本發(fā)明屬于分析檢測和傳感器技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于細(xì)胞色素C與焦寧B作用的青蒿素分子印跡光電化學(xué)傳感器的制備方法。

背景技術(shù)：

青蒿素是一種天然存在的倍半萜內(nèi)過氧化物，具有抗菌、抗瘧疾等藥理活性。由于惡性瘧原蟲菌株對(duì)傳統(tǒng)基于喹啉的抗瘧疾藥物抗藥性增強(qiáng)，使青蒿素在治療瘧疾方面受到了廣泛的關(guān)注。在治療抗瘧疾方面，青蒿素及其衍生物被視為最具潛力的藥用成分。青蒿素在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用日益引起重視，也吸引了科研工作者去積極開發(fā)高選擇性和高靈敏性檢測青蒿素的方法。

分子印跡技術(shù)是由模板分子與功能單體相互作用，然后在特定條件下加入交聯(lián)劑，經(jīng)過聚合反應(yīng)、模版分子洗脫等步驟得到的一種帶有印跡的交聯(lián)聚合物。制得的交聯(lián)聚合物對(duì)模版分子具有特異性識(shí)別和結(jié)合的能力，能從復(fù)雜樣品基質(zhì)中選擇性地分離和富集目標(biāo)分子及其結(jié)構(gòu)類似物。將分子印跡聚合物作為高效液相色譜的固定相，利用其表面印跡空穴中的特異性識(shí)別位點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)模板分子和競爭分子的分離。由于具有獨(dú)特的空間選擇性，分子印跡技術(shù)已被廣泛用于固定相提取與分離技術(shù)、催化技術(shù)、電化學(xué)傳感器等領(lǐng)域。此外，分子印跡技術(shù)在超靈敏傳感器、藥物緩釋、生物細(xì)胞分離等領(lǐng)域也日益引起關(guān)注。

由于青蒿素缺少合適的紫外吸光度，對(duì)青蒿素的檢測是有困難的。目前有效檢測青蒿素的方法主要包括高效液相色譜法(HPLC)、超高液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用方法(HPLC–MS)、串聯(lián)質(zhì)譜光譜法(HPLC–MS/MS)等。這些傳統(tǒng)的檢測方法普遍存在操作復(fù)雜、選擇性差、成本高、耗時(shí)等缺陷，發(fā)展簡單高效的青蒿素檢測方法已成為一項(xiàng)十分有意義的研究工作。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的就是為了解決上述問題，提供一種青蒿素分子印跡光電化學(xué)傳感器的制備方法，具有操作簡單、選擇性高、成本低等優(yōu)點(diǎn)。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種青蒿素分子印跡光電化學(xué)傳感器的制備方法，基于細(xì)胞色素C與焦寧B作用，具體的步驟如下：

(1)在玻碳電極上電化學(xué)聚合出分子印跡聚合物膜，將模版分子洗脫得到印跡空穴；

(2)將步驟(1)制備得到的印跡聚合物浸入含青蒿素的溶液中掩蔽印跡膜的空穴，然后放入含細(xì)胞色素C標(biāo)記的模版分子溶液中，取代印跡空穴中的模版分子發(fā)生競爭反應(yīng)，放入含鐵氰化鉀的電解質(zhì)溶液中，觀察到電信號(hào)變化；

(4)隨溶液中細(xì)胞色素C標(biāo)記的模版分子減少，底物焦寧B熒光減弱，實(shí)現(xiàn)對(duì)青蒿素的光電化學(xué)檢測。

一種青蒿素分子印跡光電化學(xué)傳感器的制備方法，基于細(xì)胞色素C與焦寧B作用，步驟如下：

(1)玻碳電極的處理：將玻碳電極磨光，清洗后干燥；優(yōu)選：具體步驟：將玻碳電極用0.3μm和0.05μm的氧化鋁膏磨光，然后放入蒸餾水和乙醛的混合溶液中超聲清洗，取出后用氮?dú)獯抵粮稍铮?/p>

(2)青蒿素分子印跡電極的制備：將經(jīng)過步驟(1)處理的玻碳電極浸入到含有青蒿素、丙烯酰胺、二甲基丙烯酸乙二醇酯、偶氮二異丁腈和氯化鉀的脫氧磷酸鹽緩沖液中，采用循環(huán)伏安法掃描特定圈數(shù)，再將該電極用醋酸和甲醇的混合液浸泡后洗脫模版分子，即得青蒿素分子印跡電極；

優(yōu)點(diǎn)：青蒿素是被檢測物質(zhì)，在印跡聚合物中用于形成了帶有空穴的印跡；丙烯酰胺作為單體與青蒿素結(jié)合，丙烯酰胺的氨基可與青蒿素分子中的氫原子以氫鍵結(jié)合，形成穩(wěn)定的環(huán)狀復(fù)合物；二甲基丙烯酸乙二醇酯作為聚合反應(yīng)的交聯(lián)劑使用；偶氮二異丁腈是聚合反應(yīng)所需的引發(fā)劑；氯化鉀的脫氧磷酸鹽緩沖液是傳感器所存在的溶液體系。

(3)分子印跡電極的掩蔽、孵化和競爭：將步驟(2)制備的分子印跡電極浸入到含青蒿素的溶液中掩蔽空穴，然后放入含細(xì)胞色素C標(biāo)記的青蒿素溶液中浸泡，再將其放入含青蒿素的溶液中發(fā)生競爭反應(yīng)；

(4)青蒿素分子印跡傳感器電信號(hào)和光信號(hào)的檢測：將玻碳電極放入含有K₃[Fe(CN)₆]/K₄[Fe(CN)₆]和氯化鉀的電解質(zhì)溶液進(jìn)行循環(huán)伏安掃描得到電信號(hào)的變化情況，然后將電極放入含有焦寧B和三酸(如磷酸、乙酸和硼酸)的緩沖液中，檢測熒光信號(hào)的變化情況。

優(yōu)點(diǎn)：K₃[Fe(CN)₆]/K₄[Fe(CN)₆]和氯化鉀作為本發(fā)明中電化學(xué)反應(yīng)中的檢測探針，其工作原理是在電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)，產(chǎn)生電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)，從而檢測電極表面物質(zhì)的電化學(xué)活性。

優(yōu)選：步驟(2)中所述的青蒿素為10～20μM，丙烯酰胺為0.01～0.10mM，二甲基丙烯酸乙二醇酯為0.1～1.0mM，偶氮二異丁腈為0.01～0.10mM，氯化鉀為0.05～0.5M，掃描電壓為-0.2～1.2V，掃描速率為50～500mVs^-1，掃描圈數(shù)為5～50圈，浸泡30min～3h。

步驟(3)中所使用的溫度為20～50℃，細(xì)胞色素C標(biāo)記青蒿素溶液為1～10mM，掩蔽10～30min，浸泡10～50min。

步驟(4)中所述的三酸緩沖溶液pH為5.7～6.0，三酸濃度為0.1～1.0M。

上述的方法制備得到的電化學(xué)傳感器。

本發(fā)明的效果是：

本發(fā)明的青蒿素分子印跡傳感器具備操作簡單、選擇性高、成本低等優(yōu)點(diǎn)，采用光和電信號(hào)結(jié)合，可作為一種新型的分子印跡傳感器用于生物樣品和復(fù)雜體系中青蒿素的高效檢測。

本專利采用分子印跡技術(shù)，結(jié)合細(xì)胞色素C催化青蒿素與焦寧B熒光作用，選用細(xì)胞色素C催化青蒿素，使其與底物中的焦寧B產(chǎn)生熒光變化，從而檢測出青蒿素在分子印跡傳感器上的濃度變化。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的青蒿素分子印跡傳感器具備操作簡單、選擇性高、成本低等優(yōu)點(diǎn)，采用光和電信號(hào)結(jié)合，可作為一種新型的分子印跡傳感器用于生物樣品和復(fù)雜體系中青蒿素的高效檢測。

附圖說明

圖1為本發(fā)明青蒿素分子印跡光電傳感器的制備過程示意圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。

實(shí)施例1

將玻碳電極用0.3μm和0.05μm的氧化鋁膏磨光，然后將其放入蒸餾水和乙醛的混合溶液中超聲清洗，取出后用氮?dú)獯抵粮稍?。將處理的玻碳電極浸入含有14μM青蒿素、0.075mM丙烯酰胺、0.75mM二甲基丙烯酸乙二醇酯、0.06mM偶氮二異丁腈和0.1M氯化鉀的脫氧磷酸鹽緩沖溶液中。在-0.2～1.2V范圍內(nèi)，掃描速率為100mVs^-1，采用循環(huán)伏安法掃描7～10圈，直至掃描曲線穩(wěn)定。將該電極用醋酸、甲醇的混合溶液浸泡1h，洗脫模版分子，即得青蒿素分子印跡電極。在25℃下，將制備的分子印跡電極浸入含4mM青蒿素的溶液中掩蔽空穴15min，然后將其放入含細(xì)胞色素C標(biāo)記的青蒿素溶液中20min，再將其放入含青蒿素的溶液中發(fā)生競爭反應(yīng)。將電極放入含K₃[Fe(CN)₆]/K₄[Fe(CN)₆]和氯化鉀的電解質(zhì)溶液進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，得到電信號(hào)的變化情況，再將電極放入含焦寧B和三酸(如磷酸、乙酸、硼酸，濃度均為0.4M)緩沖溶液(pH＝6.0)中，檢測熒光化學(xué)信號(hào)變化情況。隨溶液中細(xì)胞色素C標(biāo)記的模版分子減少，底物焦寧B熒光減弱，可實(shí)現(xiàn)對(duì)青蒿素的光電化學(xué)檢測，如圖1所示。

實(shí)施例2

將玻碳電極用0.3μm和0.05μm的氧化鋁膏磨光，然后將其放入蒸餾水和乙醛的混合溶液中超聲清洗，取出后用氮?dú)獯抵粮稍铩⑻幚淼牟Ｌ茧姌O浸入含有13.6μM青蒿素、0.065mM丙烯酰胺、0.78mM二甲基丙烯酸乙二醇酯、0.056mM偶氮二異丁腈和0.1M氯化鉀的脫氧磷酸鹽緩沖溶液中。在-0.2～1.2V范圍內(nèi)，掃描速率為100mVs^-1，采用循環(huán)伏安法掃描10～15圈，直至掃描曲線穩(wěn)定。將該電極用醋酸、甲醇的混合溶液浸泡1h，洗脫模版分子，即得青蒿素分子印跡電極。在25℃下，將制備的分子印跡電極浸入含4mM青蒿素的溶液中掩蔽空穴20min，然后將其放入含細(xì)胞色素C標(biāo)記的青蒿素溶液中30min，再將其放入含青蒿素的溶液中發(fā)生競爭反應(yīng)。將電極放入含K₃[Fe(CN)₆]/K₄[Fe(CN)₆]和氯化鉀的電解質(zhì)溶液進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，得到電信號(hào)的變化情況，再將電極放入含焦寧B和三酸(如磷酸、乙酸、硼酸，濃度均為0.5M)緩沖溶液(pH＝5.8)中，檢測熒光化學(xué)信號(hào)變化情況。隨溶液中細(xì)胞色素C標(biāo)記的模版分子減少，底物焦寧B熒光減弱，可實(shí)現(xiàn)對(duì)青蒿素的光電化學(xué)檢測。

實(shí)施例3

將玻碳電極用0.3μm和0.05μm的氧化鋁膏磨光，然后將其放入蒸餾水和乙醛的混合溶液中超聲清洗，取出后用氮?dú)獯抵粮稍?。將處理的玻碳電極浸入含有14μM青蒿素、0.07mM丙烯酰胺、0.76mM二甲基丙烯酸乙二醇酯、0.055mM偶氮二異丁腈和0.1M氯化鉀的脫氧磷酸鹽緩沖溶液中。在-0.2～1.2V范圍內(nèi)，掃描速率為100mVs^-1，采用循環(huán)伏安法掃描15～20圈，直至掃描曲線穩(wěn)定。將該電極用醋酸、甲醇的混合溶液浸泡1h，洗脫模版分子，即得青蒿素分子印跡電極。在25℃下，將制備的分子印跡電極浸入含5.5mM青蒿素的溶液中掩蔽空穴15min，然后將其放入含細(xì)胞色素C標(biāo)記的青蒿素溶液中20min，再將其放入含青蒿素的溶液中發(fā)生競爭反應(yīng)。將電極放入含K₃[Fe(CN)₆]/K₄[Fe(CN)₆]和氯化鉀的電解質(zhì)溶液進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，得到電信號(hào)的變化情況，再將電極放入含焦寧B和三酸(如磷酸、乙酸、硼酸，濃度均為0.5M)緩沖溶液(pH＝5.9)中，檢測熒光化學(xué)信號(hào)變化情況。隨溶液中細(xì)胞色素C標(biāo)記的模版分子減少，底物焦寧B熒光減弱，可實(shí)現(xiàn)對(duì)青蒿素的光電化學(xué)檢測。

實(shí)施例4

將玻碳電極用0.3μm和0.05μm的氧化鋁膏磨光，然后將其放入蒸餾水和乙醛的混合溶液中超聲清洗，取出后用氮?dú)獯抵粮稍铩⑻幚淼牟Ｌ茧姌O浸入含有14.5μM青蒿素、0.08mM丙烯酰胺、0.8mM二甲基丙烯酸乙二醇酯、0.06mM偶氮二異丁腈和0.1M氯化鉀的脫氧磷酸鹽緩沖溶液中。在-0.2～1.2V范圍內(nèi)，掃描速率為100mVs^-1，采用循環(huán)伏安法掃描7～10圈，直至掃描曲線穩(wěn)定。將該電極用醋酸、甲醇的混合溶液浸泡1h，洗脫模版分子，即得青蒿素分子印跡電極。在25℃下，將制備的分子印跡電極浸入含6.0mM青蒿素的溶液中掩蔽空穴20min，然后將其放入含細(xì)胞色素C標(biāo)記的青蒿素溶液中30min，再將其放入含青蒿素的溶液中發(fā)生競爭反應(yīng)。將電極放入含K₃[Fe(CN)₆]/K₄[Fe(CN)₆]和氯化鉀的電解質(zhì)溶液進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，得到電信號(hào)的變化情況，再將電極放入含焦寧B和三酸(如磷酸、乙酸、硼酸，濃度均為0.4M)緩沖溶液(pH＝5.8)中，檢測熒光化學(xué)信號(hào)變化情況。隨溶液中細(xì)胞色素C標(biāo)記的模版分子減少，底物焦寧B熒光減弱，可實(shí)現(xiàn)對(duì)青蒿素的光電化學(xué)檢測。

上述雖然結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行了描述，但并非對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明白，在本發(fā)明的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員不需要付出創(chuàng)造性勞動(dòng)即可做出的各種修改或變形仍在本發(fā)明的保護(hù)范圍以內(nèi)。