蛋白BSA溶液，常溫下振蕩1 h，離心除去上清液；再加入超純水2 mL，充分分散，得到Cd²⁺@聚多巴胺復(fù)合膠囊標(biāo)記的凝血酶核酸適配體溶液，4°C冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆茫?/p>

（2）將2.5×0.8 cm²的ITO電極依次浸沒在50°C的丙酮、水、乙醇和水中分別超聲清洗30 min，然后用高純氮?dú)獯蹈?；滴?0 μL的4 mg/mL的TiO₂納米粒子懸浮液于ITO電極，用馬弗爐450°C煅燒后，得到TiO₂納米粒子修飾的ITO電極，冷卻到室溫；

（3）在TiO₂納米粒子修飾的ITO電極上，依次滴加6 μL的5 μmol/L凝血酶核酸適配體，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的牛血清白蛋白，封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，超純水沖洗，4°C冰箱中晾干；

（4）滴加1×10^-15~1×10^-11 mol/L一系列不同濃度的凝血酶溶液，反應(yīng)30 min，超純水沖洗，4°C冰箱中晾干；

（5）滴加6 μL的Cd²⁺@聚多巴胺復(fù)合膠囊標(biāo)記的凝血酶核酸適配體溶液到電極表面，反應(yīng)30 min，超純水沖洗，4°C冰箱中晾干；

（6）滴加6 μL的0.05 mol/L的Na₂S溶液，反應(yīng)20 min，用超純水沖洗，4°C冰箱中晾干，制備得到了一種基于聚多巴胺復(fù)合膠囊標(biāo)記的凝血酶核酸適配體光電化學(xué)傳感器。

實(shí)施例3一種基于聚多巴胺復(fù)合膠囊標(biāo)記的凝血酶核酸適配體光電化學(xué)傳感器的制備

（1）在聚多巴胺膠囊溶液中滴加3 mL的1 mol/L的硝酸鎘溶液，充分振蕩，離心除去上層清液，得到Cd²⁺@聚多巴胺復(fù)合膠囊；加入2 mL凝血酶核酸適配體溶液，在4°C恒溫振蕩箱中振蕩6 h，離心去除上清液，得到Cd²⁺@聚多巴胺復(fù)合膠囊標(biāo)記的凝血酶核酸適配體；加入2 mL的質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的牛血清白蛋白BSA溶液，常溫下振蕩1 h，離心除去上清液；再加入超純水2 mL，充分分散，得到Cd²⁺@聚多巴胺復(fù)合膠囊標(biāo)記的凝血酶核酸適配體溶液，4°C冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆茫?/p>

（2）將2.5×0.8 cm²的ITO電極依次浸沒在50°C的丙酮、水、乙醇和水中分別超聲清洗30 min，然后用高純氮?dú)獯蹈桑坏渭?0 μL的6 mg/mL的TiO₂納米粒子懸浮液于ITO電極，用馬弗爐600°C煅燒后，得到TiO₂納米粒子修飾的ITO電極，冷卻到室溫；

（3）在TiO₂納米粒子修飾的ITO電極上，依次滴加6 μL的7 μmol/L凝血酶核酸適配體，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的牛血清白蛋白，封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，超純水沖洗，4°C冰箱中晾干；

（4）滴加1×10^-15~1×10^-11 mol/L一系列不同濃度的凝血酶溶液，反應(yīng)30 min，超純水沖洗，4°C冰箱中晾干；

（5）滴加6 μL的Cd²⁺@聚多巴胺復(fù)合膠囊標(biāo)記的凝血酶核酸適配體溶液到電極表面，反應(yīng)40 min，超純水沖洗，4°C冰箱中晾干；

（6）滴加6 μL的1.0 mol/L的Na₂S溶液，反應(yīng)30 min，用超純水沖洗，4°C冰箱中晾干，制備得到了一種基于聚多巴胺復(fù)合膠囊標(biāo)記的凝血酶核酸適配體光電化學(xué)傳感器。

實(shí)施例4 聚多巴胺膠囊的制備

（1）將1 mL的質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為2.5%且直徑為300 nm的聚苯乙烯微球乙醇分散液加入到OP-10乳化劑中乳化5 min，然后分散到80 mL的10 mmol/L的pH 8.5三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖溶液中，超聲分散10 min；加入20 mg多巴胺，在室溫下磁力攪拌反應(yīng)2 h，離心分離，水洗三次，乙醇洗三次，得到聚多巴胺@聚苯乙烯微球，分散在乙醇中備用；

（2）將制備好的聚多巴胺@聚苯乙烯微球溶解分散到50 mL四氫呋喃中，磁力攪拌反應(yīng)6 h，離心分離，然后依次用四氫呋喃、乙醇和水分別離心洗滌三次，離心結(jié)束后除去上層清液，得到聚多巴胺膠囊，加超純水分散。

實(shí)施例5 聚多巴胺膠囊的制備

（1）將2.5 mL的質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為2.5%且直徑為300 nm的聚苯乙烯微球乙醇分散液加入到OP-10乳化劑中乳化10 min，然后分散到80 mL的10 mmol/L的pH 8.5三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖溶液中，超聲分散10 min；加入40 mg多巴胺，在室溫下磁力攪拌反應(yīng)24 h，離心分離，水洗三次，乙醇洗三次，得到聚多巴胺@聚苯乙烯微球，分散在乙醇中備用；

（2）將制備好的聚多巴胺@聚苯乙烯微球溶解分散到100 mL四氫呋喃中，磁力攪拌反應(yīng)24 h，離心分離，然后依次用四氫呋喃、乙醇和水分別離心洗滌三次，離心結(jié)束后除去上層清液，得到聚多巴胺膠囊，加超純水分散。

實(shí)施例6 聚多巴胺膠囊的制備

（1）將5 mL的質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為2.5%且直徑為300 nm的聚苯乙烯微球乙醇分散液加入到OP-10乳化劑中乳化15 min，然后分散到80 mL的10 mmol/L的pH 8.5三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖溶液中，超聲分散10 min；加入60 mg多巴胺，在室溫下磁力攪拌反應(yīng)48 h，離心分離，水洗三次，乙醇洗三次，得到聚多巴胺@聚苯乙烯微球，分散在乙醇中備用；

（2）將制備好的聚多巴胺@聚苯乙烯微球溶解分散到200 mL四氫呋喃中，磁力攪拌反應(yīng)48 h，離心分離，然后依次用四氫呋喃、乙醇和水分別離心洗滌三次，離心結(jié)束后除去上層清液，得到聚多巴胺膠囊，加超純水分散。

實(shí)施例7

TiO₂納米粒子的制備

取0.01 mol原鈦酸四丁酯溶解在20 mL乙醇溶液中，然后在磁力攪拌下向上述溶液中逐滴滴加10 mL的超純水，30°C反應(yīng)60 min后，將懸濁液轉(zhuǎn)移到聚四氟乙烯內(nèi)襯的高壓釜中，并保持在100°C條件下反應(yīng)2 h；收集所制備的沉淀物，并分別用無水乙醇和超純水徹底離心洗滌各三次，然后在50°C真空干燥箱中干燥24 h，研磨成粉末備用。

實(shí)施例8

TiO₂納米粒子的制備

取0.02 mol原鈦酸四丁酯溶解在30 mL乙醇溶液中，然后在磁力攪拌下向上述溶液中逐滴滴加10 mL的超純水，30°C反應(yīng)120 min后，將懸濁液轉(zhuǎn)移到聚四氟乙烯內(nèi)襯的高壓釜中，并保持在150°C條件下反應(yīng)12 h；收集所制備的沉淀物，并分別用無水乙醇和超純水徹底離心洗滌各三次，然后在50°C真空干燥箱中干燥24 h，研磨成粉末備用。

實(shí)施例9

TiO₂納米粒子的制備

取0.03 mol原鈦酸四丁酯溶解在40 mL乙醇溶液中，然后在磁力攪拌下向上述溶液中逐滴滴加10 mL的超純水，30°C反應(yīng)180 min后，將懸濁液轉(zhuǎn)移到聚四氟乙烯內(nèi)襯的高壓釜中，并保持在200°C條件下反應(yīng)24 h；收集所制備的沉淀物，并分別用無水乙醇和超純水徹底離心洗滌各三次，然后在50°C真空干燥箱中干燥24 h，研磨成粉末備用。

實(shí)施例10

凝血酶的檢測(cè)方法

（1）采用三電極體系進(jìn)行檢測(cè)，如權(quán)利要求1所制備的光電化學(xué)傳感器為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為輔助電極，利用光電化學(xué)工作站進(jìn)行檢測(cè)，光電檢測(cè)采用i-t測(cè)試手段，偏壓設(shè)置為0 V，光源為白光，每隔10 s進(jìn)行開關(guān)燈；

（2）在10 mL含0.1 mol/L抗壞血酸的pH 7.4的PBS緩沖溶液中，通過光電化學(xué)工作站檢測(cè)1×10^-15~1×10^-11 mol/L一系列不同濃度的凝血酶標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過記錄開關(guān)燈前后產(chǎn)生的不同光電流信號(hào)，繪制工作曲線；

（3）將待測(cè)樣品溶液代替凝血酶標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)的結(jié)果可通過工作曲線的查得。