【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[a]對于動脈硬化標志物本發(fā)明是涉及疾病的檢測方法的發(fā)明，更具體而言，是涉及以脫氧羥腐胺縮賴氨酸合酶基因作為指標使用的動脈硬化及癌的檢測方法的發(fā)明。
背景技術(shù)：
：現(xiàn)已明了動脈硬化成為腦卒中或心肌梗塞等的循環(huán)系統(tǒng)疾病的基礎(chǔ)的要因，伴隨年齡的增加，自然風險增大，但由遺傳的本因或生活習慣的紊亂等而發(fā)生風險也變動，增大。以動脈硬化為基礎(chǔ)發(fā)生的循環(huán)系統(tǒng)疾病對于患者本人或其家族負擔重，社會上也伴隨醫(yī)療費的增大，其發(fā)生的預防，或適宜的治療的手段的確立依然是重要的課題。特別是遺傳的的本因的特定是，為了通過對其特別指定使適宜地進行早期的生活指導，或動脈硬化的預防藥或治療藥的投藥等的預防的的措置成為可能，近年日益被重視。[b]對于癌標志物癌伴隨年齡的增加，自然風險增大，但由遺傳的本因或生活習慣的紊亂等而發(fā)生風險也變動，增大。伴隨高齡化社會的癌患者的增加對患者本人或家族負擔重，社會上也伴隨醫(yī)療費的增大，其發(fā)生的預防或，適宜的治療的手段的確立依然是重要的課題。特別是遺傳的的本因的特定，為了通過對其特別指定，使適宜地進行早期的生活指導等的預防的的措置成為可能，近年日益受重視?！粳F(xiàn)有技術(shù)文獻】【專利文獻】專利文獻1：特開2007-14277號公報專利文獻2：特表2006-507816號公報【非專利文獻】非專利文獻1：cracchiolobm,hellerds,clementpm,wolffec,parkmh,hanauske-abelhm,“eukaryoticinitiationfactor5a-1(eif5a-1)asadiagnosticmarkerforaberrantproliferationinintraepithelialneoplasiaofthevulva.”gynecoloncol.200494:217-22技術(shù)實現(xiàn)要素：【發(fā)明要解決的技術(shù)課題】[a]對于動脈硬化標志物動脈硬化的遺傳的本因是多種多樣的，在預見動脈硬化上伴隨必要充分的檢測力的，說起來作為“萬能標志物”的特定的基因標志物的推定是困難的。從而，為了實現(xiàn)無遺漏的動脈硬化的基因檢查，有進一步發(fā)現(xiàn)伴隨優(yōu)良的判別力的基因標志物的必要。[b]對于癌標志物食道癌、大腸癌等的消化系統(tǒng)的癌的一部分與其他種類的癌比，罹患率依然高，為了實現(xiàn)無遺漏的消化系統(tǒng)癌的基因檢查，有進一步發(fā)現(xiàn)伴隨優(yōu)良的判別力的基因標志物的必要。【解決課題的技術(shù)方案】[a]對于動脈硬化標志物此番，本發(fā)明人令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，以往被報告與前列腺癌或子宮頸癌有關(guān)系的基因“脫氧羥腐胺縮賴氨酸合酶(deoxyhypusinesynthase)基因”與動脈硬化非常地良好地關(guān)聯(lián)，作為期望的動脈硬化的標志物使用是可能的。即，本發(fā)明是提供動脈硬化的檢測方法(以下，也稱為本發(fā)明的動脈硬化檢測方法)的發(fā)明，在所述受試試樣中確認在受試試樣中的脫氧羥腐胺縮賴氨酸合酶(以下，也稱為dhps)基因的表達，以所述基因表達的亢進作為指標檢測受試者的動脈硬化。在本發(fā)明的動脈硬化檢測方法中使用的受試試樣適宜是血液受試體。本發(fā)明的動脈硬化檢測方法也可為數(shù)據(jù)取得方法，其特征在于，進行在受試試樣中的dhps基因的表達的數(shù)據(jù)取得，當確認所述基因表達的亢進時，作為動脈硬化的存在數(shù)據(jù)。本發(fā)明的動脈硬化檢測方法大分為下述的3種實施方式(動脈硬化檢測方法1～3)。進而，這些方法也能使用試劑盒進行。(1)本發(fā)明的動脈硬化檢測方法1在本發(fā)明的動脈硬化檢測方法中，可將作為目標基因的dhps基因的表達的確認通過以所述基因編碼的dhps蛋白質(zhì)的全部或一部分作為目標多肽檢測進行。特別是，將所述dhps蛋白質(zhì)的全部或一部分的檢測適宜地使用與其特異性結(jié)合的抗體、優(yōu)選為單克隆抗體進行。(2)本發(fā)明的動脈硬化檢測方法2在本發(fā)明的動脈硬化檢測方法中，可將作為目標基因的dhps基因的表達的確認通過檢測針對受試試樣中的dhps的抗體(自身抗體)進行。所述自身抗體的檢測，例如，可通過使受試試樣接觸于含dhps的全部或一部分的多肽的固定化物，以針對受試試樣內(nèi)的dhps的抗體(自身抗體)與所述固定化多肽的結(jié)合作為信號檢測進行。上述的固定化物中所含的dhps的一部分的多肽的氨基酸數(shù)能到所述全部多肽的氨基酸數(shù)的1/2以上、即184個氨基酸以上，適宜地是186個氨基酸以上、再適宜地為187個氨基酸以上。確保多肽的抗原性是前提，多肽長度短的方在肽自體的穩(wěn)定性上優(yōu)良，并且，固定化物的每單位量的固定化肽數(shù)變大而有靈敏度提高的傾向。(3)本發(fā)明的動脈硬化檢測方法3在本發(fā)明的動脈硬化檢測方法中，可將作為目標基因的dhps基因的表達的確認通過以受試試樣中的dhps基因的全部或一部分、或者，與所述基因的全部或一部分互補的核酸作為目標核酸檢測進行。所述目標核酸的檢測，例如，可通過使有與所述目標核酸的堿基序列互補的序列的核酸的核酸探針與固定化的或者未固定化的目標核酸雜交，檢測由所述雜交發(fā)生的信號進行。此時，可以將dhps基因的全部或一部分或者與所述基因的全部或一部分互補的核酸由pcr法等的基因擴增法擴增而成的基因擴增產(chǎn)物作為目標核酸檢測。(4)動脈硬化檢測用試劑盒再者，本發(fā)明的動脈硬化檢測方法能由具備實施其的要素的動脈硬化檢測用試劑盒進行。(5)固定化板本發(fā)明還提供含以下的步驟(a)～(d)的固定化板的使用方法。所述固定化板，在進行動脈硬化檢測方法2時，作為“含dhps的全部或一部分的多肽的固定化物”使用。(a)使固定化了人工調(diào)制的dhps的全部或一部分的板與血液受試體接觸，在板上進行針對所述血液受試體中的dhps的自身抗體和所述板上的dhps的全部或一部分結(jié)合的抗原抗體結(jié)合體的形成的步驟；(b)使人工附加了標記的抗體結(jié)合性的第二抗體與板上的上述抗原抗體結(jié)合體的自身抗體結(jié)合的步驟；(c)使與自身抗體結(jié)合的上述第二抗體的標記在板上顯現(xiàn)，為了檢測所述顯現(xiàn)信號而使用板的步驟；(d)以由板得到的所述顯現(xiàn)信號的檢測值作為針對dhps的自身抗體的定量值計數(shù)，以在大于統(tǒng)計學地得到的對于動脈硬化的閾值時的所述定量值作為上述血液受試體中的動脈硬化的指標的步驟。固定化在上述板上的dhps的一部分的多肽的氨基酸數(shù)適宜為所述全部的多肽的氨基酸數(shù)的1/2以上，與上述的動脈硬化檢測方法2中記載的同樣。作為固定化了dhps的全部或一部分的板(基板)，可舉出玻璃載玻片、多孔質(zhì)凝膠、微滴定板等。作為向基板的dhps的全部或一部分的固定化法，能使用公知的方法，可進行物理的吸附法、共價鍵法、離子鍵法、生物化學特異結(jié)合法等的抗體結(jié)合法等。再者，也能選擇適宜于使用的固定化法的基板。例如，為了促進在基板的表面上的蛋白質(zhì)的結(jié)合，能使用向其表面導入氨基的。此時，可進行使戊二醛結(jié)合于所述基板表面的氨基，使dhps的全部或一部分的末端氨基等結(jié)合于此結(jié)合的戊二醛的方法；向所述基板表面的氨基由靜電相互作用固定化dhps的全部或一部分的方法等。另外，也能使用適宜于蛋白質(zhì)的固定化的基板的各種市售品。作為本發(fā)明的動脈硬化檢測方法的目標要素的“脫氧羥腐胺縮賴氨酸合酶(dhps)”是已知與前列腺癌或子宮頸癌(專利文獻1、非專利文獻1)或凋亡(專利文獻2)關(guān)聯(lián)的公知的酶蛋白質(zhì)，在該人中的氨基酸序列已知是seqidno:1(專利文獻1)、編碼其的dhps基因的堿基序列被知為例如seqidno:2。再者，針對dhps的抗體(單克隆抗體和多克隆抗體)也公知，能由常規(guī)方法制造，也已經(jīng)進行市售。在本發(fā)明中的dhps(也稱為dhps蛋白質(zhì))是指與有seqidno:1的氨基酸序列的蛋白質(zhì)、或者，dhps的氨基酸序列有相同性，與有seqidno:1的氨基酸序列的蛋白質(zhì)有實質(zhì)上相同的生物學活性的，所述氨基酸序列的一部分含取代、缺損、插入、附加部分的蛋白質(zhì)。進而，在本發(fā)明中的dhps基因是有編碼上述的dhps的堿基序列的基因。如在專利文獻1中公開，dhps是在亞精胺存在下，對eif5a(eukaryotictranslationinitiationfactor5a)進行羥腐胺賴氨氧化(活化)的酶，在立體結(jié)構(gòu)中，有酶活性部位(本體結(jié)構(gòu))、鏈狀結(jié)構(gòu)、球狀結(jié)構(gòu)，酶活性部位和球狀結(jié)構(gòu)經(jīng)鏈狀結(jié)構(gòu)連接。由立體結(jié)構(gòu)解析等已知，酶活性部位和球狀結(jié)構(gòu)相互作用，推測球狀結(jié)構(gòu)是酶活性部位的偽底物。羥腐胺賴氨氧化已知對于含細胞增殖的細胞功能是必須的。即，羥腐胺賴氨氧化是將亞精胺的丁基胺部分nad依賴性地轉(zhuǎn)移到特異性賴氨酸殘基的ε-氨基后，被氫氧化的eif5a上固有的翻譯后修飾，是從酵母到人保守的對于生長必須的。如上所述，dhps特別被認識為作為前列腺癌或子宮頸癌的標志物的應(yīng)用可能性，但作為動脈硬化的標志物的公開，則連提示都沒有。[b]對于癌標志物此番，本發(fā)明人令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，以往被報告為與前列腺癌或子宮頸癌有關(guān)系的基因“脫氧羥腐胺縮賴氨酸合酶(deoxyhypusinesynthase)基因”與消化系統(tǒng)癌非常良好地關(guān)聯(lián)，能作為期望的癌標志物使用。即，本發(fā)明是提供癌的檢測方法(以下，也稱為本發(fā)明的癌檢測方法)的發(fā)明，其中在所述受試試樣中確認在受試試樣中的脫氧羥腐胺縮賴氨酸合酶(以下，也稱為dhps)基因的表達，以所述基因表達的亢進作為指標檢測消化系統(tǒng)癌。在本發(fā)明的癌檢測方法中使用的受試試樣適宜為血液受試體。本發(fā)明的癌檢測方法也可為數(shù)據(jù)的取得方法，其特征在于，進行在受試試樣中的dhps基因的表達的數(shù)據(jù)取得，在確認了所述基因表達的亢進時，作為消化系統(tǒng)癌的存在數(shù)據(jù)。本發(fā)明的癌檢測方法大分為下述的3種實施方式(癌檢測方法1～3)。進而，這些方法也能使用試劑盒進行。(1)本發(fā)明的癌檢測方法1在本發(fā)明的癌檢測方法中，可將作為目標基因的dhps基因的表達的確認通過以所述基因所編碼的dhps蛋白質(zhì)的全部或一部分作為目標多肽檢測進行。特別是，將所述dhps蛋白質(zhì)的全部或一部分的檢測適宜地使用與其特異性結(jié)合的抗體、優(yōu)選為單克隆抗體進行。(2)本發(fā)明的癌檢測方法2在本發(fā)明的癌檢測方法中，可將作為目標基因的dhps基因的表達的確認通過檢測針對受試試樣中的dhps的抗體(自身抗體)進行。所述自身抗體的檢測，例如，可通過使受試試樣接觸于含dhps的全部或一部分的多肽的固定化物，以針對受試試樣內(nèi)的dhps的抗體(自身抗體)與所述固定化多肽的結(jié)合作為信號檢測進行。上述的固定化物中所含的dhps的一部分的多肽的氨基酸數(shù)能達到所述全部的多肽的氨基酸數(shù)的1/2以上、即184個氨基酸以上，適宜地是186個氨基酸以上、再者適宜地是187個氨基酸以上。確保多肽的抗原性是前提，但多肽長度短的方在肽自體的穩(wěn)定性上優(yōu)良，并且，固定化物的每單位量的固定化肽數(shù)變大而有靈敏度提高的傾向。(3)本發(fā)明的癌檢測方法3在本發(fā)明的癌檢測方法中，可將作為目標基因的dhps基因的表達的確認通過以受試試樣中的dhps基因的全部或一部分、或者，與所述基因的全部或一部分互補的核酸作為目標核酸檢測進行。所述目標核酸的檢測，例如，可通過使有與所述目標核酸的堿基序列互補的序列的核酸的核酸探針與固定化的或者未固定化的目標核酸雜交而檢測由所述雜交發(fā)生的信號來進行。此時，可以將dhps基因的全部或一部分或者與所述基因的全部或一部分互補的核酸由pcr法等的基因擴增法擴增而成的基因擴增產(chǎn)物作為目標核酸檢測。(4)癌檢測用試劑盒再者本發(fā)明的癌檢測方法能由具備實施其的要素的癌檢測用試劑盒進行。(5)固定化板本發(fā)明還提供含以下的步驟(a)～(d)的固定化板的使用方法。所述固定化板，在進行癌檢測方法2時，是作為“含dhps的全部或一部分的多肽的固定化物”使用的。(a)使固定化了人工調(diào)制的dhps的全部或一部分的板與血液受試體接觸，在板上進行針對所述血液受試體中的dhps的自身抗體和所述板上的dhps的全部或一部分結(jié)合的抗原抗體結(jié)合體的形成的步驟；(b)使人工附加了標記的抗體結(jié)合性的第二抗體與板上的上述抗原抗體結(jié)合體的自身抗體結(jié)合的步驟；(c)為了使與自身抗體結(jié)合的上述第二抗體的標記在板上顯現(xiàn)而檢測所述顯現(xiàn)信號而使用板的步驟；(d)以由板得到的所述顯現(xiàn)信號的檢測值作為針對dhps的自身抗體的定量值計數(shù)，以在大于統(tǒng)計學地得到的對于消化系統(tǒng)癌的閾值時的所述定量值作為上述血液受試體中的消化系統(tǒng)癌的指標的步驟。固定化在上述板上的dhps的一部分的多肽的氨基酸數(shù)適宜地是所述全部的多肽的氨基酸數(shù)的1/2以上，與上述的癌檢測方法2中記載的同樣。作為固定化了dhps的全部或一部分的板(基板)，可舉出玻璃載玻片、多孔質(zhì)凝膠、微滴定板等。作為向基板的dhps的全部或一部分的固定化法，能使用公知的方法，可進行物理的吸附法、共價鍵法、離子鍵法、生物化學特異結(jié)合法等的抗體結(jié)合法等。再者，也能選擇適宜于使用的固定化法的基板。例如，為了促進在基板的表面的蛋白質(zhì)的結(jié)合，能使用向其表面導入氨基的。此時，可進行使戊二醛結(jié)合于所述基板表面的氨基，使dhps的全部或一部分的末端氨基等結(jié)合于此結(jié)合的戊二醛的方法；向所述基板表面的氨基由靜電相互作用固定化dhps的全部或一部分的方法等。另外，也能使用適宜于蛋白質(zhì)的固定化的基板的各種市售品。作為本發(fā)明的癌檢測方法的目標要素的“脫氧羥腐胺縮賴氨酸合酶(dhps)”是已知與前列腺癌或子宮頸癌(專利文獻1、非專利文獻1)或凋亡(專利文獻2)關(guān)聯(lián)的公知的酶蛋白質(zhì)，在該人中的氨基酸序列已知是seqidno:1(專利文獻1)、編碼其的dhps基因的堿基序列被知為例如seqidno:2。再者，針對dhps的抗體(單克隆抗體和多克隆抗體)也是公知的，能由常規(guī)方法制造，也已經(jīng)進行市售。在本發(fā)明中的dhps(也稱為dhps蛋白質(zhì))是指與有seqidno:1的氨基酸序列的蛋白質(zhì)、或者，dhps的氨基酸序列有相同性，與有seqidno:1的氨基酸序列的蛋白質(zhì)有實質(zhì)上相同的生物學活性的，在所述氨基酸序列的一部分上含取代、缺損、插入、附加部分的蛋白質(zhì)。進而，在本發(fā)明中的dhps基因是有編碼上述的dhps的堿基序列的基因。如在專利文獻1中公開，dhps是在亞精胺存在下，對eif5a(eukaryotictranslationinitiationfactor5a)進行羥腐胺賴氨氧化(活化)的酶，在立體結(jié)構(gòu)中，有酶活性部位(本體結(jié)構(gòu))、鏈狀結(jié)構(gòu)、球狀結(jié)構(gòu)，酶活性部位和球狀結(jié)構(gòu)經(jīng)鏈狀結(jié)構(gòu)連接。由立體結(jié)構(gòu)解析等已知，酶活性部位和球狀結(jié)構(gòu)相互作用，球狀結(jié)構(gòu)被推測是酶活性部位的偽底物。羥腐胺賴氨氧化已知對于含細胞增殖的細胞功能是必須的。即，羥腐胺賴氨氧化是將亞精胺的丁基胺部分nad依賴性地轉(zhuǎn)移到特異性賴氨酸殘基的ε-氨基后，被氫氧化的eif5a上固有的翻譯后修飾，從酵母到人保守的對生長必須的。如上所述dhps特別被認識為作為前列腺癌或子宮頸癌的標志物的應(yīng)用可能性，作為消化系統(tǒng)癌標志物的公開，則連提示都沒有。作為消化系統(tǒng)癌，可舉食道癌、胃癌、十二指腸癌、大腸癌(含直腸癌及結(jié)腸癌)、小腸癌、膽囊癌、胰腺癌、及肝臟癌，特別是，作為食道癌及大腸癌的標志物，dhps是有用的?！景l(fā)明效果】由本發(fā)明提供基于關(guān)于受試試樣中的脫氧羥腐胺縮賴氨酸合酶(dhps)基因的表達的要素的動脈硬化的檢測手段、及消化系統(tǒng)癌的檢測手段?！靖綀D說明】【圖1】是在醫(yī)療設(shè)施來源的血清受試體中，在急性期腦梗塞患者和健康人之間，將使用elisa法探討的dhps的自身抗體價的分布的第一結(jié)果與截止值一同顯示的附圖?！緢D2】是關(guān)于圖1的dhps的自身抗體價的分布的roc曲線?！緢D3】是在醫(yī)療設(shè)施來源的血清受試體中，在急性期腦梗塞患者和健康人之間，將使用elisa法探討的dhps的自身抗體價的分布的第二的結(jié)果與截止值一同顯示的附圖?！緢D4】是關(guān)于圖3的dhps的自身抗體價的分布的roc曲線?！緢D5】是在醫(yī)療設(shè)施來源的血清受試體中，分為作為既有的動脈硬化標志物的crp值的陰性組和陽性組，再者，以在這些組之中的急性期腦梗塞患者組和健康人組之間的由elisa法得到的dhps的自身抗體價的分布作為第三的探討結(jié)果顯示的附圖?！緢D6】是圖5的dhps的自身抗體價之中，在crp值的陰性組中的roc曲線。【圖7】是顯示對于急性期腦梗塞患者的血清受試體中的dhps的自身抗體，進行由蛋白印跡法的探討的結(jié)果的電泳圖?！緢D8】是顯示對于急性期腦梗塞患者的血清受試體中的內(nèi)源性的dhps，用蛋白印跡法進行檢測的結(jié)果的電泳圖。【圖9】是在醫(yī)療設(shè)施來源的血清受試體中，在癌患者和健康人之間，將使用elisa法探討的dhps的自身抗體價的分布的結(jié)果與截止值一同顯示的附圖?！緢D10】是關(guān)于圖9的dhps的自身抗體價的分布的roc曲線?！緦嵤┓绞健縖a]對于本發(fā)明的動脈硬化檢測方法(1)關(guān)于脫氧羥腐胺縮賴氨酸合酶(dhps)基因的材料的入手如上所述，在人等中公知dhps的存在，其氨基酸序列(對于人，seqidno:1)和編碼其的堿基序列(例如，seqidno:2)是已經(jīng)公知的?？苫谄洌晒姆椒ㄖ圃熘亟Mdhps。具體而言，例如基于上述堿基序列，設(shè)計用于擴增有所述堿基序列的全部或一部分的雙鏈dna的核酸擴增用引物，以由使用所述擴增用引物的pcr法等的基因擴增產(chǎn)物作為dhps基因的全部或一部分得到，使用其并入適宜的載體，選擇并入所述載體而轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體而進行克隆，再者，將作為目的的dhps的全部或一部分在所述轉(zhuǎn)化體、或者，將從所述轉(zhuǎn)化體得到的dhps基因適用于對于基因表達適宜的載體和宿主的轉(zhuǎn)化體中進行dhps基因的表達，由此可得到重組dhps。再者，如上所述，不使用pcr法等的基因擴增法而也可經(jīng)基因庫的制作進行dhps基因的克隆。再者，重組dhps能根據(jù)需要，通過在編碼成為對象的dhps的核酸中進行點突變導入法、隨機突變導入法、階段性缺失基因制作法等的基因改變法，將其氨基酸序列從天然型改變。另外，dhps的全部或一部分能根據(jù)公知的肽的化學合成法制造。關(guān)于肽合成，能使用作為當今或常規(guī)方法確立的液相肽合成法、或者固相肽合成法制造。進而，一般而言，作為作為適宜的化學合成法識別的固相肽合成法，能使用boc固相法或fmoc固相法。特別是，可合成長鏈時使用連接法。作為如上述得到的dhps基因的其他用途，例如，可在將針對dhps的抗體由基因免疫法制造時利用。另外，能作為在本發(fā)明的動脈硬化檢測方法中使用的核酸探針利用。再者，如上述得到的dhps可作為制造針對dhps的抗體時的免疫原、由自身抗體的檢測進行本發(fā)明的動脈硬化檢測方法時的自身抗體的結(jié)合場所、再者，在本發(fā)明的動脈硬化檢測方法中的標準物質(zhì)等使用。針對dhps的抗體可使用常規(guī)方法制造。即，對于免疫動物，給作為免疫原的dhps、或者，dhps基因，由此，可作為多克隆抗體得到在免疫動物體內(nèi)生成的抗血清。另外，單克隆抗體通過從上述免疫動物得到b細胞，制作基于其的雜交瘤，將其再給于宿主動物，可由所述宿主動物得到。在如上述得到的dhps基因、dhps、及針對dhps的抗體中，也能根據(jù)需要進行適宜的修飾或處理。作為修飾，例如，可舉出熒光物質(zhì)、染料、酶、放射性物質(zhì)等的標記物質(zhì)的附加等，作為處理，例如，可舉出抗體的片段化等。關(guān)于上述的dhps基因的要素，能使用市售品。在市售品中，既有產(chǎn)品自不必說，也包括根據(jù)訂單制造的外訂品。(2)對于本發(fā)明的動脈硬化檢測方法1本發(fā)明的動脈硬化檢測方法1的特征在于，在受試試樣中確認dhps基因的表達，以所述基因表達的亢進作為指標檢測受試者的動脈硬化時，將作為目標基因的dhps基因的表達的確認通過以所述基因所編碼的dhps的全部或一部分(以下，在本發(fā)明的動脈硬化檢測方法中有時也總稱為dhpses)作為目標多肽檢測進行。即，對受試試樣中的dhpses進行定量，當其定量值比至少未確認動脈硬化者(以下，在本發(fā)明的動脈硬化檢測方法中也稱為動脈硬化健康者)的標準值大時，能認定在受試試樣提供者中的dhps基因的表達的亢進，以其作為指標檢測所述受試試樣提供者的動脈硬化。作為受試試樣，可使用血清受試體、血漿受試體、全血受試體等的血液受試體、再者尿受試體等，但適宜地是血液受試體。另外，血液受試體也可進行適宜適合的處理、例如肝素處理等。在受試試樣中的dhpses量的動脈硬化健康者的標準值通過設(shè)定推定為由一般的檢查確認不到動脈硬化者的標本集團，求出在所述標本集團中的所述受試試樣的dhpses的定量值，對其實施統(tǒng)計處理而求出平均、標準偏差等，可含截止值而導出。在受試試樣中的dhpses的定量手段無特別限定，例如，使用與dhpses特異性結(jié)合的抗體、優(yōu)選為單克隆抗體進行的定量手段、具體而言，可舉出免疫沉降法、蛋白印跡法、免疫染色法、eia法、ria法、比濁法、散射比濁法、乳膠凝集比濁法、cleia法等。另外，也能使用tof-mass直接定量dhpses。在eia法中，使用特別固定化抗體的elisa法是適宜的。任何的定量手段均可使用以定量目標物質(zhì)作為受試試樣中的dhpses時的確立的手段進行。以下，對這些中的幾個簡單進行說明。在定量手段是elisa法時，例如，可通過使受試試樣接觸于固定化在微平板上的針對dhps的抗體，使受試試樣中的dhpses與固定化抗體結(jié)合，將與此固定化抗體結(jié)合的dhpses使用酶標記的別的針對dhps的抗體等檢測來進行定量。另外，也能使固定化抗體和受試試樣及酶標記抗體同時反應(yīng)，對受試試樣中的dhpses進行定量。在定量手段是免疫沉降法時，例如，可通過使受試試樣接觸于固定化在珠上的針對dhps的抗體而使dhpses與固定化抗體結(jié)合，分離與此固定化抗體結(jié)合的dhpses，從其分離物檢測dhpses來進行定量。此dhpses的由免疫沉降法的定量，例如，可使用對于上述的分離物進行電泳，使針對dhps的標記抗體作用于此電泳圖譜的轉(zhuǎn)印物，檢測dhpses的條帶的蛋白印跡法進行。再者，定量手段也能作為以蛋白印跡法作為主體的方法。例如，將自受試試樣除去細胞的細胞除外受試試用樣直接由電泳分離，使針對dhps的標記抗體作于其轉(zhuǎn)印物，通過檢測條帶，可對受試試樣中的dhpses進行定量。在定量手段是乳膠凝集比濁法時，例如，可通過使受試試樣接觸于與乳膠粒子結(jié)合的針對dhps的抗體，在液相中由抗原抗體反應(yīng)形成免疫復合物的凝集塊，測定其濁度的變化進行定量。(3)對于本發(fā)明的動脈硬化檢測方法2本發(fā)明的動脈硬化檢測方法2的特征在于，在受試試樣中確認dhps基因的表達，以所述基因表達的亢進作為指標檢測受試者的動脈硬化時，將作為目標基因的dhps基因的表達的確認通過檢測針對受試試樣中的dhps的抗體(自身抗體)來進行。即，對針對受試試樣中的dhps的自身抗體進行定量，當其定量值大于動脈硬化健康者的標準值時，認定在受試試樣提供者中的dhps基因的表達的亢進，能以其作為指標檢測所述受試試樣提供者的動脈硬化。作為受試試樣，可使用血清受試體、血漿受試體、全血受試體等的血液受試體、再者尿受試體等，但適宜地是血液受試體。另外，血液受試體也可進行適宜適合的處理、例如肝素處理等。在受試試樣中的dhps自身抗體量的動脈硬化健康者的標準值通過設(shè)定推定為由一般的檢查確認不到動脈硬化的者的標本集團，求出在所述標本集團中的所述受試試樣的dhps自身抗體的定量值，對其實施統(tǒng)計處理而求出平均、標準偏差等，可含截止值而導出。所述自身抗體的定量，例如，可通過使受試試樣接觸于含dhpses的多肽的固定化物，以針對受試試樣內(nèi)的dhps的抗體(自身抗體)與所述固定化多肽的結(jié)合作為信號檢測來進行。具體而言，可使用間接熒光抗體法、elisa法、蛋白印跡法(免疫印跡法)、比濁法、散射比濁法、乳膠凝集比濁法、cleia法等的手段進行定量。任何的定量手段均可使用以定量目標物質(zhì)作為受試試樣中的dhps自身抗體時的確立的手段進行。例如，在間接熒光抗體法(fana)中，可使受試試樣接觸于固定化了dhpses的蛋白陣列，使固定化dhpses和針對受試試樣中的dhps的抗體結(jié)合，對于形成的固定化dhpses-抗dhps抗體復合物，再者，使實施熒光標記的第二抗體接觸，對針對dhps的自身抗體進行定量。在elisa法中，是以在間接熒光抗體法中使用的第二抗體的標記作為酶標記進行定量的。第二抗體的標記能多樣地選擇。在蛋白印跡法中，可將dhpses用sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳之后，從凝膠轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜等的載體，使受試試樣接觸于所述轉(zhuǎn)錄載體，使所述轉(zhuǎn)錄載體上的dhpses和針對受試試樣中的dhps的抗體的復合物形成，通過檢測所述復合物進行定量。在比濁法或散射比濁法中，可通過將通過使受試試樣和dhpses接觸而形成的dhpses-抗dhps抗體復合物用濁度(比濁法)或散射光強度的變化(散射比濁法)檢測來進行定量。在乳膠凝集比濁法中，可通過使dhpses結(jié)合的乳膠粒子和受試試樣接觸，由與乳膠粒子結(jié)合的自身抗體彼此的相互作用形成所述乳膠粒子的凝集體，通過對其進行檢測來進行定量。在cleia法中，可通過使dhpses結(jié)合磁性粒子和受試試樣接觸，在磁性粒子上形成dhpses-抗dhps抗體復合物而進行集磁，除去未反應(yīng)物，實施適宜的熒光化處理等而檢測所述復合物來進行定量。(4)對于本發(fā)明的動脈硬化檢測方法3本發(fā)明的動脈硬化檢測方法3的特征在于，在受試試樣中確認dhps基因的表達，以所述基因表達的亢進作為指標檢測受試者的動脈硬化時，將作為目標基因的dhps基因的表達的確認通過以受試試樣中的dhps基因的全部或一部分、或者與所述基因互補的核酸作為目標核酸檢測進行。例如，對受試試樣中的編碼dhpses的mrna量進行定量，當其定量值大于動脈硬化健康者的標準值時，認定在受試試樣提供者中的dhpses基因的表達的亢進，能以其作為指標檢測所述受試試樣提供者的動脈硬化。作為受試試樣，可使用血清受試體、血漿受試體、全血受試體等的血液受試體、再者尿受試體等，但適宜地是血液受試體。另外，血液受試體也可進行適宜適合的處理、例如肝素處理等。成為受試試樣中的編碼dhpses的mrna量檢測的基礎(chǔ)的核酸可通過將受試試樣中的rna由常規(guī)方法提取，對其進行向dna的逆轉(zhuǎn)錄而作為cdna得到。通過對于所述cdna進行使用用于擴增dhpses基因的基因擴增用引物的pcr法等的基因擴增方法(rt-pcr法)，掌握顯示成為其基礎(chǔ)的mrna量的程度，例如，在特定的循環(huán)數(shù)的基因擴增手段中的dhpses基因的拷貝數(shù)，或dhpses基因的拷貝數(shù)的增加速度等，可掌握受試試樣中的dhpses基因的表達量。所述目標核酸的檢測，例如，可通過使有與所述目標核酸的堿基序列互補的序列的核酸的核酸探針與固定化的或者未固定化的作為基因擴增產(chǎn)物得到的目標核酸雜交而檢測由所述雜交發(fā)生的信號來進行。所述信號的檢測，例如，可由dna印跡法進行。再者，可由使用rt-pcr法的實時分析等進行本發(fā)明的動脈硬化檢測方法3的一系列的工序。(5)本發(fā)明的動脈硬化檢測用試劑盒本發(fā)明的動脈硬化檢測用試劑盒是具備用于如上所述進行本發(fā)明的動脈硬化檢測方法的要素的試劑盒。所述動脈硬化檢測用試劑盒的內(nèi)容隨本發(fā)明的動脈硬化檢測方法的實施方式，或目的、對于將何程度試劑盒化的意圖等而不同。例如，在用于進行本發(fā)明的動脈硬化檢測方法1的動脈硬化檢測用試劑盒中，作為用于進行elisa法的試劑盒的構(gòu)成可舉出，具備以針對dhps的抗體作為第一抗體固定化的板、進行標記的第二抗體、用于使第二抗體的標記顯現(xiàn)的試劑的實施方式。另外，作為用于進行乳膠凝集比濁法的試劑盒構(gòu)成可舉出，使針對dhps的抗體結(jié)合的乳膠粒子。再者，作為用于進行cleia法的試劑盒構(gòu)成可舉出，具備使針對dhps的抗體結(jié)合的磁性粒子、進行標記的第二抗體、用于使第二抗體的標記顯現(xiàn)的試劑的實施方式。其中舉的這些構(gòu)成被充分例示，用于進行本發(fā)明的動脈硬化檢測方法1的其他實施方式的試劑盒也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。再者，也能以進一步減少其中例示的上述的要素的構(gòu)成，增加檢查的外訂或自身籌備的程度的方式設(shè)定，相反，也能以稀釋液或試劑用的管等作為構(gòu)成增加，設(shè)定動脈硬化檢測用試劑盒的即時使用。另外，也能考慮根據(jù)具體的檢查實施方式的其他要素。另外，在用于進行本發(fā)明的動脈硬化檢測方法2的動脈硬化檢測用試劑盒中，作為用于進行fana法或elisa法的試劑盒的構(gòu)成可舉出，例如，具備固定化dhpses的板、進行標記的針對自身抗體的第二抗體、用于使第二抗體的標記顯現(xiàn)的試劑的實施方式。另外，作為用于進行乳膠凝集比濁法的試劑盒構(gòu)成可舉出，使dhpses結(jié)合的乳膠粒子。再者，作為用于進行cleia法的試劑盒構(gòu)成可舉出，具備使dhpses結(jié)合的磁性粒子、進行標記的針對自身抗體的第二抗體、用于使第二抗體的標記顯現(xiàn)的試劑的實施方式。其中舉的這些構(gòu)成被充分例示，用于進行本發(fā)明的動脈硬化檢測方法2的其他實施方式的試劑盒也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。再者，也能以進一步減少其中例示的上述的要素的構(gòu)成，增加檢查的外訂或自身籌備的程度的方式設(shè)定，相反，也能以稀釋液或試劑用的管等作為構(gòu)成增加，設(shè)定動脈硬化檢測用試劑盒的即時使用。另外，也能考慮根據(jù)具體的檢查實施方式的其他要素。再者，在用于進行本發(fā)明的動脈硬化檢測方法3的動脈硬化檢測用試劑盒中，作為試劑盒的構(gòu)成可舉出，例如，用于對mrna進行逆轉(zhuǎn)錄的逆轉(zhuǎn)錄酶和逆轉(zhuǎn)錄用引物、用于擴增編碼dhpses的cdna的基因擴增用引物、用于檢測基因擴增產(chǎn)物的核酸探針、用于使所述核酸探針的信號顯現(xiàn)的試劑等。其中舉的這些構(gòu)成被充分例示，用于進行本發(fā)明的動脈硬化檢測方法3的其他實施方式的試劑盒也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。再者，也能以進一步減少其中例示的上述的要素的構(gòu)成，增加檢查的外訂或自身籌備的程度的方式設(shè)定，相反，也能以稀釋液或試劑用的管等作為構(gòu)成增加，設(shè)定動脈硬化檢測用試劑盒的即時使用。另外，也能考慮根據(jù)具體的檢查實施方式的其他要素。[b]對于本發(fā)明的癌檢測方法(1)關(guān)于脫氧羥腐胺縮賴氨酸合酶(dhps)基因的材料的入手如上所述，在人等中公知dhps的存在，其氨基酸序列(對于人，seqidno:1)和編碼其的堿基序列(例如，seqidno:2)是已經(jīng)公知的?？苫谄?，由公知的方法制造重組dhps。具體而言，例如基于上述堿基序列，設(shè)計用于擴增有所述堿基序列的全部或一部分的雙鏈dna的核酸擴增用引物，以由使用所述擴增用引物的pcr法等的基因擴增產(chǎn)物作為dhps基因的全部或一部分得到，使用其整合到適宜的載體，選擇整合轉(zhuǎn)化所述載體的轉(zhuǎn)化體而進行克隆，再者，將作為目的的dhps的全部或一部分在所述轉(zhuǎn)化體、或者，將從所述轉(zhuǎn)化體得到的dhps基因適用于對于基因表達適宜的載體和宿主的轉(zhuǎn)化體中進行dhps基因的表達，由此可得到重組dhps。再者，也可不如上所述使用pcr法等的基因擴增法而經(jīng)基因庫的制作進行dhps基因的克隆。再者，重組dhps，根據(jù)需要，通過在編碼成為對象的dhps的核酸中進行點突變導入法、隨機突變導入法、階段性缺失基因制作法等的基因改變法，能將其氨基酸序列從天然型改變。另外，dhps的全部或一部分能根據(jù)公知的肽的化學合成法制造。關(guān)于肽合成，能使用作為當今或常規(guī)方法確立的液相肽合成法、或者，固相肽合成法制造。進而，一般而言，作為作為適宜的化學合成法識別的固相肽合成法，能使用boc固相法或fmoc固相法。特別是，合成長鏈時可使用連接法。作為如上述得到的dhps基因的其他用途，例如，可在將針對dhps的抗體由基因免疫法制造時利用。另外，能作為本發(fā)明的癌檢測方法中使用的核酸探針利用。再者，如上述得到的dhps可作為制造針對dhps的抗體時的免疫原、由自身抗體的檢測進行本發(fā)明的癌檢測方法時的自身抗體的結(jié)合場、再者，在本發(fā)明的癌檢測方法中的標準物質(zhì)等使用。針對dhps的抗體可使用常規(guī)的。即，可對于免疫動物給作為免疫原的dhps、或者，dhps基因，由此，作為多克隆抗體得到在免疫動物體內(nèi)生成的抗血清方法制造。另外，單克隆抗體可通過從上述免疫動物得到b細胞，制作基于其的雜交瘤，將其再給于宿主動物，由所述宿主動物得到。在如上述得到的dhps基因、dhps、及針對dhps的抗體中，也能根據(jù)需要進行適宜的修飾或處理。作為修飾，例如，可舉出熒光物質(zhì)、染料、酶、放射性物質(zhì)等的標記物質(zhì)的附加等，作為處理，例如，可舉出抗體的片段化等。關(guān)于上述的dhps基因的要素，能使用市售品。在市售品中，既有產(chǎn)品自不必說，也包括根據(jù)訂單制造的外訂品。(2)對于本發(fā)明的癌檢測方法1本發(fā)明的癌檢測方法1的特征在于，在受試試樣中確認dhps基因的表達，以所述基因表達的亢進作為指標檢測受試者的消化系統(tǒng)癌時，將作為目標基因的dhps基因的表達的確認通過以所述基因所編碼的dhps的全部或一部分(以下，在本發(fā)明的癌檢測方法中有時也總稱為dhpses)作為目標多肽檢測來進行。即，對受試試樣中的dhpses進行定量，當其定量值比至少未確認到消化系統(tǒng)癌者(以下，在本發(fā)明的癌檢測方法中也稱為消化系統(tǒng)癌健康者)的標準值大時，認定在受試試樣提供者中的dhps基因的表達的亢進，能以其作為指標檢測所述受試試樣提供者的消化系統(tǒng)癌。作為受試試樣，可使用血清受試體、血漿受試體、全血受試體等的血液受試體、再者尿受試體等，但適宜地是血液受試體。另外，血液受試體也可進行適宜適合的處理、例如肝素處理等。在受試試樣中的dhpses量的消化系統(tǒng)癌健康者的標準值通過設(shè)定推定為由一般的檢查確認不到消化系統(tǒng)癌的者的標本集團，求出在所述標本集團中的所述受試試樣的dhpses的定量值，對其實施統(tǒng)計處理而求出平均、標準偏差等，可含截止值而導出。在受試試樣中的dhpses的定量手段無特別限定，例如，使用與dhpses特異性結(jié)合的抗體、優(yōu)選為單克隆抗體進行的定量手段、具體而言，可舉出免疫沉降法、蛋白印跡法、免疫染色法、eia法、ria法、比濁法、散射比濁法、乳膠凝集比濁法、cleia法等。另外，也能使用tof-mass直接定量dhpses。在eia法中，特別適宜地是使用固定化抗體的elisa法。任何的定量手段均可使用以定量目標物質(zhì)作為受試試樣中的dhpses時的確立的手段進行。以下，對這些中的幾個簡單進行說明。在定量手段是elisa法時，例如，通過使受試試樣接觸于固定化在微平板上的針對dhps的抗體，使受試試樣中的dhpses與固定化抗體結(jié)合，使用酶標記的別的針對dhps的抗體等檢測與此固定化抗體結(jié)合的dhpses可進行定量。另外，也能使固定化抗體和受試試樣及酶標記抗體同時反應(yīng)，對受試試樣中的dhpses進行定量。在定量手段是免疫沉降法時，例如，可通過使受試試樣接觸于固定化在珠上的針對dhps的抗體而使dhpses與固定化抗體結(jié)合，分離與此固定化抗體結(jié)合的dhpses，從其分離物檢測dhpses來進行定量。進行此dhpses的由免疫沉降法的定量，例如，可對于上述的分離物進行電泳而使用使針對dhps的標記抗體作用于此電泳圖譜的轉(zhuǎn)印物，檢測dhpses的條帶的蛋白印跡法進行。再者，也能以定量手段作為以蛋白印跡法作為主體的方法。例如，將自受試試樣除去細胞的細胞除外受試試樣直接由電泳分離，使針對dhps的標記抗體作用于其轉(zhuǎn)印物，通過檢測條帶，可對受試試樣中的dhpses進行定量。在定量手段是乳膠凝集比濁法時，例如，通過使受試試樣接觸于與乳膠粒子結(jié)合的針對dhps的抗體，在液相中由抗原抗體反應(yīng)形成免疫復合物的凝集塊，測定其濁度的變化可進行定量。(3)對于本發(fā)明的癌檢測方法2本發(fā)明的癌檢測方法2的特征在于，在受試試樣中確認dhps基因的表達，以所述基因表達的亢進作為指標檢測受試者的消化系統(tǒng)癌時，將作為目標基因的dhps基因的表達的確認通過檢測針對受試試樣中的dhps的抗體(自身抗體)進行。即，對針對受試試樣中的dhps的自身抗體進行定量，當其定量值大于消化系統(tǒng)癌健康者的標準值時，認定在受試試樣提供者中的dhps基因的表達的亢進，能以其作為指標檢測所述受試試樣提供者的消化系統(tǒng)癌。作為受試試樣，可使用血清受試體、血漿受試體、全血受試體等的血液受試體、再者尿受試體等，但適宜地是血液受試體。另外，血液受試體也可進行適宜適合的處理、例如肝素處理等。在受試試樣中的dhps自身抗體量的消化系統(tǒng)癌健康者的標準值通過設(shè)定推定為由一般的檢查確認不到消化系統(tǒng)癌的者的標本集團，求出在所述標本集團中的所述受試試樣的dhps自身抗體的定量值，對其實施統(tǒng)計處理而求出平均、標準偏差等，可含截止值而導出。所述自身抗體的定量，例如，可通過使受試試樣接觸于含dhpses的多肽的固定化物，以針對受試試樣內(nèi)的dhps的抗體(自身抗體)與所述固定化多肽的結(jié)合作為信號檢測進行。具體而言，可使用間接熒光抗體法、elisa法、蛋白印跡法(免疫印跡法)、比濁法、散射比濁法、乳膠凝集比濁法、cleia法等的手段進行定量。任何的定量手段均可使用以定量目標物質(zhì)作為受試試樣中的dhps自身抗體時的確立的手段進行。例如，在間接熒光抗體法(fana)中，使受試試樣接觸于固定化了dhpses的蛋白陣列，使固定化dhpses和針對受試試樣中的dhps的抗體結(jié)合，對于形成的固定化dhpses-抗dhps抗體復合物，再者，使實施熒光標記的第二抗體接觸，可對針對dhps的自身抗體進行定量。在elisa法中，以在間接熒光抗體法中使用的第二抗體的標記作為酶標記進行定量。第二抗體的標記能多樣地選擇。在蛋白印跡法中，可通過將dhpses用sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳之后，從凝膠轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜等的載體，使受試試樣接觸于所述轉(zhuǎn)錄載體，使所述轉(zhuǎn)錄載體上的dhpses和針對受試試樣中的dhps的抗體的復合物形成，檢測所述復合物來進行定量。在比濁法或散射比濁法中，可通過將通過使受試試樣和dhpses接觸而形成的dhpses-抗dhps抗體復合物用濁度(比濁法)或散射光強度的變化(散射比濁法)檢測來進行定量。在乳膠凝集比濁法中，可通過使dhpses結(jié)合的乳膠粒子和受試試樣接觸，由與乳膠粒子結(jié)合的自身抗體彼此的相互作用形成所述乳膠粒子的凝集體，通過對其進行檢測來進行定量。在cleia法中，可通過使dhpses結(jié)合磁性粒子和受試試樣接觸，在磁性粒子上形成dhpses-抗dhps抗體復合物而進行集磁，除去未反應(yīng)物，實施適宜的熒光化處理等而檢測所述復合物而進行定量。(4)對于本發(fā)明的癌檢測方法3本發(fā)明的癌檢測方法3的特征在于，在受試試樣中確認dhps基因的表達，以所述基因表達的亢進作為指標檢測受試者的消化系統(tǒng)癌時，將作為目標基因的dhps基因的表達的確認通過以受試試樣中的dhps基因的全部或一部分、或者與所述基因互補的核酸作為目標核酸檢測進行。例如，對受試試樣中的編碼dhpses的mrna量進行定量，當其定量值大于消化系統(tǒng)癌健康者的標準值時，認定在受試試樣提供者中的dhpses基因的表達的亢進，能以其作為指標檢測所述受試試樣的提供者的消化系統(tǒng)癌。作為受試試樣，可使用血清受試體、血漿受試體、全血受試體等的血液受試體、再者尿受試體等，但適宜地是血液受試體。另外，血液受試體也可進行適宜適合的處理、例如肝素處理等。成為受試試樣中的編碼dhpses的mrna量檢測的基礎(chǔ)的核酸可通過將受試試樣中的rna由常規(guī)方法提取，對其進行向dna的逆轉(zhuǎn)錄而作為cdna得到。對于所述cdna，通過進行使用用于擴增dhpses基因的基因擴增用引物的pcr法等的基因擴增方法(rt-pcr法)，掌握顯示成為其基礎(chǔ)的mrna量的程度，例如，在特定的循環(huán)數(shù)的基因擴增手段中的dhpses基因的拷貝數(shù)或，dhpses基因的拷貝數(shù)的增加速度等，可掌握受試試樣中的dhpses基因的表達量。所述目標核酸的檢測，例如，可通過使有與所述目標核酸的堿基序列互補的序列的核酸核酸探針與固定化的或者未固定化的作為基因擴增產(chǎn)物得到的目標核酸雜交，檢測由所述雜交發(fā)生的信號來進行。所述信號的檢測，例如，可由dna印跡法進行。再者，可由使用rt-pcr法的實時分析等進行本發(fā)明的癌檢測方法3的一系列的工序。(5)本發(fā)明的癌檢測用試劑盒本發(fā)明的癌檢測用試劑盒是具備用于如上所述進行本發(fā)明的癌檢測方法的要素的試劑盒。所述癌檢測用試劑盒的內(nèi)容隨本發(fā)明的癌檢測方法的實施方式，或目的、對于將何程度試劑盒化的意圖等而不同。例如，在用于進行本發(fā)明的癌檢測方法1的癌檢測用試劑盒中，作為用于進行elisa法的試劑盒的構(gòu)成可舉出，具備以針對dhps的抗體作為第一抗體固定化的板、進行標記的第二抗體、用于使第二抗體的標記顯現(xiàn)的試劑的實施方式。另外，作為用于進行乳膠凝集比濁法的試劑盒構(gòu)成可舉出，使針對dhps的抗體結(jié)合的乳膠粒子。再者，作為用于進行cleia法的試劑盒構(gòu)成可舉出，具備使針對dhps的抗體結(jié)合的磁性粒子、進行標記的第二抗體、用于使第二抗體的標記顯現(xiàn)的試劑的實施方式。其中舉的這些構(gòu)成被充分例示，用于進行本發(fā)明的癌檢測方法1的其他實施方式的試劑盒也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。再者，也能以進一步減少其中例示的上述的要素的構(gòu)成，增加檢查的外訂或自身籌備的程度的方式設(shè)定，相反，也能以稀釋液或試劑用的管等作為構(gòu)成增加，設(shè)定癌檢測用試劑盒的即時使用。另外，也能考慮根據(jù)具體的檢查實施方式的其他要素。另外，在用于進行本發(fā)明的癌檢測方法2的癌檢測用試劑盒中，作為用于進行fana法或elisa法的試劑盒的構(gòu)成可舉出，例如，具備固定化dhpses的板、進行標記的針對自身抗體的第二抗體、用于使第二抗體的標記顯現(xiàn)的試劑的實施方式。另外，作為用于進行乳膠凝集比濁法的試劑盒構(gòu)成可舉出，使dhpses結(jié)合的乳膠粒子。再者，作為用于進行cleia法的試劑盒構(gòu)成可舉出，具備使dhpses結(jié)合的磁性粒子、進行標記的針對自身抗體的第二抗體、用于使第二抗體的標記顯現(xiàn)的試劑的實施方式。其中舉的這些構(gòu)成被充分例示，用于進行本發(fā)明的癌檢測方法2的其他實施方式的試劑盒也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。再者，也能以進一步減少其中例示的上述的要素的構(gòu)成，增加檢查的外訂或自身籌備的程度的方式設(shè)定，相反，也能以稀釋液或試劑用的管等作為構(gòu)成增加，設(shè)定癌檢測用試劑盒的即時使用。另外，也能考慮根據(jù)具體的檢查實施方式的其他要素。再者，在用于進行本發(fā)明的癌檢測方法3的癌檢測用試劑盒中，作為試劑盒的構(gòu)成可舉出，例如，用于逆轉(zhuǎn)錄mrna的逆轉(zhuǎn)錄酶和逆轉(zhuǎn)錄用引物、用于擴增編碼dhpses的cdna的基因擴增用引物、用于檢測基因擴增產(chǎn)物的核酸探針、用于使所述核酸探針的信號顯現(xiàn)的試劑等。其中舉的這些構(gòu)成被充分例示，用于進行本發(fā)明的癌檢測方法3的其他實施方式的試劑盒也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。再者，也能以進一步減少其中例示的上述的要素的構(gòu)成，增加檢查的外訂或自身籌備的程度的方式設(shè)定，相反，也能以稀釋液或試劑用的管等作為構(gòu)成增加，設(shè)定癌檢測用試劑盒的即時使用。另外，也能考慮根據(jù)具體的檢查實施方式的其他要素?！緦嵤├恳韵?，公開本發(fā)明的實施例。[a]對于本發(fā)明的動脈硬化檢測方法[參考例]dhps作為動脈硬化標志物的篩選(1)使固定化了約8000種蛋白質(zhì)的蛋白陣列與動脈硬化患者和健康人的血清受試體接觸，將在所述受試體中存在的動脈硬化患者特有的自身抗體由間接熒光抗體法檢測。結(jié)果，特別指定約150種候選自身抗體，它們的候選自身抗體之一是針對dhps的血清中的自身抗體。其中使用的動脈硬化患者的血清受試體是從接受醫(yī)院及研究合作設(shè)施的診斷的頸動脈狹窄癥患者得到的。再者，在上述患者的評價中，從外來受診者之中，選擇性別－年齡(±5歲)與動脈硬化患者一致的大致同數(shù)的正常受試者作為基準(對照)。在外來受診時或住院時，(1)向本人、家族說明研究目的或研究合作的任意性等，在得到知情同意之上，(2)進行關(guān)于家族歷－既往歷－飲酒或吃煙等生活方式、作業(yè)實施方式的問診，(3)進行采血而將血清和血細胞成分分離冷凍保存。再者，(4)基于醫(yī)師的診療錄，記錄臨床上重癥度、治療經(jīng)過、血液檢查所見等。解析對象的患者血液在血清分離后于負80度冷凍保存至研究開始。關(guān)于此受試者的處理在后述的例中也基本上是同樣的。(2)在以下，對于上述的約150種候選自身抗體進行由elisa法的篩選。在對于這些每種候選自身抗體實施elisa法之前，含dhps的約150種抗原蛋白質(zhì)經(jīng)下述的工序作為重組蛋白質(zhì)得到。首先，由pcr法制作插入子。即，預先制作具有適宜于向表達載體pet28或pgex-4t的重組的限制性內(nèi)切酶識別部位的引物，以從骨肉瘤細胞株u2-os提取的rna作為模板進行逆轉(zhuǎn)錄pcr而制作cdna，再進行pcr而得到全長的插入子。對此插入子及表達載體進行限制性內(nèi)切酶處理，使用ligation-convenience試劑盒(日本gene公司)，連接插入子和表達載體，制作含插入子的質(zhì)粒。再者，使用大腸桿菌感受態(tài)細胞bl21(日本gene公司)轉(zhuǎn)化到重組體中。將此轉(zhuǎn)化體用放入抗生物質(zhì)的lb培養(yǎng)基培養(yǎng)，用iptg誘導插入子dna來源蛋白質(zhì)的表達。將此狀態(tài)的轉(zhuǎn)化的大腸桿菌離心分離回收后，分離為可溶級分和不溶級分，再使用尿素進行不溶級分的增溶。蛋白質(zhì)使用probond樹脂(invitrogen公司)及谷胱甘肽-sepharose(gehealthcare公司)純化。通過將這樣得到的各種的純化重組蛋白質(zhì)以5μg/ml的濃度注入96孔elisa板，于4℃保存一晚而固定化，得到固定化了在elisa法中使用的重組蛋白質(zhì)的96孔板。在elisa法中，將此重組蛋白質(zhì)固定化板用pbs清洗、用20％糖20％合成聚合物(日本油脂公司)配合溶液封閉后，將患者血清、及對照血清(健康者的血清)稀釋200倍，與固定化的蛋白質(zhì)反應(yīng)，接下來，pbs清洗后，加hrp標記山羊抗人igg抗體。在最后，加酶顯色底物而顯色，用板讀取器測定od450nm的吸收。通過由此elisa法的篩選，從約150種的候選自身抗體(抗原蛋白質(zhì))篩出約40種，在這些之中含作為本發(fā)明的主題的dhps。以下，實際上，也并行進行對于dhps以外的自身抗體的探討，其中僅關(guān)于dhps進行公開。[實施例a-1]由elisa法的自身抗體的探討經(jīng)3次進行由elisa法的探討。(a)由elisa法的自身抗體的探討(1)在醫(yī)療設(shè)施a中，使用急性期腦梗塞患者78例和健康人51例的血清受試體。結(jié)果示于圖1和圖2。圖1顯示在患者組(患者)和健康人組(正常)中的dhps的自身抗體的抗體價的分布，圖2顯示在本探討中的roc曲線(接收者動作特性曲線)?；趫D1及圖2，由檢驗導致的結(jié)果示于表1。如表1所示，截止值約是0.69，在圖1中以虛線顯示?！颈?】p值比0.05(0.01)小，確認了關(guān)于“dhps的血清抗體價在動脈硬化患者組中比健康人組大”的顯著差異。另外，在上述截止值中的陽性率約是69％。(b)由elisa法的自身抗體的探討(2)使用醫(yī)療設(shè)施b的急性期腦梗塞患者111例和醫(yī)療設(shè)施c的急性期腦梗塞患者46例(計157例)和醫(yī)療設(shè)施a的健康人51例的血清受試體。結(jié)果示于圖3和圖4。圖3顯示在患者組(患者)和健康人組(正常)中的dhps的自身抗體的抗體價的分布，圖4顯示在本探討中的roc曲線(接收者動作特性曲線)。基于圖3及圖4，由檢驗導致的結(jié)果示于表2。如表2所示，截止值約是0.69，在圖3中以虛線表示?！颈?】p值遠小于0.05(0.01)，確認了關(guān)于“dhps的血清抗體價在動脈硬化患者組中比健康人組大”的顯著差異。另外，在上述截止值中的陽性率約是73％。(c)由elisa法的自身抗體的探討(3)在本例中，進行對于既有的動脈硬化標志物的陽性組和陰性組中的dhps自身抗體標志物的動向的探討。作為既有的動脈硬化標志物，使用crp。crp(c-reactiveprotein)是急性期蛋白質(zhì)(acutephasereactant：apr)的一種，是在1930年由tillet等發(fā)現(xiàn)的從肺炎雙球菌提取的c多糖體和引起沉降反應(yīng)的血清蛋白質(zhì)。近年，已知伴隨動脈硬化的血管組織的炎癥、且由從浸潤到動脈硬化巢的炎癥性細胞分泌的炎癥性細胞因子導致crp在肝臟中產(chǎn)生而增加，再者，其濃度與血管內(nèi)皮的功能障礙的程度相關(guān)，其增加引起心絞痛或作為心肌梗塞的危險因子(ridkerpm:circulation103:1813,2002)。在本例中的crp測定的受試體使用從醫(yī)療設(shè)施a得到的83例(急性期腦梗塞患者65例和健康人18例)的血清受試體。對于這些全部血清受試體，使用c反應(yīng)性蛋白試劑盒(nanopia積水medical公司制)由乳膠凝集比濁法進行crp的測定，以crp的截止值作為0.2mg/dl分類。即，將crp值超0.2mg/dl的組作為“crp動脈硬化風險組”，將0.2mg/dl以下的組作為“crp動脈硬化非風險組”分類。由這些crp的分類別地分上述患者組和健康人組，將針對這些血清受試體中的dhps的自身抗體價由elisa法測定。結(jié)果示于圖5，再者0.2mg/dl以下的“crp動脈硬化非風險組”的roc曲線示于圖6。p值是0.003，明顯小于0.05(0.01)。另外，陽性率是46％。從而確認，在crp值中，通過在被認為動脈硬化風險小的組中也進行由dhps的動脈硬化的測試，能伴隨顯著差異而檢測動脈硬化。在“crp動脈硬化風險組”中，由于正常組的受試體數(shù)少而未進行顯著差異檢驗，但從圖5一目了然，在此組中，也是dhps的自身抗體的定量對于動脈硬化的檢測有效。[實施例a-2]由蛋白印跡法的自身抗體的探討用上述參考例(2)中所示的方法制作插入子，得到基于其的純化蛋白質(zhì)。即，預先制作具有適宜于向表達載體pet28或pgex-4t的重組的限制性內(nèi)切酶識別部位的引物，以從骨肉瘤細胞株u2-os提取的rna作為模板進行逆轉(zhuǎn)錄pcr而制作cdna，再進行pcr而得到全長的插入子。對此插入子及表達載體進行限制性內(nèi)切酶處理，使用ligation-convenience試劑盒(日本gene公司)，連接插入子和表達載體，制作含插入子的質(zhì)粒。進而，使用大腸桿菌感受態(tài)細胞bl21(日本gene公司)轉(zhuǎn)化到重組體中。將此轉(zhuǎn)化體用放入抗生物質(zhì)的lb培養(yǎng)基培養(yǎng)，用iptg誘導插入子dna來源蛋白質(zhì)的表達。對此狀態(tài)的轉(zhuǎn)化的大腸桿菌進行離心分離回收后，分離為可溶級分和不溶級分，再者使用尿素進行不溶級分的增溶。蛋白質(zhì)使用probond樹脂(invitrogen公司)及谷胱甘肽-sepharose(gehealthcare公司)純化。將此純化的蛋白質(zhì)用sds樣品緩沖液變性，作為蛋白印跡法的樣品。在12％聚丙烯酰胺凝膠上電泳上述樣品后，用轉(zhuǎn)印裝置向硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)印蛋白質(zhì)。用5％脫脂乳封閉后，作為第一抗體加稀釋500倍的患者血清(受試體1～4)，溫育一夜。用pbst清洗后，加稀釋20000倍的hrp標記山羊抗人igg抗體(ab98633,abcam公司)，反應(yīng)30分鐘。用pbst清洗后，使用發(fā)光試劑immobilonwestern(millipore公司)發(fā)光，向膜曝光而顯像。結(jié)果示于圖7的電泳圖。在圖7中，受試體1、2、3、4是從醫(yī)療設(shè)施a提供的急性期腦梗塞患者的血清受試體，蛋白質(zhì)his-dhps(a.a.184-369)的elisa測定值(自身抗體)是，受試體1是3.61、受試體2是3.82、受試體3是3.61、受試體4是3.47。另外，蛋白質(zhì)gst-dhps(a.a.183-369)的elisa測定值(自身抗體)是，受試體1是3.60、受試體2是2.64、受試體3是2.33、受試體4是2.46。下述表3-1～表3-4顯示以各膜標志物75kda的條帶強度作為“1”時的檢測條帶強度的比率。表3-1是對于受試體1的結(jié)果，表3-2是對于受試體2的結(jié)果，表3-3是對于受試體3的結(jié)果，表3-4是對于受試體4的結(jié)果。另外，在表中，將蛋白質(zhì)his-dhps(a.a.184-369)表示為his-36c，將蛋白質(zhì)gst-dhps(a.a.183-369)表示為gst-36c。【表3-1】u175kda標志物1.00u2gst-36c3.19u3his-36c8.08【表3-2】u175kda標志物1.00u2gst-36c1.20u3his-36c4.52【表3-3】u175kda標志物1.00u2gst-36c0.49u3his-36c5.29【表3-4】u175kda標志物1.00u2gst-36c0.12u3his-36c2.46從上述的結(jié)果得知，作為急性期腦梗塞患者受試體血清的受試體1、受試體2、受試體3、及，受試體4中的自身抗體與蛋白質(zhì)his-dhps(a.a.184-369)示強的反應(yīng)性。蛋白印跡的結(jié)果，確認目的條帶與自身抗體反應(yīng)。另外，由此時的條帶的強度確認，由elisa法示越高的測定值的受試體，示越高的與蛋白質(zhì)his-dhps(a.a.184-369)的反應(yīng)性。接下來，將對于在這些受試體中內(nèi)源性(endogenos)的dhps的存在的探討由使用抗dhps抗體的蛋白印跡探討。具體而言，將his-dhps(seqidno:1的a.a.1-369)蛋白質(zhì)(陽性對照)、及患者的血清受試體(受試體1～4)用sds樣品緩沖液變性，作為蛋白印跡法的樣品。在10％聚丙烯酰胺凝膠上電泳上述樣品后，用轉(zhuǎn)印裝置向硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)印蛋白質(zhì)。用5％脫脂乳封閉后，加稀釋500倍的抗dhps抗體(h00001725-b02p,abnova公司)而作為第一抗體，溫育一夜。用pbst清洗后，加稀釋7500倍的hrp標記綿羊抗小鼠igg抗體(na931,gehealthcare公司)，反應(yīng)30分鐘。用pbst清洗后，使用發(fā)光試劑immobilonwestern(millipore公司)發(fā)光，向膜曝光而顯像。結(jié)果示于圖8的電泳圖。由此，對于全部受試體確認了提示內(nèi)源性的dhps的存在的條帶，強列提示在血中的內(nèi)源性的dhps的存在。[b]對于本發(fā)明的癌檢測方法[實施例b-1]由elisa法的自身抗體的探討(1)探討方法dhps的自身抗體的抗原蛋白質(zhì)經(jīng)下述的工序而作為重組蛋白質(zhì)得到。首先，由pcr法制作插入子。即，預先制作具有適宜于向表達載體pet28或pgex-4t的重組的限制性內(nèi)切酶識別部位的引物，以從骨肉瘤細胞株u2-os提取的rna作為模板進行逆轉(zhuǎn)錄pcr而制作cdna，再進行pcr而得到全長的插入子。對此插入子及表達載體進行限制性內(nèi)切酶處理，使用ligation-convenience試劑盒(日本gene公司)，連接插入子和表達載體，制作含插入子的質(zhì)粒。再者，使用大腸桿菌感受態(tài)細胞bl21(日本gene公司)轉(zhuǎn)化到重組體中。將此轉(zhuǎn)化體用放入抗生物質(zhì)的lb培養(yǎng)基培養(yǎng)，用iptg誘導插入子dna來源蛋白質(zhì)的表達。對此狀態(tài)的轉(zhuǎn)化的大腸桿菌進行離心分離回收后，分離為可溶級分和不溶級分，再使用尿素進行不溶級分的增溶。蛋白質(zhì)使用probond樹脂(invitrogen公司)及谷胱甘肽-sepharose(gehealthcare公司)純化。通過將這樣得到的各種的純化重組蛋白質(zhì)以10μg/ml的濃度注入96孔elisa板，于4℃保存一晚，固定化而得到固定化了在elisa中使用的重組蛋白質(zhì)的96孔板。在elisa法中，將此重組蛋白質(zhì)固定化板用pbs清洗、用10％牛胎兒血清pbs溶液封閉后，將患者血清及對照血清(健康者的血清)稀釋2000倍，與固定化的蛋白質(zhì)反應(yīng)，接下來，pbs清洗后，加hrp標記山羊抗人igg抗體。在最后，加酶顯色底物而顯色，用板讀取器測定od450nm的吸收。(2)由elisa法的自身抗體的探討在醫(yī)療設(shè)施d中，使用食道癌患者61例和大腸癌患者19例(癌患者計80例)、而且，醫(yī)療設(shè)施a的健康人51例的血清受試體。結(jié)果示于圖9和圖10。圖9顯示在患者組(患者)和健康人組(正常)中的dhps的自身抗體的抗體價的分布，圖10顯示在本探討中的roc曲線(接收者動作特性曲線)?；谏鲜鰣D9和圖10，由檢驗導致的結(jié)果示于表4。如表4所示，截止值約是0.69，在圖9中以虛線表示?！颈?】p值小于0.05，確認了關(guān)于“dhps的血清抗體價在大腸癌和食道癌的患者組中比健康人組大”的顯著差異。另外，在上述截止值中的陽性率是80％左右。?序列表<110>fujikurakaseico.,ltd.nationaluniversitycorporationchibauniversity<120>以脫氧羥腐胺縮賴氨酸合酶基因作為指標使用的動脈硬化及癌的檢測方法<130>pfkk3pct<150>jp2014-226847<151>2014-11-07<160>2<170>patentinversion3.5<210>1<211>369<212>prt<213>智人（homosapiens）<400>1metgluglyserleugluargglualaproalaglyalaleualaala151015valleulyshisserserthrleuproprogluserthrglnvalarg202530glytyrasppheasnargglyvalasntyrargalaleuleugluala354045pheglythrthrglypheglnalathrasnpheglyargalavalgln505560glnvalasnalametileglulyslysleugluproleuserglnasp65707580gluaspglnhisalaaspleuthrglnserargargproleuthrser859095cysthrilepheleuglytyrthrserasnleuileserserglyile100105110arggluthrileargtyrleuvalglnhisasnmetvalaspvalleu115120125valthrthralaglyglyvalglugluaspleuilelyscysleuala130135140prothrtyrleuglyglupheserleuargglylysgluleuargglu145150155160asnglyileasnargileglyasnleuleuvalproasngluasntyr165170175cyslysphegluasptrpleumetproileleuaspglnmetvalmet180185190gluglnasnthrgluglyvallystrpthrproserlysmetileala195200205argleuglylysgluileasnasnprogluservaltyrtyrtrpala210215220glnlysasnhisileprovalpheserproalaleuthraspglyser225230235240leuglyaspmetilephephehissertyrlysasnproglyleuval245250255leuaspilevalgluaspleuargleuileasnthrglnalailephe260265270alalyscysthrglymetileileleuglyglyglyvalvallyshis275280285hisilealaasnalaasnleumetargasnglyalaasptyralaval290295300tyrileasnthralaglnglupheaspglyseraspserglyalaarg305310315320proaspglualavalsertrpglylysileargvalaspalaglnpro325330335vallysvaltyralaaspalaserleuvalpheproleuleuvalala340345350gluthrphealaglnlysmetaspalaphemethisglulysasnglu355360365asp<210>2<211>1110<212>dna<213>智人（homosapiens）<400>2atggaaggttccctggaacgggaggcgccagcgggggcgctggccgccgtgctaaagcac60agctcgacgttgccgcccgaaagcacccaggtccggggctacgacttcaaccgcggtgtg120aattaccgcgcactgctggaggccttcggcaccaccggcttccaagcaaccaacttcggg180cgcgctgtacagcaagtcaatgccatgatcgagaagaagctggaaccactgtcacaggat240gaagaccagcacgcggacctgacccagagccgccgcccacttaccagctgcaccattttc300ctgggatatacatccaacctcatcagttcaggcatccgtgagaccattcgctaccttgtg360cagcacaacatggtggacgtattggtgaccacagctggcggcgtggaggaagacctcatc420aagtgcctggcgcccacatacttgggcgagtttagcctcagggggaaggagctccgggag480aacgggatcaataggatcggaaacctgctggtgcccaatgagaattactgcaagtttgag540gactggctgatgcccattctggaccagatggtgatggagcagaacacagagggtgtaaag600tggacgccttctaagatgatcgcccggctgggcaaggagatcaacaacccagagtccgtg660tattactgggcccagaagaaccacatccctgtgtttagtcccgcacttacagacggctcg720ctgggcgacatgatcttcttccattcctacaagaacccgggcctggtcctggacatcgtt780gaggacctgaggctcatcaacacacaggccatctttgccaagtgcactgggatgatcatt840ctgggcgggggcgtggtcaagcaccacattgccaatgccaacctcatgcggaacggggcc900gactacgctgtttacatcaacacagcccaggagtttgatggctctgactcaggtgcccga960ccagacgaggctgtctcctggggcaagatccgggtggatgcacagcccgtcaaggtctat1020gctgacgcctccctggtcttccccctgcttgtggctgaaacctttgcccagaagatggat1080gccttcatgcatgagaagaacgaggactga1110當前第1頁12