本申請作為PCT國際專利申請?zhí)峤挥?015年9月11日，并且要求于2014年10月3日提交的美國專利申請序列號62/059,684的優(yōu)先權(quán)，并要求于2014年9月12日提交的美國專利申請序列號62/049,970的優(yōu)先權(quán)，這兩份專利申請的公開內(nèi)容全文以引用方式并入本文。
技術(shù)領(lǐng)域：
本公開涉及用于確定細胞中的細胞血紅蛋白的年齡和/或紅細胞的平均年齡的系統(tǒng)和方法。
背景技術(shù)：
：已通過測量鉻51標記的紅細胞的體內(nèi)清除率而導(dǎo)出紅血細胞的壽命(參見Gray,S.J.andStirling,K.1950,J.Clin.Invest.29:1604-1613(Gray,S.J.和Stirling,K.，1950年，《臨床研究雜志》，第29卷，第1604-1613頁)的綜述；DacieandLewis；PracticalHaematology,NinthEdition,2001,Ed.；S.M.Lewis,B.J.BainandI.Bates,Publ.ChurchillLivingstone(Dacie與Lewis《實用血液病學(xué)》，第九版，2001年，S.M.Lewis、B.J.Bain和I.Bates編輯，丘吉爾利文斯通出版))。該程序是侵入性的且較繁瑣，并未廣泛使用。已開發(fā)了其他技術(shù)來非侵入性地測量紅血球的壽命，包括對呼氣中一氧化碳的測量(M.A.Virtueetal.2004,DiabetesCare；vol.27No4pp931-935(M.A.Virtue等人，2004年，《糖尿病醫(yī)療》，第27卷，第4期，第931-935頁))、對紅細胞的密度離心(BorunER,etal.JClinInvest36:676,1957(BorunER等人，《臨床研究雜志》，第36卷，第676頁，1957年))以及對紅細胞的細胞表面上的CD35的流式細胞術(shù)測量(Lach-Trifilieffetal.1999,Journal.Immunol.162,(12):7549(Lach-Trifilieff等人，1999年，《免疫學(xué)雜志》，第162卷，第12期，第7549頁))。然而，這些技術(shù)都未顯示出能恒定地提供對紅細胞的壽命或平均年齡的確定。因此希望開發(fā)用于確定細胞血紅蛋白的年齡和/或紅血細胞的平均年齡的系統(tǒng)和方法。技術(shù)實現(xiàn)要素：本文所述的系統(tǒng)、方法、試劑盒和組合物提供了以逐個細胞為基礎(chǔ)確定HbA1c的百分比的能力，提供了對紅血細胞的群體或亞群的年齡概況的確定，提供了對紅血細胞的平均年齡的確定，提供了對紅血細胞的壽命的確定，并且提供了對估計葡萄糖含量的確定。單份血樣的分析可提供此前100到約120天的信息。對細胞群體或亞群的年齡概況的確定可用于監(jiān)測糖尿病以及其他涉及血液葡萄糖的疾病。對細胞群體或亞群的年齡概況的確定可用于監(jiān)測貧血以及其他涉及紅血細胞血紅蛋白含量的疾病。在實施例中，可檢測在過去100到約120天進行的輸血。參見圖13。在一個方面，本公開涉及這樣的系統(tǒng)和方法，其用于通過確定HbA1c的百分比來確定血樣的獨立紅血細胞中的細胞血紅蛋白的年齡。另一個方面涉及確定樣品中的紅血細胞的平均年齡。所述方法和系統(tǒng)可用于監(jiān)測受試者中的糖尿病或貧血、輸血的存在和/或出血事件的存在的方法。所述系統(tǒng)和方法也可用于監(jiān)測糖尿病或貧血的進展或改善。在一個方面，本公開提供了用于確定樣品中的紅血細胞的年齡的試劑盒和試劑。在實施例中，用于確定樣品中的紅血細胞群體的年齡概況的試劑盒包含：a)特異性地結(jié)合HbA1C或其變體的抗體或其抗原結(jié)合片段；b)特異性地結(jié)合于RNA的染料；以及c)紅血細胞參考對照樣品。在一些實施例中，紅血細胞參考對照細胞具有已知百分比的HbA1C。在其他實施例中，參考對照細胞是正常對照樣品，諸如取自未患有糖尿病或貧血的受試者。在其他實施例中，參考對照細胞取自患有糖尿病且HbA1C值已知的受試者。在實施例中，抗體或抗原結(jié)合片段被可檢測地標記。在實施例中，特異性地結(jié)合于RNA的染料是吖啶橙。在實施例中，該試劑盒還可包含用于透化紅血細胞的試劑。在其他實施例中，試劑盒還包含計算機可讀介質(zhì)，該計算機可讀介質(zhì)包含用于確定如本文所述樣品中的紅血細胞的年齡和/或密度的指令。在另一個方面，本公開提供了用于確定樣品中的紅血細胞的年齡和/或密度的系統(tǒng)。在實施例中，用于確定紅血細胞群體的年齡的系統(tǒng)包括獨立紅血細胞的側(cè)向散射和熒光的檢測器；利用獨立紅血細胞在至少一個波長處測得的熒光及測得的側(cè)向散射來得出百分比HbA1c含量的計算器；使用網(wǎng)織紅細胞HbA1c的平均百分比將紅血細胞群體分成多個級分的分配器，每個級分包含基本上相等數(shù)量的紅血細胞；每份樣品的壽命系數(shù)的計算器；以及樣品各級分的年齡的計算器。在其他實施例中，該系統(tǒng)還包括樣品的平均年齡的計算器，并且將樣品的平均年齡與正常對照樣品的平均年齡相比較。在再其他實施例中，該系統(tǒng)還包括特定年齡的細胞的平均細胞血紅蛋白的計算器，并且確定平均細胞血紅蛋白是否會根據(jù)細胞的年齡而變化。在其他實施例中，本公開提供了包括非臨時性計算機可讀介質(zhì)的系統(tǒng)，該非臨時性計算機可讀介質(zhì)具有用于執(zhí)行包括以下的方法步驟的指令：確定樣品中每個獨立紅血細胞的血紅蛋白、HbA1c和RNA含量；利用每個獨立紅血細胞的HbA1c含量和血紅蛋白含量來確定每個獨立細胞中的HbA1c的百分比；通過將樣品的獨立細胞中的HbA1c的百分比與樣品的參考細胞級分的HbA1c的平均百分比相比較，來將紅血細胞群體分級成多個級分，每個級分包含基本上相等數(shù)量的紅血細胞；確定每個級分中的HbA1c的平均百分比，并且通過將HbA1c的平均百分比與參考對照細胞或參考對照級分的HbA1c的平均百分比相比較，來識別該級分中的紅血細胞的年齡。在實施例中，該系統(tǒng)還包括與參考對照細胞的相同級分相比，確定樣品中屬于特定HbA1c百分比的級分的紅血細胞的密度。在實施例中，參考對照細胞具有至少28天的平均年齡。本公開的另一個方面提供了確定樣品中的紅血細胞的年齡和/或密度的方法。在實施例中，用于確定血樣中的紅血細胞群體的年齡概況的方法包括：測量該群體中的每個獨立紅血細胞的血紅蛋白和HbA1c含量；利用每個獨立紅血細胞的HbA1c含量和血紅蛋白含量來確定每個獨立細胞中的HbA1c的百分比；通過將獨立細胞中的HbA1c的百分比與參考細胞級分的HbA1c的平均百分比相比較，來將紅血細胞群體分級成多個級分，每個級分包含基本上相等數(shù)量的紅血細胞；確定每個級分中的HbA1c的平均百分比，并且通過將HbA1c的平均百分比與參考對照級分或參考對照細胞的HbA1c的平均百分比相比較，來識別該級分中的紅血細胞的年齡。在再其他實施例中，該方法還包括與參考對照細胞的相同級分相比，確定樣品中屬于特定HbA1c百分比的級分的紅血細胞的密度。在再其他實施例中，該方法還包括從每個級分收集數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)包括樣品中紅血細胞的確切數(shù)量、網(wǎng)織紅細胞級分的平均HbA1c以及每個級分中每個獨立紅血細胞以熒光和側(cè)向散射單位計的值。在實施例中，在本文所述方法中，通過側(cè)向散射來測量每個獨立紅血細胞的血紅蛋白。在實施例中，使用對HbA1c或其變體具有特異性的、可檢測地標記的抗體來測量HbA1c。例如，該標記物是熒光部分。在實施例中，該方法還包括測量獨立細胞中的RNA含量，其中RNA的存在將細胞識別為網(wǎng)織紅細胞。在一個實施例中，通過結(jié)合于染料諸如吖啶橙來測量RNA。在實施例中，參考細胞級分或?qū)φ占毎荋bA1c百分比已知的細胞，諸如網(wǎng)織紅細胞。在實施例中，參考對照級分是待分析的樣品中的內(nèi)部細胞類型。在實施例中，參考對照細胞具有至少28天的平均年齡。在其他實施例中，該方法還包括確定紅血細胞群體的年齡概況與參考細胞群體的年齡概況相比是否包括更多數(shù)量的較老細胞，由此指示病情或病情的狀態(tài)。在一個實施例中，該病情是糖尿病。在實施例中，該方法還包括確定樣品中的細胞的平均年齡，并且將該平均年齡與正常對照樣品的平均年齡相比較，其中平均年齡的差異指示疾病或疾病的狀態(tài)。在一個實施例中，該病情是糖尿病。在再其他實施例中，該方法還包括確定樣品中具有特定年齡的級分的平均細胞血紅蛋白含量，并且確定不同年齡的級分中是否存在平均細胞血紅蛋白含量的差異。在實施例中，該差異指示貧血、出血或輸血。附圖說明圖1(A)示出了由取自正常受試者的人血樣得出的流式細胞術(shù)數(shù)據(jù)的圖形表示；FL4(675nm)熒光線性標度對FL1(525nm)熒光對數(shù)標度；區(qū)域A；對照細胞。區(qū)域B；紅血細胞網(wǎng)織紅細胞。區(qū)域C；成熟紅血細胞。紅血細胞標記有FluorAlexa647偶聯(lián)的抗HbA1c抗體和吖啶橙。該測定法中包括的是此前標記有羧基熒光素琥珀酰亞胺酯的對照細胞。對照細胞源自糖尿病患者。在FC500流式細胞儀上測量熒光FL1(525nm)和FL4(675nm)。圖1(B)是在圖1A、區(qū)域C中所示的分析中獲得的數(shù)據(jù)的表示。細胞事件繪制在橫坐標上，該橫坐標表示FL4/SS或HbA1c百分比的任意值。使用該程序，將細胞群體分成包含大約等量細胞的十個級分。這些級分的平均值在HbA1c百分比軸上指示。圖1(C)是如在圖1A、區(qū)域B中獲得的網(wǎng)織紅細胞群體的分析的表示。網(wǎng)織紅細胞在FL4示意圖中表示。具有相對較高水平HbA1c的細胞被排除在該群體之外。圖2(A)是不同血液裂解物對于抗HbA1c抗體結(jié)合于通透的紅細胞的百分比抑制的圖形表示。圖2(B)是流式細胞術(shù)HbA1c百分比測定值的標準曲線，示出了HbA1c百分比與FL4/SS值的相關(guān)性；橫坐標；120個樣品的預(yù)期IFCCHbA1c百分比值；縱坐標；相同120個樣品的流式細胞術(shù)FL4/SS值。就背景和補償對FL4值進行修正，并除以側(cè)向散射。使用內(nèi)部對照值將FL4/SS值歸一化。圖2(C)是流式細胞術(shù)HbA1c百分比測定值在用公式I進行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換之后的標準曲線。如實例2中所述的那樣使用公式I來轉(zhuǎn)換歸一化的FL4/SS值。120個樣品的轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)如圖2B中那樣表示。圖3(A)是每個級分的IFCCHbA1c百分比的圖形表示。如實例3中所述的那樣從正常人受試者獲得FL4/SS級分，并如圖1中所示的那樣進行分析。這些級分如表1中所示并被賦予了1至10的值，R表示網(wǎng)織紅細胞。對于每個級分而言，將平均FL4/SS值轉(zhuǎn)換成如表1中所示的IFCCHbA1c百分比值。圖3(B)是IFCCHbA1c百分比在時間軸上變化的圖形表示。級分界限值向時間的轉(zhuǎn)換示于表1中。圖3(C)是IFCCHbA1c百分比在年齡軸上的圖形表示。年齡以負值的天數(shù)表示。圖3(D)是導(dǎo)出的IFCC百分比HbA1c值對年齡的圖形表示。圖3C的求導(dǎo)得到常數(shù)值(參見表1)。該值已被歸一化為參考樣品的實測平均IFCCHbA1c百分比。圖3(E)是每個級分的級分大小的圖形表示。如表1中所示的那樣計算以IFCCHbA1c百分比單位表示的級分大小。圖3(F)是血液循環(huán)中所呈現(xiàn)的細胞的百分比在年齡軸上的圖形表示。該百分比的計算結(jié)果在表1中給出。圖4提供了模擬正常受試者的血液葡萄糖濃度短暫上升的效應(yīng)的圖形表示；(A)；如圖3B中那樣呈現(xiàn)并如實例3和表1中那樣確定的正常受試者的HbA1c曲線；(B)；與(A)中一樣，但存在血液葡萄糖濃度的短暫上升；(C)；與(B)中一樣，但如實例5和表3中所述的那樣確定。圖5(A)是在樣品采集之前30天的時間段內(nèi)平均HbA1c百分比值與平均葡萄糖濃度的關(guān)系的散點圖表示。如實例4中所述的那樣獲得數(shù)據(jù)。圖5(B)是患者樣品級分的導(dǎo)出的HbA1c百分比值與在對應(yīng)級分的年齡的時間段期間測量的平均葡萄糖濃度的關(guān)系的散點圖表示。如實例4中所述的那樣獲得數(shù)據(jù)。如實例9中所述的那樣對準平均葡萄糖值和導(dǎo)出的HbA1c百分比值。圖6示出了來自26名患有糖尿病的受試者的26張不同時間/年齡示意圖的圖形表示，其包含通過自我監(jiān)測所獲得的平均每日葡萄糖濃度值以及確定的HbA1c百分比。如實例4中所述的那樣獲得縱坐標上的平均每日葡萄糖濃度值。橫坐標上的時間數(shù)據(jù)源自自我監(jiān)測數(shù)據(jù)的日程表?？v坐標上的導(dǎo)出的HbA1c百分比值如實例5和表2C(列t)中所示的那樣計算，并且如實例7中所述的那樣歸一化。橫坐標上的年齡數(shù)據(jù)如實例6中及表2D列ad中所示的那樣計算。圖7是壽命系數(shù)的關(guān)系的圖形表示。縱坐標；由所確定的HbA1c百分比概況與血液葡萄糖概況之間的最佳擬合所確定的壽命系數(shù)。橫坐標；由網(wǎng)織紅細胞血紅蛋白含量和RNA含量導(dǎo)出的壽命系數(shù)。利用網(wǎng)織紅細胞的血紅蛋白和RNA含量對壽命系數(shù)進行的確定示于實例7和表2中。圖8示出了時間示意圖的圖形表示，這些示意圖包含26名患有糖尿病的不同受試者和6名正常受試者的血液的年齡級分中所呈現(xiàn)的細胞的百分比。百分比值如實例9中所述的那樣計算。如實例10中所述的那樣，采用外推法確定零百分點。圖9示出了時間示意圖的圖形表示，這些示意圖包含26名患有糖尿病的受試者和6名正常受試者的不同年齡級分中細胞的平均細胞血紅蛋白含量(MCH)。使用內(nèi)部對照細胞確定MCH。各級分的年齡如實例6中及表2D列ad中所示的那樣確定。圖10是示出了流式細胞儀的例子的示意性框圖。圖11示出了可用于實施分選流式細胞儀的各方面的計算裝置的示例性架構(gòu)。圖12A-C示出了使用三種其他測試(包括東曹(Tosoh)、普萊默斯(Primus)和羅氏(Roche)測試策略)對120份血樣進行的％HbA1C測量。圖13A-E示出了可從單份血樣獲得的信息，包括樣品中紅血細胞群體每個年齡的百分比HbA1c、紅血細胞每個年齡的估計葡萄糖、細胞每個年齡的平均細胞血紅蛋白、特定年齡的細胞的百分比。圖14示出了28名糖尿病患者的平均HbA1c和最高級分HbA1c的比較。圖15示出了如本文所述用于確定樣品中紅血細胞的年齡的示例性方法的流程圖。具體實施方式定義除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語均具有本公開所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。如本文所用，“約”當涉及可測量值時，意在涵蓋與指定值有±20％或±10％、更優(yōu)選地±5％、甚至更優(yōu)選地±l％且還更優(yōu)選地±0.1％的變化。在血液分析儀上，血樣的“平均細胞血紅蛋白(MCH)”是每個紅血細胞的血紅蛋白的平均質(zhì)量，并且由血樣的紅血細胞計數(shù)(RBC)和總血紅蛋白(Hgb)導(dǎo)出。后者通過對裂解血樣的血紅蛋白濃度的分光光度法測量來獲得。MCH是所有紅血細胞的平均測量值；其不表示獨立紅血細胞的血紅蛋白含量。其可通過將一定體積血液中血紅蛋白的總質(zhì)量除以紅血細胞的數(shù)量來計算：MCH＝(Hgb*10)/RBC。在流式細胞儀上，通常使用“參考對照”校正儀器。參考對照通常由具有已知血紅蛋白濃度、或等效血紅蛋白濃度、已知側(cè)向散射和熒光強度的熒光顆粒構(gòu)成。這些通常包括但不限于合成顆粒、人或動物血細胞以及經(jīng)處理的人或動物血細胞。在校正后，可在流式細胞儀上獲得獨立紅血細胞中細胞HbA1c的定量測量值，即該血紅蛋白變體的絕對量。如本文所用，術(shù)語“參考細胞級分”是指具有與紅血細胞的其他級分不同的特征的血樣細胞級分。在實施例中，這些特征包括RNA的存在和較低的HbA1c含量。在實施例中，參考細胞級分是網(wǎng)織紅細胞級分。術(shù)語“正常細胞對照”是指來源于未知患有疾病或病癥的受試者的細胞。在實施例中，正常細胞對照來自非糖尿病或非貧血個體。在實施例中，使用正常細胞對照來比較例如紅血細胞的平均年齡與糖尿病受試者中紅血細胞的平均年齡。如流式細胞術(shù)中已知的術(shù)語“側(cè)向散射”是指與入射光成約90度或成直角的光散射信號，該入射光由穿過流通池孔的顆?；蜓毎伞Ｇ跋蛏⑸湫盘柺侵概c入射光成小于10度時所測量的光散射信號。側(cè)向散射測量是指由光學(xué)檢測器對側(cè)向散射信號進行測量。所有市售流式細胞儀配備有能夠測量前向散射和側(cè)向散射信號的檢測系統(tǒng)。如本文所用，術(shù)語“HbA1c”是指血紅蛋白的糖化形式。紅血細胞中存在的該糖化血紅蛋白是血漿葡萄糖與血紅蛋白的反應(yīng)產(chǎn)物。HbA1c的量作為血漿葡萄糖的函數(shù)而增加。如本文所用，術(shù)語“網(wǎng)織紅細胞”是指具有核糖體RNA網(wǎng)狀網(wǎng)絡(luò)的未成熟紅血細胞。術(shù)語“級分中所呈現(xiàn)的細胞的百分比”等同于1/(HbA1c百分比標度上表示的時間)。公式本公開包括可用于此處所述的方法和系統(tǒng)的多個公式。本文中包括的公式是：(I)y＝c*e0.157*x，其中c是常數(shù)，y是HbA1c參考值，并且x是流式細胞術(shù)FL4/SS值(II)y＝c*(ea*x-eb*x)*(d+e-f*x)，其中通過與葡萄糖值的比較，根據(jù)經(jīng)驗確定這些常數(shù)的值，如下所示；a＝0.03，b＝-0.01，c＝15.1，d＝1.8，e＝2.71828(歐拉常數(shù))，f＝1.8。x、y與公式I中一樣(III)y＝15.1*(e0.03*x-e-0.01*x)*(1.8+e-1.8*x)，其中x、y與公式I中一樣(IV)y＝c1*x1.3，其中x是以往的年齡值，y是新的年齡值。常數(shù)c1已被賦予一定值，以便保持最后級分的年齡處于115天。(V)通過給出平均值(m)，其中a和b是相應(yīng)的截止值(VI)LOG10(c1*RNA)*LOG10(c2*29.8*Hb)，其中c1是值為3.33的常數(shù)，并且c2是值為0.028的常數(shù)(VII)抗體結(jié)合動力學(xué)：逆函數(shù)：y＝c1*(ex*c2-1)，其中y是由參考實驗室給出的以IFCC單位計的HbA1c百分比，x是在存在內(nèi)部參考的情況下確定的流式細胞術(shù)HbA1c百分比，并且c1和c2是常數(shù)。(VIII)(d)＝4.54*(e0.157*(c)-1)，其中級分界限值以表1中的IFCC百分比HbA1c表示。列d(d)的值由列c的值使用公式(VIII)得出。(IX)NGSP＝(0.915*IFCC)+2.15(X)IFCCHbA1c百分比＝4.54*(e0.157*流式細胞術(shù)任意HbA1c百分比-1)(XI)w＝e0.157*(v)-1系統(tǒng)在實施例中，提供了用于確定紅血細胞群體的年齡的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括：獨立紅血細胞的側(cè)向散射和熒光的檢測器；利用獨立紅血細胞在至少一個波長處測得的熒光及測得的側(cè)向散射來得出百分比HbA1c含量的計算器；使用參考細胞級分HbA1c的平均百分比將紅血細胞群體分成多個級分的分配器，每個級分包含基本上相等數(shù)量的紅血細胞；每份樣品的壽命系數(shù)的計算器；以及樣品各級分的年齡的計算器。在實施例中，參考細胞級分是網(wǎng)織紅細胞級分。在其他實施例中，提供了用于確定紅血細胞群體每個年齡的平均血紅蛋白含量的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括：獨立紅血細胞的側(cè)向散射和熒光的檢測器；利用獨立紅血細胞的測得的熒光及測得的側(cè)向散射來得出百分比HbA1c含量的計算器；使用參考細胞級分HbA1c的平均百分比將紅血細胞群體分成多個級分的分配器，每個級分包含基本上相等數(shù)量的紅血細胞；每份樣品的壽命系數(shù)的計算器；樣品各級分的年齡的計算器；以及樣品中細胞每個年齡的平均細胞血紅蛋白含量的計算器。在實施例中，參考細胞級分是網(wǎng)織紅細胞級分。在其他實施例中，系統(tǒng)還包括樣品中的細胞的平均年齡的計算器，并且將樣品中的細胞的平均年齡與正常對照樣品中的細胞的平均年齡相比較，其中細胞的平均年齡的差異指示疾病或疾病的狀態(tài)，諸如糖尿病。在其他實施例中，系統(tǒng)還包括樣品中不同年齡的細胞的平均細胞血紅蛋白的計算器，并且將不同年齡的細胞的平均細胞血紅蛋白彼此相比較，以識別平均細胞血紅蛋白隨細胞年齡的變化，其中變化指示疾病或疾病的狀態(tài)，諸如貧血，或者如出血或輸血之類的事件。在實施例中，樣品級分的年齡的計算器包括與參考對照級分的平均百分比HbA1c的位置相比，計算每個級分中的平均百分比HbA1c的位置，計算該級分內(nèi)的平均HbA1c的位置，計算每個級分的導(dǎo)出的NGPSHbA1c百分比，通過以下方式計算級分的年齡：將級分的平均百分比乘以常數(shù)，諸如3.44(參考樣品的IFCC百分比HbA1c的示例值)。然后將乘積輸入如表2D中所示的公式XI：w＝e0.157*(v)–1并且計算每個級分之間的差值，從而得到值x。將值x除以級分平均值的位置，然后除以級分中的總事件的百分比。接下來將該被除數(shù)乘以壽命系數(shù)，并確定該乘積的累積值。在實施例中，參考對照級分是HbA1c量已知的內(nèi)部對照，諸如網(wǎng)織紅細胞級分。任選地，本文所述的任何系統(tǒng)可包括級分的導(dǎo)出的HbA1c百分比的計算器、采用本文所提供的公式的HbA1c的IFCC百分比的計算器、和/或?qū)Ρ尘斑M行修正的百分比HbA1c的計算器。在實施例中，該系統(tǒng)包括存儲數(shù)據(jù)指令的一個或多個計算機可讀介質(zhì)，這些數(shù)據(jù)指令在被計算裝置執(zhí)行時，致使計算裝置實施如本文所述的方法的步驟、功能或操作中的一者或多者。該系統(tǒng)還可包括被配置為執(zhí)行本文所公開的步驟、功能或操作中的任何一者或多者的電子裝置。計算裝置和電子裝置可包括例如軟件或固件指令。電子裝置還可包括其他電子硬件裝置，這些電子硬件裝置被專門設(shè)計或配置為執(zhí)行本文所述的步驟、功能或操作，且可不利用任何額外的軟件或固件指令。用于確定本公開一個或多個方面的本文所述模塊或計算器可實施為硬件(諸如電子硬件裝置)、硬件和軟件(諸如計算裝置)、軟件、或存儲可由處理裝置執(zhí)行的指令的計算機可讀介質(zhì)。例如，方法包括測量群體中每個獨立紅血細胞的血紅蛋白和HbA1c；利用每個獨立紅血細胞的HbA1c含量和血紅蛋白含量來確定每個獨立細胞中的HbA1c的百分比；通過將獨立細胞中的HbA1c的百分比與參考細胞級分的HbA1c的平均百分比相比較，來將紅血細胞群體分級成多個級分，每個級分包含基本上相等數(shù)量的紅血細胞；確定每個級分中的HbA1c的平均百分比，并且通過將HbA1c的平均百分比與參考對照細胞級分的HbA1c的平均百分比相比較，來識別該級分中的紅血細胞的年齡。在實施例中，該方法還包括與對照細胞的相同級分相比，確定樣品中屬于特定HbA1c百分比的級分的紅血細胞的密度。在實施例中，對照細胞具有至少28天的平均年齡。在實施例中，該方法還包括測量樣品中的獨立細胞的RNA。在實施例中，參考細胞級分是網(wǎng)織紅細胞級分。在實施例中，參考細胞級分是具有已知HbA1c含量的內(nèi)部對照細胞群體，如美國專利No.7,968,279中所述，該專利據(jù)此全文以引用方式并入。在實施例中，使用允許抗體和/或其抗原結(jié)合片段透過細胞的試劑，對樣品中的細胞進行透化處理。在實施例中，待分析的細胞標記有：結(jié)合于DNA或RNA的試劑，和/或特異性地結(jié)合于HbA1c且標記有可檢測試劑的試劑。結(jié)合DNA/RNA的試劑允許將細胞識別為網(wǎng)織紅細胞。在實施例中，可檢測試劑是熒光標記物。在實施例中，特異性地結(jié)合于HbA1c的試劑是對HbA1c或其變體具有特異性的抗體。在實施例中，RNA/DNA的可檢測試劑在與抗體上的可檢測標記物不同的波長處檢測到。在實施例中，確定每個獨立細胞的側(cè)向散射。通過將可檢測試劑的熒光(FL4)除以側(cè)向散射(SS)來確定每個細胞的HbA1c的百分比。在實施例中，使用公式(I)來轉(zhuǎn)換歸一化的FL4/SS數(shù)據(jù)：y＝c*e0.157*x其中y是轉(zhuǎn)換的數(shù)據(jù)，x是歸一化的FL4/SS數(shù)據(jù)，并且c是常數(shù)(例如，2.74)。然而，該函數(shù)并不經(jīng)過原點。雖然該函數(shù)可用于修正大致在5％與15％之間變化的HbA1c百分比值，但其被替換以便用于我們分析中從大約0％變化至25％的級分。對于該函數(shù)的替換，選擇了通式(II)；y＝c*(ea*x-eb*x)*(d+e-f*x)通過與葡萄糖值的比較，根據(jù)經(jīng)驗確定這些常數(shù)的值，如下所示。示例性常數(shù)值是a＝0.03，b＝-0.01，c＝15.1，d＝1.8，e＝2.71828(歐拉常數(shù)或自然對數(shù)的底)，f＝1.8。該替換公式的第一部分使曲線經(jīng)過原點；第二部分將輕微反S形曲線引入該曲線的下限值的區(qū)段中。在實施例中，來自樣品中的每個細胞的原始數(shù)據(jù)被分成多個級分。級分基于細胞事件的數(shù)量，并且事件的等級順序基于由來自正常非糖尿病樣品的樣品得出的數(shù)據(jù)。在實施例中，血流中存在的網(wǎng)織紅細胞的HbA1c的平均百分比被用作級分界限值。在實施例中，來自細胞的數(shù)據(jù)被分成十個級分，每個級分包含大約相同數(shù)量的細胞。最后級分10的級分界限估計為最后級分10的平均熒光值加上級分8和9的級分界限值之差的一半。針對熒光的背景和補償對這些值進行修正。在實施例中，使用內(nèi)部參考對照樣品與實測HbA1c值之間的線性相關(guān)曲線，將HbA1c的百分比換算為IFCCHbA1c百分比。在實施例中，使用以下方程式確定百分比IFCCHbA1c：IFCCHbA1c百分比＝4.54*(e0.157*流式細胞術(shù)任意HbA1c百分比-1)(公式X)。在實施例中，確定每份樣品的壽命系數(shù)。壽命系數(shù)與網(wǎng)織紅細胞血紅蛋白和RNA含量有關(guān)。在實施例中，計算每份樣品的壽命系數(shù)。吖啶橙RNA染色；確定每份樣品的網(wǎng)織紅細胞的FL1(488nm)熒光值(側(cè)向散射值)。發(fā)現(xiàn)與網(wǎng)織紅細胞的FL1值的對數(shù)(RNA含量)和網(wǎng)織紅細胞的側(cè)向散射值的對數(shù)(血紅蛋白含量)的乘積存在最佳相關(guān)性(R2＝0.8)。為了獲得穩(wěn)定的RNA值，通過以下方式確定RNA的值：從網(wǎng)織紅細胞的FL1值減去第一級分的FL1值，并且將該差值除以不包含任何RNA的第三級分的FL1值。使用內(nèi)部對照細胞的血紅蛋白含量來確定網(wǎng)織紅細胞的平均血紅蛋白含量(Hb)。公式和常數(shù)是：LOG10(c1*RNA)*LOG10(c2*29.8*Hb)其中RNA和Hb如上所述，c1是例如為3.33的常數(shù)值，并且c2是在本公開中示例為0.028的常數(shù)值。29.8值是內(nèi)部對照細胞的平均血紅蛋白含量的例子。在實施例中，通過以下方式確定取自疑似患有諸如糖尿病之類疾病的受試者的樣品的壽命系數(shù)：從受試者樣品中的網(wǎng)織紅細胞的值減去所有細胞的吖啶橙RNA染色FL1(488nm)熒光值而得到值af。從所有細胞的值減去FL1背景值的熒光值(例如，0.17)而得到值ag。將值af除以值ag而得到值ah，然后乘1.3次方而得到值ai。將側(cè)向散射所確定的網(wǎng)織紅細胞的血紅蛋白含量的值除以所有細胞的血紅蛋白含量的值，然后乘1.7次方，而得到值al。為計算壽命系數(shù)，將值ai乘以值al。在其他實施例中，可通過以下方式計算壽命系數(shù)：將10％最老細胞的HbA1c的百分比除以所有細胞的HbA1c的平均百分比。在實施例中，使用級分中的細胞事件的總數(shù)并與每個級分的修正HbA1c的百分比平均值相比較，來計算級分的年齡。在實施例中，可通過以下方式計算每個級分的細胞年齡：將每個級分的級分界限值(FL4/SS標度上的級分界限值)除以級分的平均值。將每個級分的該值乘以參考樣品的IFCCHbA1c百分比(例如，3.44％)而得到值v。使用公式XI轉(zhuǎn)換每個級分的值v：w＝e0.157*(v)-1通過x＝wn-wn-1確定級分之間的差值。將(x)的值除以級分的平均值的位置(相對于參考對照的對應(yīng)級分的平均值的位置)，從而提供值y。將每個級分中的細胞事件的總數(shù)除以十個級分的細胞事件的數(shù)量并乘以10，從而提供值aa。將值y乘以值aa。然后將該值乘以通過最佳擬合確定的或如表2E中給出的那樣計算的壽命系數(shù)。該計算的結(jié)果是值ac。通過acn+acn-1確定(ac)的累積值，從而表示以天數(shù)計的級分的年齡。在實施例中，參考對照是具有已知HbA1c含量的內(nèi)部對照細胞群體，如美國專利No.7,968,279中所述，該專利據(jù)此全文以引用方式并入。在實施例中，該分析的級分中細胞年齡的確定可以將時間軸應(yīng)用于所選的紅血細胞參數(shù)。一定細胞年齡的級分的平均細胞血紅蛋白如US7541190中所述的那樣確定，該專利據(jù)此全文以引用方式并入。在實施例中，還計算了紅血細胞的平均年齡。在一些實施例中，通過以下方式計算平均年齡：將每個級分中的細胞的數(shù)量乘以級分的年齡。將這些乘積之和除以樣品的紅細胞的總數(shù)。可使用每個級分以天數(shù)計的年齡來確定血樣的平均年齡。可將取自疑似或已知患有疾病的受試者的血樣的平均年齡，與取自未患有該疾病的受試者的對照樣品的平均年齡相比較。在實施例中，該疾病是糖尿病?？稍诔跏荚\斷時或在治療后采集樣品，以監(jiān)測治療的療效。確定每個級分中的HbA1c百分比和每個級分中的細胞百分比，允許確定受試者在約100至約120天(紅血細胞的壽命)內(nèi)的病史。來自每份樣品的數(shù)據(jù)允許確定治療的療效，并且比受試者隨時間推移所報告的書寫日志更準確。參見圖14。在實施例中，細胞群體的平均年齡增加指示糖尿病的存在或糖尿病的狀態(tài)。在實施例中，可確定作為樣品中細胞年齡的函數(shù)的平均細胞血紅蛋白含量。細胞血紅蛋白含量的變化指示貧血之類疾病的存在或貧血之類疾病的狀態(tài)。在實施例中，細胞血紅蛋白含量的減少指示貧血。在其他實施例中，細胞特定年齡時細胞血紅蛋白含量的變化指示在過去100至約120天內(nèi)的出血或輸血事件。在實施例中，對于輸血事件而言，平均細胞血紅蛋白可增加。在實施例中，細胞血紅蛋白含量的減少指示出血。在實施例中，所述系統(tǒng)和/或計算機可讀介質(zhì)可包含于流式細胞儀內(nèi)或作為獨立式產(chǎn)品。在實施例中，所述系統(tǒng)和/或計算機可讀介質(zhì)可包含于用于測量細胞樣品的HbA1c的試劑盒中。計算機可讀介質(zhì)是非臨時性介質(zhì)，并且不包括臨時性信號。參考圖10、圖11和圖15，這些圖作為用于執(zhí)行如本文所述的方法的系統(tǒng)的示例性實施例。圖10是示出了流式細胞儀100的例子的示意性框圖。在該例子中，流式細胞儀包括樣品源102、流體源104、流體噴嘴106、光源108、檢測器110(諸如包括檢測器110A、110B和110C)、顆粒分析儀112(包括計算裝置118和樣品年齡評價引擎120)以及容器124。流體噴嘴106生成其中包含顆粒128的流體流126，并且光源108生成光束130。當光束130與流體流126和其中包含的顆粒128相交時，生成輻射的光132。流式細胞儀100的其他實施例包括與圖10所示例子相比更多的、更少的或不同的部件。樣品源102為提供給流式細胞儀進行分析的樣品的來源。樣品包括由光束130照明且由顆粒分析儀分析的單獨顆粒128。例如，樣品可為血液，并且顆?？蔀檠毎?。樣品可為所制備的樣品的形式，諸如通過執(zhí)行本文所述方案而獲得的含通透的紅血細胞的流體。樣品源102可包括容納待分析樣品的一個或多個容器諸如試管。在一些實施例中，提供流體輸送系統(tǒng)，諸如用于將樣品從容器中抽出并將樣品遞送到流體噴嘴106。樣品通常被注入流式細胞儀內(nèi)的鞘流體內(nèi)，鞘流體由流體源104提供。鞘流體的一個例子為鹽水。流體源104的一個例子為其中儲存鹽水的容器，以及可操作用于將鞘流體從流體源104遞送到流體噴嘴106的流體輸送系統(tǒng)。在一些實施例中，提供流體噴嘴106以生成流體流126并將樣品的顆粒128注入流體流中。流體噴嘴106的一個例子為流動池。流體噴嘴106通常包括孔，所述孔的尺寸被選擇為至少大于樣品中感興趣顆粒的尺寸，但足夠小以將顆粒布置到窄流中。理想情況下，顆粒被布置成單列或近單列構(gòu)型，使得單個顆?；蜉^少數(shù)量的顆粒(例如，1至3個)可一次穿過光束130。在一些實施例中，顆粒使用水動力、聲力或磁力來聚焦。光源108(其如本文所論述可包括一個或多個光源)生成指向流體流126的至少一個光束。光源108的例子包括激光和弧光燈。在一些實施例中，光束130穿過光學(xué)組件，諸如用于將光束聚焦到流體流126上。在一些實施例中，光束為激光束。來自光源108的光束130與流體流126相交。光束130中包含的顆粒128干擾了光束130并且生成輻射的光132。輻射的光132的類型和模式取決于顆粒128的類型和尺寸，但輻射的光132可包括前向散射光、側(cè)向散射光、反向散射光以及熒光(這在光線被顆粒吸收和重發(fā)射時發(fā)生，這可通過光線的波長(即，顏色)的對應(yīng)變化來檢測)。提供一個或多個檢測器110以檢測輻射的光132。在該例子中，檢測器110包括被布置用于檢測前向散射和熒光的檢測器110A、被布置用于檢測側(cè)向散射和熒光的檢測器110B以及被布置用于檢測反向散射和熒光的檢測器110C。檢測器110的一個例子是光電倍增管。顆粒分析儀112用于接收來自一個或多個檢測器110的信號以執(zhí)行各種操作來表征顆粒128。在一些實施例中，顆粒分析儀112包括計算裝置118和樣品年齡評價引擎120。計算裝置的例子在本文有所描述，包括在圖11中。樣品年齡評價引擎120用于確定如本文所述樣品中的細胞血紅蛋白的年齡。在一些實施例中，顆粒分析儀112還包括模數(shù)轉(zhuǎn)換器。在一些實施例中，流式細胞儀100為分選流式細胞儀，其用于使用由顆粒分析儀112生成的顆粒的表征來分選顆粒128。分選流式細胞儀可包括分選系統(tǒng)，該分選系統(tǒng)包括分選控制器、至少一個分選板和多個容器。分選流式細胞儀可用于基于顆粒的特性(諸如紅血細胞的成熟度或血紅蛋白含量)來分選樣品的顆粒。例如，分選控制器基于顆粒的表征來向由流體流形成的液滴施加正電荷、負電荷或中性電荷。在一些實施例中，流體噴嘴電耦合至電荷生成電路，所述電荷生成電路由分選控制器控制。當液滴穿過帶電分選板時，液滴基于它們各自的電荷而朝向容器之一轉(zhuǎn)向。分選流式細胞儀通常具有至少兩個容器，并且也可具有超過三個容器。通常，一個容器為不需要的顆?；虮话l(fā)現(xiàn)受到一個或多個顆粒污染的液滴所用的廢物容器。圖11示出了可用于實施本公開的各方面的計算裝置的示例性架構(gòu)，所述計算裝置包括可在流式細胞儀100內(nèi)使用的所述一個或多個計算裝置118中的任何一者。圖11中所示的計算裝置可用于利用處理裝置180執(zhí)行本文所述的操作系統(tǒng)、應(yīng)用程序和軟件模塊(包括軟件引擎)。在一些實施例中，計算裝置118包括至少一個處理裝置180，如中央處理單元(CPU)。多種處理裝置可得自多個制造商，例如英特爾公司(Intel)或AMD公司(AdvancedMicroDevices)。在此示例中，計算裝置118還包括系統(tǒng)存儲器182和系統(tǒng)總線184，該系統(tǒng)總線將包括系統(tǒng)存儲器182在內(nèi)的多個系統(tǒng)部件連接到處理裝置180。系統(tǒng)總線184是任何數(shù)量的類型的總線結(jié)構(gòu)中的一者，包括存儲器總線或存儲控制器；外圍總線；以及使用多種總線架構(gòu)中的任一者的局部總線。適用于計算裝置118的計算裝置的例子包括臺式計算機、膝上型計算機、平板計算機、移動計算裝置(諸如智能電話、或(蘋果公司(AppleInc.)的注冊商標)移動數(shù)字裝置、或者其他移動裝置)，或者被配置用于處理數(shù)字指令的其他裝置。圖11中示出的計算裝置也是可編程電子裝置的例子，其可包括一個或多個此類計算裝置，并且當包括多個計算裝置時，此類計算裝置可用合適的數(shù)據(jù)通信網(wǎng)絡(luò)連接在一起，以便共同執(zhí)行本文所公開的各種功能、方法或操作。圖15示出了可在計算裝置上實施的本公開方法的示例性流程圖，所述計算裝置包括可在流式細胞儀100內(nèi)使用的所述一個或多個計算裝置118中的任何一者。在實施例中，計算裝置包含用于實施方法的指令，所述方法包括確定血樣的血紅蛋白、HbA1c和RNA含量(1502)，利用每個細胞的HBA1c和血紅蛋白含量確定每個細胞中的HbA1c百分比(1504)，將紅血細胞群體分級成多個級分(1506)，確定每個級分中的HbA1c平均百分比(1508)，以及確定每個級分中的紅血細胞的年齡(1510)。方法在本公開的一個方面，紅血細胞的壽命、RNA參數(shù)與源自網(wǎng)織紅細胞的血紅蛋白參數(shù)之間的關(guān)系，提供了取自受試者的樣品中紅血細胞的年齡的表征。在網(wǎng)織紅細胞的成熟期間，RNA含量逐漸消失，同時血紅蛋白含量上升達到最高值。在RNA含量與血紅蛋白含量乘積的函數(shù)中，遞減的RNA和遞增的血紅蛋白將彼此平衡，并且該函數(shù)的值將在網(wǎng)織紅細胞的成熟期間保持不變。然而，如果RNA和血紅蛋白兩者都較低，這意味著在抽取血樣時網(wǎng)織紅細胞未能達到正常血紅蛋白水平。本文建立了網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)中紅細胞的破裂與網(wǎng)織紅細胞中血紅蛋白的合成之間的聯(lián)系。在本公開的一個方面，逐個細胞流動分析允許針對至少一個指標而將細胞分級成亞群。在實施例中，該指標是HbA1c、血紅蛋白和/或RNA。紅細胞群體適用于分級成不同年齡的亞群。其他具有活性細胞核的細胞會經(jīng)歷增殖或?qū)ζ涑煞值母?。然而，紅細胞失去了其細胞核和其RNA，并且進入確定長度的壽命。最近開發(fā)了將抗體染色應(yīng)用于紅細胞的內(nèi)部而不破壞細胞實體的技術(shù)。通過用抗HbA1c抗體來染色并測量細胞血紅蛋白的量，可以確定每個細胞的HbA1c百分比。由于葡萄糖可以自由進入細胞，始終存在于血液中并且HbA1c的形成是不可逆的(AmadoriM.,AttiAccad.naz.Lincei,1925,2,337；1929,9,68,226；1931,13,72,195(AmadoriM.，《國家林琴科學(xué)院院刊》，1925年，第2卷，第337頁；1929年，第9卷，第68期，第226頁；1931年，第13卷，第72期，第195頁))，因此HbA1c的百分比始終上升并且可用作細胞年齡的量度。使用HbA1c作為年齡指標時，零點被定義為未成熟紅細胞已產(chǎn)生其一半血紅蛋白的點。細胞發(fā)育成網(wǎng)織紅細胞和成熟紅細胞，并在其壽命結(jié)束時最終被肝、骨髓和脾中的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除。紅細胞的壽命被定義為存活最長時間的細胞的年齡。在本公開的另一個方面，測量獨立紅細胞的HbA1c百分比，并且在流式細胞儀中獲得的紅細胞事件在百分比HbA1c的標度上重新組織。由于紅細胞的百分比HbA1c與年齡之間的關(guān)系，這種標度也表示細胞的年齡。其上仍然存在細胞事件的標度的最大值對應(yīng)于最老紅細胞的壽命。在第一種方法中，應(yīng)用120天的壽命值，其一般用作人紅細胞的平均壽命。然而，在本公開的實施例之一中，使用未成熟循環(huán)紅血細胞(網(wǎng)織紅細胞)的血紅蛋白含量和RNA含量來測量壽命系數(shù)。已表明，使用這些參數(shù)，可以獲得個體的紅細胞的壽命的量度。在細胞HbA1c百分比或年齡的標度上的紅細胞事件允許通過游標的放置來劃分細胞群體。游標之間的細胞事件稱為級分。級分中具有限定數(shù)量的細胞事件。根據(jù)兩個因素來設(shè)定這些級分的界限；坐標軸上的事件的等級順序以及坐標軸上的細胞事件的數(shù)量。這樣，不同級分的HbA1c百分比是獨立參數(shù)，并且可用于級分中的細胞的年齡計算?？稍谄浼t細胞已暴露于不同葡萄糖濃度的不同個體之間比較對應(yīng)級分。在實施例中，這些級分包含類似數(shù)量的細胞。HbA1c百分比值基于級分界限的位置。在實施例中，使用這些級分的平均值來計算年齡值。對于級分中細胞的年齡的計算，重要的是首先確定細胞是否可能由于死亡或因固定化在實體器官中所致的不存在于循環(huán)血液，而從級分中缺如。在本公開的一個方面，各級分的HbA1c百分比之間的差值除以各級分的平均值的差值，得到導(dǎo)出的HbA1c值。這種導(dǎo)出的HbA1c百分比值是HbA1c百分比在一定時間段內(nèi)的百分比變化，并且是在這個時間段期間個體中的血液葡萄糖濃度的量度。對于取自非糖尿病個體的血樣，各級分的導(dǎo)出的HbA1c百分比值不變。在實施例中，獨立紅細胞或紅細胞群的血紅蛋白年齡和導(dǎo)出的HbA1c參數(shù)的測量和計算，是在血樣的所有其他紅細胞的測量和計算的背景下完成的。就取自糖尿病個體的血樣而言，在與正常參考血樣相比較的情況下完成該測量和計算。在該實施例的另一個方面，對取自正常個體和取自糖尿病個體的對應(yīng)級分的平均值和界限值進行比較。這允許測量糖尿病個體各級分的HbA1c的導(dǎo)出的百分比。將糖尿病受試者的不同年齡的級分的導(dǎo)出的HbA1c百分比值與相同受試者自測的隨時間推移的血液葡萄糖濃度進行比較，發(fā)現(xiàn)這兩種模式存在相似性。將糖尿病受試者登記的隨時間推移的血液葡萄糖濃度與相同受試者的血樣的年齡級分的導(dǎo)出的HbA1c百分比進行比較，驗證了各級分的年齡測量。在本公開的另一個方面，確定了取自每名患者的樣品中紅血細胞的壽命值，從而提供年齡級分的隨時間推移的血液葡萄糖濃度和導(dǎo)出的HbA1c值的反映。這些獨立壽命值顯示出與網(wǎng)織紅細胞的參數(shù)的相關(guān)性，尤其是這些細胞的血紅蛋白含量和RNA含量的函數(shù)?？紤]到作為網(wǎng)織紅細胞參數(shù)的函數(shù)而計算的紅細胞的壽命以及血細胞級分相對于該壽命的相對年齡的計算，可以測量血樣中獨立細胞或細胞群的細胞血紅蛋白的年齡。在另一個實施例中，個體紅細胞的最老10％級分的HbA1c百分比及其所有紅細胞的平均HbA1c百分比的商可被視為紅細胞的壽命的函數(shù)。在另一個實施例中，最老級分的HbA1c百分比具有臨床意義(ZoungasSetal.Diabetologia.2012Mar；55(3):636-43.doi:10.1007/s00125-011-2404-1.Epub2011Dec21(ZoungasS等人，《糖尿病學(xué)》，2012年3月；第55卷，第3期，第636-643頁。doi:10.1007/s00125-011-2404-1。電子版2011年12月21日))。具有最高HbA1c百分比的細胞會引起血管并發(fā)癥。在本公開的另一個方面，獨立紅細胞或紅細胞群的計算年齡可與取自血樣的這些細胞或細胞群的導(dǎo)出的HbA1c百分比結(jié)合，并且所結(jié)合的數(shù)據(jù)可用于重建受試者過往經(jīng)歷的時間標度上的血液葡萄糖濃度。提供了將細胞群的計算年齡與導(dǎo)出的HbA1c百分比、與細胞血紅蛋白含量及與血流中紅細胞的呈現(xiàn)相結(jié)合的應(yīng)用例子，從而允許確定細胞是否由于在其他器官中的消失或由于清除或死亡而從血流消失。然而，該應(yīng)用不限于這些例子，并且獨立細胞或細胞群的計算年齡與這些獨立細胞或細胞群的其他參數(shù)的結(jié)合是本公開的組成部分。在本公開的不同實施例中，流式細胞術(shù)數(shù)據(jù)的處理可在這樣的方法中使用，所述方法用來將血紅蛋白的年齡歸屬于取自血樣的獨立紅細胞或紅細胞群；確定取自個體的紅細胞的壽命的長度；確定取自血樣的紅細胞的平均年齡；將HbA1c百分比和導(dǎo)出的HbA1c百分比歸屬于取自血樣的紅細胞群；將細胞血紅蛋白含量或平均細胞血紅蛋白含量歸屬于取自血樣的一個紅細胞或紅細胞群；將血液循環(huán)中特定年齡的血紅蛋白的紅細胞群的呈現(xiàn)確定為細胞完全呈現(xiàn)的百分比，如果細胞沒有因死亡、細胞從血流清除或缺失而消失，并且如果沒有出現(xiàn)紅細胞產(chǎn)量的短暫波動，則該百分比為100％；或者任何上述實施例的組合或任何上述實施例與紅細胞的任何其他參數(shù)的組合。用于確定紅細胞的年齡-時間標度的系統(tǒng)和方法可用于糖尿病和/或貧血的診斷和監(jiān)測。該系統(tǒng)檢測相當突然的血液變化，并且可在持續(xù)約3-4月時間段的時間標度上記住這些變化。當該系統(tǒng)檢測到數(shù)月前發(fā)生的葡萄糖變化時，該系統(tǒng)還可檢測特定時間點后紅細胞的密度變化。相似地，可在一定時間點處檢測到血紅蛋白含量的變化。在其他實施例中，如本文所述的方法可用于檢測出血或輸血。如果兩個月前發(fā)生了出血事件，則會在兩月時間點處存在血紅蛋白含量的斷點。就輸血而言，如果供血者與受血者血液之間存在血紅蛋白含量的差異，則輸入的血液是可檢測的。接受輸血的時間處的斷點將是可檢測的?，F(xiàn)在參見圖15，在實施例中，方法包括測量獨立紅血細胞的HbA1c和血紅蛋白(操作1502)；利用獨立紅血細胞的HbA1c含量和血紅蛋白含量來確定HbA1c的百分比(操作1504)；使用每個獨立紅血細胞的HbA1c百分比與參考細胞級分的平均HbA1c相比較，將紅血細胞群體分級成多個級分，每個級分包含基本上相等數(shù)量的紅血細胞(操作1506)；確定每個級分中的HbA1c的平均百分比(操作1508)；以及通過將HbA1c的平均百分比與參考對照級分的HbA1c的平均百分比相比較，來識別獨立血細胞的年齡(操作1510)。在實施例中，方法包括測量獨立紅血細胞的HbA1c和血紅蛋白；利用獨立紅血細胞的HbA1c含量和血紅蛋白含量來確定HbA1c的百分比；使用每個獨立紅血細胞的HbA1c百分比與參考細胞級分的平均HbA1c相比較，將紅血細胞群體分級成多個級分，每個級分包含基本上相等數(shù)量的紅血細胞；確定每個級分中的HbA1c的平均百分比；以及通過將HbA1c的平均百分比與參考對照級分的HbA1c的平均百分比相比較，來識別獨立血細胞的年齡。在實施例中，在流式細胞儀中測量紅血細胞的HbA1c和/或血紅蛋白。在其他實施例中，該方法還包括與參考對照細胞的該級分相比，確定樣品中屬于特定HbA1c百分比的級分的紅血細胞的密度。在實施例中，參考對照細胞具有至少28天的平均年齡。在實施例中，該方法還包括測量樣品中的獨立細胞的RNA含量。在實施例中，參考細胞級分是網(wǎng)織紅細胞級分。在實施例中，通過用結(jié)合RNA的染料諸如吖啶橙進行染色，來確定網(wǎng)織紅細胞所占的細胞比例。在實施例中，可通過與可檢測地標記的抗體結(jié)合來確定獨立細胞中的HbA1c，該抗體結(jié)合于HbA1c或其變體。在實施例中，該可檢測標記物是可在與側(cè)向散射和/或結(jié)合RNA的染料不同的波長處檢測的熒光部分。在實施例中，可通過側(cè)向散射來測量細胞血紅蛋白，如US7541190中所述，該專利據(jù)此以引用方式并入。在實施例中，通過將HbA1c熒光除以側(cè)向散射(例如，F(xiàn)L4/SS)來確定獨立細胞中的百分比HbA1c。在各種實施例中，對百分比HbA1c進行修正，以考慮背景。在其他實施例中，使用公式II將百分比HbA1c換算為百分比IFCCHbA1c。在實施例中，獨立細胞的百分比HbA1c的值被分級為多個級分。在實施例中，通過參考網(wǎng)織紅細胞級分的HbA1c的平均百分比來確定這些級分。在實施例中，樣品被分成至少10個級分，每個級分具有大約相同數(shù)量的細胞。在實施例中，確定每個級分中的HbA1c的平均百分比，通過將該級分的HbA1c的平均百分比與參考對照級分的經(jīng)壽命系數(shù)修正的HbA1c的平均百分比相比較，來確定該級分中的血細胞的年齡。在實施例中，參考對照級分是具有已知HbA1c含量的內(nèi)部對照細胞群體。在本公開的一個實施例中，描述了一種方法，該方法用于將流式細胞術(shù)所測量的獨立紅細胞中的HbA1c百分比的增加值與這些紅細胞中的血紅蛋白的年齡相關(guān)聯(lián)。該方法并不測量獨立細胞中的HbA1c百分比增加所需的時間，而是提供了流式細胞儀所測量的細胞事件在上升的HbA1c百分比的標度上的重排。HbA1c百分比的上升值可與時間標度相關(guān)。在實施例中，時間標度的總長度約為紅細胞的壽命。在實施例中，壽命為約1至200天、約10-200天、約50-200天以及約100-200天。在另一個實施例中，細胞事件在遞增時間標度上的重排與這些細胞中的HbA1c百分比的上升速度無關(guān)。本公開的方法將百分比HbA1c的增加值或減小值表示為與時間的關(guān)系并與獨立細胞的百分比HbA1c值無關(guān)，并且將HbA1c百分比表示為時間的函數(shù)。這種與HbA1c形成或葡萄糖濃度的變化的無關(guān)以及與細胞的血紅蛋白含量的變化的無關(guān)，提供了對疑似有或具有病態(tài)或病情的樣品的分析。在本公開的一個實施例中，描述了用于檢測或監(jiān)測糖尿病的進展的方法，該方法包括測量取自患有糖尿病的受試者的、獨立紅血細胞的HbA1c、血紅蛋白以及任選的RNA；利用獨立紅血細胞的HbA1c含量和血紅蛋白含量來確定HbA1c的百分比；使用每個獨立紅血細胞的HbA1c百分比與網(wǎng)織紅細胞級分的HbA1c的平均百分比相比較，將紅血細胞群體分級成多個級分，每個級分包含基本上相等數(shù)量的紅血細胞；確定每個級分中的HbA1c的平均百分比；通過將HbA1c的平均百分比與參考對照級分的HbA1c的平均百分比相比較，來識別該級分中的紅血細胞的年齡；確定取自患有糖尿病或疑似患有糖尿病的受試者的樣品中紅血細胞的平均年齡；以及將該樣品的紅血細胞的平均年齡與取自正常受試者的樣品的紅血細胞的平均年齡相比較。在實施例中，對照細胞群體是取自沒有疾病或病癥諸如沒有糖尿病的受試者的紅血細胞。在實施例中，參考對照級分具有已知百分比的HbA1c，如美國專利No.7,968,279中所述。在本公開的一個實施例中，描述了用于檢測和/或監(jiān)測貧血的進展的方法，該方法包括測量取自患有貧血的受試者的獨立紅血細胞的HbA1c、血紅蛋白以及任選的RNA；利用獨立紅血細胞的HbA1c含量和血紅蛋白含量來確定HbA1c的百分比；使用每個獨立紅血細胞的HbA1c百分比與網(wǎng)織紅細胞級分的HbA1c的平均百分比相比較，將紅血細胞群體分級成多個級分，每個級分包含基本上相等數(shù)量的紅血細胞；確定每個級分中的HbA1c的平均百分比；通過將HbA1c的平均百分比與參考對照級分的HbA1c的平均百分比相比較，來識別該級分中的紅血細胞的年齡；確定取自患有貧血的受試者的樣品的每個年齡級分的平均細胞血紅蛋白；以及確定不同年齡級分中是否存在平均細胞血紅蛋白的差異。在實施例中，參考對照級分具有已知百分比的HbA1c，如美國專利No.7,968,279中所述。在實施例中，可確定作為樣品中細胞年齡的函數(shù)的平均細胞血紅蛋白含量。細胞血紅蛋白含量的變化指示貧血之類疾病。在實施例中，細胞血紅蛋白含量的減少指示貧血。在其他實施例中，細胞特定年齡時細胞血紅蛋白含量的變化指示在過去100至約120天內(nèi)的出血或輸血事件。在實施例中，對于輸血事件而言，平均細胞血紅蛋白可增加。在實施例中，細胞血紅蛋白含量的減少指示出血。在另一個實施例中，本公開包括對函數(shù)進行修改，該函數(shù)提供由流式細胞技術(shù)對全部紅細胞所獲得的HbA1c百分比值和參考實驗室技術(shù)所獲得的HbA1c百分比值之間的相關(guān)性。該修改的函數(shù)提供相似的相關(guān)性，但意味著從約5％至15％范圍的測量范圍擴展，這適用于由不同樣品中的獨立細胞表示的約0％至25％的全血值。在本公開的另一個實施例中，并未測量獨立細胞的HbA1c百分比值，而是計算了總細胞群體的各級分的平均HbA1c百分比值。以HbA1c百分比的上升值為基礎(chǔ)來選擇細胞的這些級分或亞群。本公開提供了各級分的平均HbA1c百分比向各級分的時間值的轉(zhuǎn)換。在另一個實施例中，建立了用于確定基本時間標度的參考。該參考包括取自多個正常受試者的血樣的數(shù)據(jù)，其中可以推測他們具有穩(wěn)定的血液葡萄糖水平和HbA1c百分比的正常定期上升值。應(yīng)用HbA1c百分比的常數(shù)增加值，可以構(gòu)建基本時間模板，其可用作利用其他受試者樣品來計算時間標度的參考。在另一個實施例中，得自正常樣品的基本時間模板被應(yīng)用于受試者的其他樣品。在實施例中，需要多種修正。這些修正包括：1)細胞亞群的HbA1c百分比平均值在時間標度上的正確位置的計算，和/或2)基于網(wǎng)織紅細胞的情況和/或紅細胞的壽命進行的修正。在實施例中，在應(yīng)用這些修正后，構(gòu)建適用于其他患者或正常受試者的時間標度。在另一個實施例中，一旦已構(gòu)建時間標度，就可將相應(yīng)級分或亞群之間的HbA1c百分比的上升值(HbA1c百分比值的導(dǎo)數(shù))對該曲線上的時間點作圖。這樣可以直觀表示HbA1c的形成速度。由于處于體內(nèi)環(huán)境，HbA1c形成的速度取決于血液葡萄糖的濃度，這些微分HbA1c百分比曲線與血液葡萄糖曲線之間存在一定關(guān)系。在另一個實施例中，本公開涉及確定糖尿病受試者的紅血細胞年齡。在抽取血液后，這些受試者給出了每天一次或幾次血液葡萄糖測量的結(jié)果。幾個月監(jiān)測的結(jié)果表示于葡萄糖/時間曲線上，并且與表示由相同受試者的血樣的流式細胞術(shù)數(shù)據(jù)得出的、微分百分比HbA1c值/時間的曲線進行比較。數(shù)據(jù)的比較提供了用于測量細胞血紅蛋白年齡的方法。在本公開的另一個實施例中，時間數(shù)據(jù)用于將細胞血紅蛋白含量作為時間的函數(shù)來表達。在本公開的另一個實施例中，本文所述的方法可用于確定受試者紅血細胞的平均年齡和壽命的方法。在本公開的另一個實施例中，血樣中所呈現(xiàn)的細胞的百分比是由于受試者的紅細胞在器官中被固定或者通過自然清除或通過病理過程發(fā)生死亡而導(dǎo)致細胞消失的量度。細胞處理在一個實施例中，根據(jù)本文所述的方法，將全血紅細胞穩(wěn)定、通透，并且用在特定波長(例如675nm，F(xiàn)L4)發(fā)射的熒光標記的抗HbA1c抗體以及用在另一個波長(例如525nm，F(xiàn)L1)發(fā)射的RNA指標進行染色。這些細胞在配備有側(cè)向散射(SS)倍增管的流式細胞儀中分析，并且在代表FL4/SS的坐標軸上給出(圖1b)，F(xiàn)L4/SS是HbA1c百分比的量度，例如如美國專利No.7,968,279中所述。通過RNA染色(FL1)并以低HbA1c含量為基礎(chǔ)來分離網(wǎng)織紅細胞。在實施例中，為了計算正確的HbA1c百分比和細胞血紅蛋白含量，將具有已知HbA1c百分比值的參考對照細胞添加到樣品中，如US7968279中所述。參考對照通常由具有已知血紅蛋白濃度、或等效血紅蛋白濃度、已知側(cè)向散射和熒光強度的熒光顆粒構(gòu)成。這些通常包括但不限于合成顆粒、人或動物血細胞以及經(jīng)處理的人或動物血細胞。在校正后，可在流式細胞儀上獲得獨立紅血細胞中細胞HbA1c的定量測量值，即該血紅蛋白變體的絕對量。使用同型對照抗體或通過在該測定法中添加糖化HbA1c肽來封閉抗體的HbA1c反應(yīng)性，從而對網(wǎng)織紅細胞和成熟紅細胞測量HbA1c抗體的背景值。對HbA1c具有特異性的抗體是已知的或者可商購獲得。這些抗體可易于使用可檢測標記物，特別是可通過流式細胞術(shù)檢測的那些標記物來進行標記。在實施例中，該標記物(例如，對HbA1c具有特異性的可檢測地標記的抗體)可透過細胞。使用細胞透化與穩(wěn)定試劑對血樣進行處理，該細胞透化與穩(wěn)定試劑能夠透過紅血細胞的細胞膜，從而使細胞內(nèi)標記物滲透到紅血細胞中以便進行細胞分析。該細胞透化與穩(wěn)定試劑還引起細胞內(nèi)蛋白質(zhì)在細胞膜內(nèi)的沉淀和/或聚集，但保留細胞成分，諸如細胞內(nèi)和細胞表面抗原位點、DNA和RNA分子以及細胞骨架元件。術(shù)語“細胞成分”包括細胞膜內(nèi)及細胞膜表面上的細胞組分，諸如細胞表面抗原位點。術(shù)語“細胞內(nèi)成分”是指細胞膜內(nèi)的細胞組分，其包括但不限于細胞內(nèi)蛋白質(zhì)，諸如紅血球內(nèi)的血紅蛋白和血紅蛋白變體，細胞骨架元件，以及DNA和RNA。細胞骨架元件包括但不限于微管蛋白和血影蛋白。在實施例中，該細胞透化與穩(wěn)定試劑包含：由以下分子結(jié)構(gòu)表示的N-?；“彼峄蚱潲}：R1-CO-N(CH3)CH2COOX1，其中R1是具有8至18個碳原子的烷基或亞烷基基團，并且X1是H、Na+或K+；將該試劑的pH調(diào)至小于7的pH調(diào)節(jié)劑；以及水性介質(zhì)。游離酸形式的N-?；“彼峒捌潲}可商購獲得。優(yōu)選的是使用游離酸形式，其不會向試劑中引入金屬離子。游離酸形式的N-?；“彼岵皇撬苄缘摹？蓪⑵漕A(yù)先溶解于乙醇溶液中，然后添加到水溶液中。當pH調(diào)節(jié)劑將該試劑的pH調(diào)至4至6時，N-?；“彼嵩谌芤褐谐赎庪x子的形式。N-?；“彼岬暮线m例子包括N-油酰肌氨酸、N-硬脂酰肌氨酸、N-月桂酰肌氨酸、N-肉豆蔻酰肌氨酸、N-椰油酰肌氨酸及其鹽。在實施例中，R1的烷基或亞烷基基團具有12個碳原子。在一個優(yōu)選的實施例中，使用N-月桂酰肌氨酸。在實施例中，一旦細胞被標記，就可使用特定波長處的設(shè)門在流式細胞儀上分析一個或多個標記物諸如HbA1c和/或RNA的存在。在實施例中，提供了用于確定樣品中的紅血細胞群體的年齡概況的試劑盒，該試劑盒包含：a)特異性地結(jié)合HbA1C或其變體的抗體或其抗原結(jié)合片段；b)特異性地結(jié)合于RNA的染料；以及c)紅血細胞參考對照樣品。在一些實施例中，紅血細胞參考對照級分具有已知百分比的HbA1C。在其他實施例中，參考對照細胞是正常對照樣品，諸如取自未患有糖尿病或貧血的受試者。在其他實施例中，參考對照細胞取自患有糖尿病且HbA1C值已知的受試者。在實施例中，抗體或抗原結(jié)合片段被可檢測地標記。在實施例中，特異性地結(jié)合于RNA的染料是吖啶橙。在實施例中，該試劑盒還可包含用于透化紅血細胞的試劑。在實施例中，試劑盒還包含計算機可讀介質(zhì)，該計算機可讀介質(zhì)提供對樣品中的紅血細胞的年齡和/或密度的確定。數(shù)據(jù)分析在實施例中，方法包括使用流式細胞儀測量獨立紅血細胞的側(cè)向散射和熒光；通過側(cè)向散射來確定獨立紅血細胞的血紅蛋白含量；利用獨立紅血細胞的實測熒光導(dǎo)出HbA1c含量；以及利用紅血細胞的HbA1c含量和血紅蛋白含量來確定HbA1c的百分比；使用獨立細胞的HbA1c百分比與參考細胞級分(例如，網(wǎng)織紅細胞)相比較，將紅血細胞群體分級成多個級分，每個級分包含基本上相等數(shù)量的紅血細胞；確定每個級分中的HbA1c的平均百分比，并且通過將HbA1c的平均百分比與參考對照級分的HbA1c的平均百分比相比較，來識別紅血細胞的年齡。在實施例中，使用內(nèi)部對照細胞計算平均細胞血紅蛋白(MCH)，例如包括以下步驟：(a)將血樣的等分試樣與通透試劑混合而形成第一樣品混合物；以及在足以通透紅血細胞的細胞膜并造成細胞內(nèi)的血紅蛋白聚集的第一時間段內(nèi)溫育第一樣品混合物；(b)將中和試劑添加到第一樣品混合物而形成第二樣品混合物，并且在足以抑制通透試劑與紅血細胞進一步反應(yīng)的第二時間段內(nèi)溫育第二樣品混合物；以及(c)在流式細胞儀上對第二樣品混合物中的紅血細胞的側(cè)向散射信號進行逐個細胞測量；以及(d)使用由該測量得出的側(cè)向散射信號來獲得紅血細胞的細胞血紅蛋白(Hgb細胞)。在實施例中，利用分析儀報告的紅細胞指數(shù)來獲得每份血樣的平均細胞血紅蛋白(MCH)。應(yīng)當注意到，在血液分析儀上，MCH(皮克)由裂解血樣的總血紅蛋白濃度(Hgb，克/分升)和血樣的紅血細胞計數(shù)(RBC，個數(shù)/升)計算。在實施例中，單獨分析了由樣品的兩個等分試樣所得的平均側(cè)向散射值與血液分析儀上得出的MCH的相關(guān)性。在獲得細胞血紅蛋白后，可通過將Hgb細胞乘以紅血細胞計數(shù)來得出血樣的總血紅蛋白濃度。該紅血細胞計數(shù)可獨立地獲得，或如果流式細胞儀器具有流體體積測量裝置以有利于計數(shù)的話，可與上述測量一起獲得。在實施例中，利用每個獨立紅血細胞的HbA1c含量和血紅蛋白含量來確定HbA1c的百分比，是通過使HbA1c含量和血紅蛋白含量(例如，F(xiàn)L4/SS)相除而確定的。在實施例中，可應(yīng)用一種或多種修正，以對HbA1c的百分比進行修正。在實施例中，使用公式y(tǒng)＝c*e0.157*x來轉(zhuǎn)換歸一化的FL4/SS數(shù)據(jù)，其中y是轉(zhuǎn)換的數(shù)據(jù)，x是歸一化的FL4/SS數(shù)據(jù)，并且c是常數(shù)(例如，2.74)。然而，該函數(shù)并不經(jīng)過原點。雖然該函數(shù)可用于修正大致在5％與15％之間變化的HbA1c百分比值，但其被替換以便用于我們分析中從大約0％變化至25％的級分。對于該函數(shù)的替換，選擇了以下通式；y＝c*(ea*x-eb*x)*(d+e-f*x)通過與葡萄糖值的比較，根據(jù)經(jīng)驗確定這些常數(shù)的值，如下所示。這些常數(shù)的示例值是a＝0.03，b＝-0.01，c＝15.1，d＝1.8，e＝2.71828(歐拉常數(shù)或自然對數(shù)的底)，f＝1.8。該替換公式的第一部分使曲線經(jīng)過原點；第二部分將輕微反S形曲線引入該曲線的下限值的區(qū)段中。在固相免疫測定法中經(jīng)常觀察到這種類型的標準曲線(參見Ekins,R.P.RadioimmunoassayandRelatedProceduresinMedicineIAEA,Vienna,1974,STI/PUB/350,pp91-121(Ekins,R.P.，放射性免疫測定法與醫(yī)學(xué)中的相關(guān)程序，維也納國際原子能機構(gòu)，1974年，STI/PUB/350，第91-121頁))。該替換公式(2)如(1)中那樣在相關(guān)性方面進行修正，分別具有0.95和0.94的R2值。在實施例中，為了計算血樣中每個獨立細胞的年齡和HbA1c百分比，在實施例中，優(yōu)選地已知以下因素：(1)HbA1c標記物與HbA1c分子結(jié)合的動力學(xué)(2)細胞壽命期間的葡萄糖濃度(3)細胞壽命的長度。(4)HbA1c形成的動力學(xué)。在實施例中，根據(jù)已公布的說明，將參考HbA1c百分比值從當前NGPS值換算為新IFCC值(DavidB.Sacks發(fā)表的ADA/EASD/IDFworkinggroupoftheHbA1cassay；ClinicalChemistry.2005；51:681-683.(HbA1c測定法的ADA/EASD/IDF工作組；《臨床化學(xué)》，2005年；第51卷，第681-683頁))。新IFCC值與NGSP值不同之處在于沒有對于零值的截距，因此更適合包括幼小細胞的較低值的情況?？紤]到作為一級反應(yīng)的抗體結(jié)合響應(yīng)于對數(shù)函數(shù)，將其逆函數(shù)指數(shù)公式應(yīng)用于流式細胞術(shù)數(shù)據(jù)，得到線性相關(guān)性，其中回歸線經(jīng)過圖形的原點?？贵w結(jié)合動力學(xué)：逆函數(shù)：y＝c1*(ex*c2-1)其中y是由參考實驗室給出的以IFCC單位計的HbA1c百分比，x是在存在內(nèi)部參考的情況下確定的流式細胞術(shù)HbA1c百分比，并且c1和c2是常數(shù)。在其他實施例中，在細胞HbA1c百分比或年齡的標度上的紅細胞事件允許通過游標的放置來劃分細胞群體。游標之間的細胞事件稱為級分。級分中具有限定數(shù)量的細胞事件。在實施例中，這些級分包含類似數(shù)量的細胞。HbA1c百分比值基于級分界限的位置。在實施例中，使用這些級分的平均值來計算年齡值。對于級分中細胞的年齡的計算，首要的是首先確定細胞是否可能由于死亡或因固定化在實體器官中所致的不存在于循環(huán)血液，而從級分中缺如。在實施例中，細胞的分級涉及使用樣品中存在的網(wǎng)織紅細胞的HbA1c百分比的平均值作為級分界限值。在實施例中，細胞被分成至少10個級分。在一個實施例中，最后級分10的級分界限估計為最后級分10的平均熒光值加上級分8和9的級分界限值之差的一半。針對熒光的背景和補償對這些值進行修正。在本公開的一個方面，各級分的HbA1c百分比之間的差值除以各級分的平均值的差值，得到導(dǎo)出的HbA1c值。這種導(dǎo)出的HbA1c百分比值是HbA1c百分比在一定時間段內(nèi)的百分比變化，并且是在這個時間段期間個體中的血液葡萄糖濃度的量度。對于取自非糖尿病個體的血樣，各級分的導(dǎo)出的HbA1c百分比值不變。在一些實施例中，級分界限值以最初IFCC百分比HbA1c表示，如表1中所示。將列b中的每個級分界限值除以列b的平均值。將所得值乘以樣品的平均IFCCHbA1c百分比值3.44。級分界限值以IFCC百分比HbA1c表示。列d的值由列c的值使用公式(VIII)得出；(d)＝4.54*(e0.157*(c)-1)級分大小(以HbA1c百分比計)＝來自列d的級分(n)-級分(n-1)。在實施例中，在確立上述因素的基礎(chǔ)上，使用由六份正常血樣組成的參考，構(gòu)建時間軸。級分的HbA1c百分比界限值用作任意年齡或時間單位，并構(gòu)建反應(yīng)曲線。反應(yīng)曲線的導(dǎo)數(shù)是水平線，這表示HbA1c形成的恒定速率，如在恒定葡萄糖濃度及上述假設(shè)下所預(yù)期的(圖3D)。如可從圖3E觀察到，時間標度上的級分的大小不規(guī)則，并且彼此有很大差異。這可能是由于這樣的事實：某些年齡的紅細胞由于不同原因而從循環(huán)中消失。在本公開的一個方面中使用的策略是對取自血樣的屬于不同年齡段的紅細胞群體(級分)進行比較，以確定這些群體的細胞的呈現(xiàn)中是否存在波動。可由于以下原因而出現(xiàn)這些波動：死亡、清除，或停留在骨髓、脾等器官中而脫離循環(huán)，在特定時間段期間所產(chǎn)生的細胞的數(shù)量出現(xiàn)波動。在理想模型中，紅血細胞處于恒定葡萄糖濃度的環(huán)境中，HbA1c以恒定速率形成，細胞以恒定速率形成，所有細胞在相同壽命之后被破壞，并且血液循環(huán)之外未發(fā)生細胞的進一步死亡或隱藏。在這種情況下，各級分中的細胞的呈現(xiàn)被稱為100％。在這種樣品中，如圖1B中所示分析的、其中具有等量細胞的級分將顯示出每個級分的HbA1c百分比的恒定上升，并且所有級分將具有恒定大小。對于理想模型而言，當細胞從給定級分中消失時，級分大小將以一定系數(shù)增大，該系數(shù)是來自理想樣品的級分中的100％細胞除以來自樣品的給定級分中所呈現(xiàn)的細胞的百分比。使用上述公式VIII，并保留恒定葡萄糖濃度和HbA1c形成的線性動力學(xué)的假設(shè)，可計算級分中呈現(xiàn)的細胞的百分比。年齡軸開頭的級分(其中細胞較幼小)較大，推測起來是因為細胞在釋放到血流中之前隱藏在骨髓或脾中。在該坐標軸的末尾，級分較大，推測起來是因為老細胞經(jīng)歷了清除。在(圖3F)中，所呈現(xiàn)的細胞的百分比被繪制在年齡軸上。最小級分的值被用作100％。該模式響應(yīng)于這樣的普遍預(yù)期：至少在相當長時間期間，紅細胞在血流中被完全呈現(xiàn)并且尚未經(jīng)歷消除。在實施例中，采用該方法分析血樣中的細胞的呈現(xiàn)。使用這些條件時，細胞數(shù)量的波動看起來是在正常個體中公認正常的波動，從而有力地指示所選條件是正確的(參見示例3、圖3F)。在如上所述的時間軸的計算中，血液所經(jīng)歷的恒定葡萄糖濃度是一種條件。就糖尿病血樣而言，必須考慮葡萄糖濃度的變化。細胞事件分成所述十個級分并不取決于葡萄糖濃度或細胞血紅蛋白，因此可以比較來自正常樣品和糖尿病樣品的對應(yīng)級分。當葡萄糖濃度發(fā)生變化或呈現(xiàn)的細胞的百分比發(fā)生變化時，級分界限的值可變化。與呈現(xiàn)的細胞的百分比的變化相比，葡萄糖濃度的變化在HbA1c百分比對時間的曲線圖上可具有不同效應(yīng)。時間軸由HbA1c百分比軸導(dǎo)出，如在例如實例3中所述。如圖4和圖4b的模擬中所示，級分中的HbA1c百分比的變化或呈現(xiàn)的細胞的百分比的變化均產(chǎn)生類似效應(yīng)。上述分析表明，在不引入新參數(shù)的情況下，無法決定級分界限值的變化是可歸因于時間軸(呈現(xiàn)的細胞的百分比的變化應(yīng)歸因于該坐標軸)還是可歸因于HbA1c百分比軸(葡萄糖濃度的變化應(yīng)歸因于該坐標軸)。級分內(nèi)的平均值的位置是細胞所經(jīng)歷的葡萄糖濃度的指標。由于級分以及級分中的細胞的等級順序與葡萄糖濃度無關(guān)，葡萄糖濃度的變化將使細胞向級分的下端移動或向級分的上端移動，這分別屬于葡萄糖濃度降低或升高的情況。該變化會影響級分中的細胞事件的所計算的平均HbA1c百分比值。為了針對平均值的位置來比較患者級分和參考級分，將參考級分及其級分界限值的位置調(diào)整成適應(yīng)患者的級分(實例5)。將來自正常個體的樣品的、HbA1c百分比軸上的級分的大小與來自糖尿病個體的那些級分的大小進行比較，并且還將級分內(nèi)的平均HbA1c值與參考的調(diào)整平均值進行比較，可以計算導(dǎo)出的HbA1c百分比或葡萄糖濃度的變化。在患者級分平均值與正常參考的對應(yīng)級分平均值相比較的情況下，將表示各自平均值的比率的系數(shù)乘以患者的總細胞平均HbA1c百分比。為了補償不同HbA1c百分比對年齡計算的效應(yīng)，將由該級分表示的時間段除以相同系數(shù)(實例6)。這種雙重修正的結(jié)果在圖4c中示出。正常樣品與糖尿病樣品的級分之間的平均值的位置差異較小。用于計算微分HbA1c值的關(guān)系式在實例5中給出。為了比較時間/年齡曲線圖中的平均血液葡萄糖濃度和HbA1c百分比值，對每名患者引入不同系數(shù)，以使葡萄糖濃度值的平均值與經(jīng)調(diào)整的平均HbA1c百分比值對準(實例7)。HbA1c百分比/年齡曲線圖與患者葡萄糖/實際時間曲線圖相比較，揭示了相似性。通過調(diào)整HbA1c百分比曲線圖的時間軸上的總范圍，可進一步改善該相似性(實例8、圖6)。該經(jīng)調(diào)整的總范圍反映了不同患者的紅細胞壽命的長度。在實施例中，發(fā)現(xiàn)了紅血細胞的壽命與屬于網(wǎng)織紅細胞的RNA參數(shù)和血紅蛋白參數(shù)之間存在相關(guān)性(實例8、圖7)。最開始，在樣品的較老級分中尋找這些參數(shù)。在網(wǎng)織紅細胞的成熟期間，RNA含量逐漸消失，同時血紅蛋白含量上升達到最高值。在RNA含量與血紅蛋白含量乘積的函數(shù)中，遞減的RNA和遞增的血紅蛋白將彼此平衡，并且該函數(shù)的值在網(wǎng)織紅細胞的成熟期間保持不變。然而，如果RNA和血紅蛋白兩者都較低，則在抽取血樣時網(wǎng)織紅細胞未能達到正常血紅蛋白水平。根據(jù)實例8中的觀察結(jié)果，網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)中紅細胞的破裂與網(wǎng)織紅細胞中血紅蛋白的合成之間存在聯(lián)系。鐵的循環(huán)利用也可在這種反饋機制中起到主要作用。多份樣品的最老級分的所計算年齡給出了大約100天的平均值，這短于用鉻標記技術(shù)得出的120天。HbA1c百分比標度上的細胞事件擴展到較高值，這表明達到極高年齡的細胞相當罕見。非常靈敏的鉻標記技術(shù)可能考慮了這些罕見事件。在實施例中，為了估計與用鉻標記技術(shù)得出的壽命可比較的壽命，將外推法應(yīng)用于血液循環(huán)中所呈現(xiàn)的紅血細胞的曲線。如實例10中所述那樣計算獨立樣品中的紅細胞的平均年齡。該分析的級分中細胞年齡的確定提供了時間軸對所選紅血細胞參數(shù)的應(yīng)用。在上述分析中，當前確定了細胞年齡級分的平均細胞血紅蛋白。在圖9中，示出了這些平均細胞血紅蛋白曲線。通常，血紅蛋白在5或6天年齡的細胞中達到最大水平。如所報道，更老年齡的細胞喪失了血紅蛋白(GiffordSC,DergancJ,ShevkoplyasSS,YoshidaT,BitenskyMW.BrJHaematol.2006Nov；135(3):395-404(GiffordSC、DergancJ、ShevkoplyasSS、YoshidaT、BitenskyMW，《英國血液學(xué)雜志》，2006年11月，第135卷，第3期，第395-404頁))。在實施例中，方法包括通過將紅血細胞級分的平均百分比HbA1c與表進行比較來確定該級分的年齡的步驟，所述表提供該級分的平均百分比HbA1c與紅血細胞的年齡之間的關(guān)系式。在實施例中，該方法還包括樣品是否包含比參考細胞群體更老的細胞的較大級分，這指示病情。在實施例中，該病情是糖尿病或貧血。實例1描述了一種測定法，該測定法測量血樣的細胞血紅蛋白和HbA1c百分比，并且將細胞分級成網(wǎng)織紅細胞和十個級分的成熟紅細胞。葡萄糖和血紅蛋白一起不可逆地反應(yīng)而形成HbA1c(Amadori產(chǎn)物)。該反應(yīng)是作為時間和葡萄糖濃度的函數(shù)的連續(xù)現(xiàn)象。HbA1c的形成是糖尿病患者的血糖平衡的控制要素。HbA1c的正常值：占總血紅蛋白的5％。材料與方法。在該測定法中使用以下材料：1.使用作為抗凝劑的0.7mM乙二胺四乙酸(EDTA)處理并且在4℃下儲存不超過十天的血樣。2.球化試劑；0.137M氯化鈉、0.005MHEPES、0.0005M(D+)海藻糖、0.083M甲醛、0.04mM正十二烷基β-D-麥芽糖苷、0.5ml/lProclin-300、0.5mg/l吖啶橙及用于將pH調(diào)至7.5的一定量氫氧化鈉的水溶液3.通透試劑；2.03mMN-月桂酰肌氨酸、10mM琥珀酸、0.22M蔗糖、0.015mM牛血清白蛋白、0.5ml/lProclin-300及用于將pH調(diào)至5.4的一定量吡咯烷的水溶液。4.中和試劑；40mMHEPES、0.5M氯化鈉、0.91mM牛血清白蛋白、0.03M疊氮化鈉、用于將pH調(diào)至7.25的一定量氫氧化鈉及與熒光染料Alexa(生命科技公司(LifeTechnologies))647共價偶聯(lián)的濃度為5mg/l的單克隆抗HbA1c抗體(IgG1)的水溶液。5.固定試劑；0.155M氯化鈉、0.04M磷酸鈉、0.18M硼酸、0.01MEGTA、0.016μM硫酸葡聚糖(MW500,000)、0.62M甲醛及用于將pH調(diào)至7.1的一定量氫氧化鈉或鹽酸的水溶液。6.標記的參考對照細胞的解凍樣品。示例性方法涉及將血樣置于單支試管中。用吖啶橙稀釋血樣。用通透劑固定細胞并共同溫育。然后將對照細胞加入試管中。將熒光標記的抗HbA1c抗體(如美國專利No.7541190中所述的抗體)加入試管中。將熒光抗體/細胞固定，然后通過流式細胞術(shù)測量。標記和分析將4μl體積的不同血樣各自懸浮于200μl的球化試劑中。在溫育1分鐘后，接著將3μl的懸浮液與60μl的通透試劑混合。在溫育1.5分鐘后，添加并混合5μl的標記的參考對照細胞，并且在溫育1分鐘后，添加并混合100μl的中和試劑。在再溫育10分鐘后，添加80μl的固定試劑。在FC500MPL流式細胞儀上，通過側(cè)向散射(SS)測量以及在525nm(FL1)和675nm(FL4)處的熒光測量，分析最終樣品混合物。取自正常受試者的代表性樣品的分析在圖1A中示出。通過側(cè)向散射來測量總細胞血紅蛋白。通過熒光標記物的確定來測量HbA1c。通過以下方式計算％HbA1c：將熒光值除以側(cè)向散射值并乘以100。結(jié)果使用提供熒光(FL4)除以側(cè)向散射(SS)的參數(shù)的算法程序，進一步分析流式細胞儀軟件所提供的樣品列表模式數(shù)據(jù)。分別對區(qū)域A、B和C(圖1A)進行自動設(shè)門和分析。區(qū)域A；取自糖尿病患者的對照細胞，區(qū)域B；紅血細胞網(wǎng)織紅細胞，區(qū)域C；成熟紅血細胞。將百分比HbA1c軸上扣除網(wǎng)織紅細胞的紅細胞群體分級為包含大約相等數(shù)量的細胞的十個級分(圖1A和B)。通過與流式細胞儀相連的計算機程序，給出每個級分的FL4和側(cè)向散射的平均值。對每個通道中的FL4針對熒光溢出進行補償，并且通過乘以級分SS與總平均SS(如通過FLI確定)之比，將如上所述確定的FL4的背景調(diào)整成適應(yīng)每個級分，背景被視為與不同級分中的細胞的側(cè)向散射值成比例。紅細胞的側(cè)向散射是這些細胞的細胞血紅蛋白含量(MCH)的量度。因此可利用流式細胞儀所測量的平均側(cè)向散射值來導(dǎo)出樣品的MCH?？衫昧魇郊毎麅x所測量的675nm處的細胞熒光平均值(FL4)來導(dǎo)出樣品的HbA1c含量。扣除背景值。通過以下方式獲得背景值：在不存在抗HbA1c抗體的情況下且在存在與熒光染料FluorAlexa647共價偶聯(lián)的非特異性同型對照單克隆抗體(IgG1)的情況下，用樣品運行該測定法。通過將紅細胞或樣品的HbA1c含量除以血紅蛋白含量，獲得以任意單位計的HbA1c百分比的量度。在第一種情況下，這種量度通過簡單的除法獲得；FL4/SS。單獨地分析網(wǎng)織紅細胞。如圖1C中所示，將具有低FL4值的含RNA細胞(圖1A、區(qū)域B)與具有高FL4值的污染細胞分離。測量純網(wǎng)織紅細胞的級分。確定以FL4/SS單位計的級分界限和平均值、以任意單位計的FL1值以及以任意單位計的SS值。實例2由參考實驗室使用三種不同測定法得出的HbA1c百分比數(shù)據(jù)與使用流式細胞術(shù)程序得出的HbA1c百分比數(shù)據(jù)的相關(guān)性曲線圖的比較。由參考實驗室使用三種不同HbA1c測定方法對120份樣品確定HbA1c百分比；(PrimusUltra2：親和色譜法，RocheUnimate：免疫比濁法，以及TosohG7變型：陽離子交換色譜法)。在存在HbA1c百分比已知的參考對照細胞的情況下確定流式細胞術(shù)HbA1c百分比值。本文描述了任意HbA1c百分比單位向百分比HbA1c值的換算。方法和結(jié)果在第一種情況下，我們顯示了熒光標記的抗體可以自由接近固定的紅細胞內(nèi)的HbA1c分子。紅細胞經(jīng)甲醛固定并在水中裂解，并且在存在洗滌劑的情況下進一步解體。將裂解物用于競爭性實驗，其中裂解物中和通透的紅細胞中存在等量的HbA1c。在非飽和條件下使用抗體時，裂解物起到抑制作用，并且以與細胞中HbA1c類似的方式進行甲醛固定并用月桂酰肌氨酸處理的裂解物，對抗體結(jié)合抑制達到50％，表明抗HbA1c抗體可以自由接近細胞中的HbA1c分子(圖2A)。通過以下方式計算樣品的HbA1c百分比：將樣品的HbA1c含量除以樣品的平均細胞血紅蛋白含量。通過與混合了樣品的參考對照細胞的MCH和HbA1c百分比的已知值的比較，可以確定MHC和HbA1c百分比。由參考實驗室獲得120份樣品。在每份樣品中，參考實驗室使用三種不同測定法測量了HbA1c百分比值。(圖12)根據(jù)NGSP標準化來表示參考實驗室所提供的HbA1c百分比值。患者和正常個體的NGSPHbA1c百分比值與平均葡萄糖濃度值的比較顯示，與相關(guān)性曲線的原點具有2.15％的截距。在細胞的較幼小級分中發(fā)現(xiàn)極低HbA1c百分比值。因此，使用了根據(jù)IFCC標準化的HbA1c百分比值，這在HbA1c百分比對平均葡萄糖濃度相關(guān)性曲線中未顯示截距，并且反映更合理的HbA1c百分比。換算公式：NGSP＝(0.915*IFCC)+2.15(公式IX)在以下文獻中提供(DavidB.Sacks發(fā)表的ADA/EASD/IDFworkinggroupoftheHbA1cassay.ClinicalChemistry,2005；51:681-683(HbA1c測定法的ADA/EASD/IDF工作組；《臨床化學(xué)》，2005年；第51卷，第681-683頁))。在換算成內(nèi)部參考對照細胞及參考實驗室所提供的值的IFCCHbA1c百分比值之后，構(gòu)建了如圖2B中給出的相關(guān)性曲線。該曲線的分析揭示了如一級反應(yīng)所預(yù)期的對數(shù)函數(shù)。使用以下公式換算流式細胞術(shù)任意HbA1c百分比值：IFCCHbA1c百分比＝4.54*(e0.157*流式細胞術(shù)任意HbA1c百分比-1)(公式X)，得到斜率為1、R2為0.9且經(jīng)過原點的線性相關(guān)曲線(圖2B)。對于血樣或細胞群而言，該公式用于計算IFCCHbA1c百分比值。利用此前公布的相關(guān)性實驗的數(shù)據(jù)來確定如該測定法中所用的抗HbA1c抗體的結(jié)合動力學(xué)，例如如美國專利No.7,968,279中所述，其中通過參考實驗室并通過所述的流式細胞分析，同時分析120份樣品。根據(jù)已公布的說明，將參考實驗室所提供的由該實驗得出的參考HbA1c百分比值從當前NGPS值換算為新IFCC值(DavidB.Sacks發(fā)表的ADA/EASD/IDFworkinggroupoftheHbA1cassay；ClinicalChemistry.2005；51:681-683.(HbA1c測定法的ADA/EASD/IDF工作組；《臨床化學(xué)》，2005年；第51卷，第681-683頁))。新IFCC值與NGPS值不同之處在于沒有對于零值的截距，因此更適合我們的研究，在我們的研究中包括幼小細胞的較低值。所得的相關(guān)性在圖2B中示出?？紤]到作為一級反應(yīng)的抗體結(jié)合響應(yīng)于對數(shù)函數(shù)，將其逆函數(shù)指數(shù)公式應(yīng)用于流式細胞術(shù)數(shù)據(jù)，得到線性相關(guān)性，其中回歸線經(jīng)過圖形的原點(圖2c)。抗體結(jié)合動力學(xué)：逆函數(shù)：y＝c1*(ex*c2-1)(公式VII)其中y是由參考實驗室給出的以IFCC單位計的HbA1c百分比，x是在存在內(nèi)部參考對照細胞的情況下確定的流式細胞術(shù)HbA1c百分比，并且c1和c2是常數(shù)。計算抗HbA1c抗體的結(jié)合動力學(xué)并在整個研究中使用。在圖2C中，使用以下公式來轉(zhuǎn)換歸一化的FL4/SS數(shù)據(jù)：y＝c*e0.157*x(公式1)其中y是轉(zhuǎn)換的數(shù)據(jù)，x是歸一化的FL4/SS數(shù)據(jù)，并且c是常數(shù)(2.74)。相關(guān)系數(shù)R2＝0.94。實例3得自六名正常受試者的數(shù)據(jù)；不同級分中FL4/SS值和經(jīng)修正的FL4/SS值的表示，以及各級分中的HbA1c百分比向時間的轉(zhuǎn)換。該實例提供得自六名正常受試者的數(shù)據(jù)以及級分界限FL4/SS值向時間的換算。出于與取自糖尿病個體的血樣進行比較的原因，在第一種方法中，選擇代表被認為經(jīng)歷了恒定血液葡萄糖濃度的正常非糖尿病個體的血樣。為了進一步確認由正常樣品得出的參數(shù)代表恒定血液葡萄糖濃度，對6份正常樣品的參數(shù)取平均值。如實例1中所述，使用由流式細胞儀產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)將成熟細胞群體分級為包含等量細胞的級分。按細胞的HbA1c百分比的增加，在HbA1c百分比軸上組織細胞(圖1B)。不論該增加是快速、緩慢還是不規(guī)則，都對細胞事件在該坐標軸上的等級順序沒有影響。只有當增加值為零或負時，才會嚴重干擾該組織。然而由于葡萄糖始終存在于血液中并且形成HbA1c復(fù)合物的Amadori反應(yīng)具有不可逆性，因此這不可能發(fā)生。如下所述，F(xiàn)L4/SS軸上的級分的大小的計算將依據(jù)參考樣品所提供的數(shù)據(jù)。因此可將其他樣品的所計算HbA1c百分比值應(yīng)用于級分而無需修改。細胞等級順序的穩(wěn)定性使該技術(shù)也適用于分析取自糖尿病受試者或血液學(xué)異常的受試者的樣品。通過流式細胞分析來確定這些樣品的HbA1c百分比值。被認為恒定的導(dǎo)出的HbA1c百分比值被賦予HbA1c百分比的值。方法和結(jié)果對取自六名正常受試者的血樣按實例1進行處理和分析。在理想模型中，紅血細胞處于恒定葡萄糖濃度的環(huán)境中，HbA1c以恒定速率形成，細胞以恒定速率形成，所有細胞在120天的相同壽命之后被破壞，并且血液循環(huán)之外未發(fā)生細胞的進一步死亡或隱藏。在這種樣品中，如圖1b中所示分析的、其中具有等量細胞的級分將顯示出每個級分的HbA1c百分比的恒定上升。在這種模型中，圖1b中的FL4/SS或HbA1c百分比軸上的區(qū)段應(yīng)具有相等大小。圖1b的樣品從正常受試者采集(實例3)以便接近理想模型。圖1b中的區(qū)段大小不相等的原因可歸結(jié)于所用樣品的特性與如上所概述的理想樣品的任何特性之間的差異。使用取自未患糖尿病的血液學(xué)正常受試者的樣品時，可推測圖1b的區(qū)段分布根源于獨立細胞的不同壽命以及細胞隱藏在從中取樣的血液之外。對于理想模型而言，因死亡或隱藏而消失的細胞(以血流中的所呈現(xiàn)的細胞的百分比來表示)將使如圖1b中的HbA1c百分比軸上的級分大小增大?？紤]到構(gòu)建圖1b時的條件，關(guān)系式為；(級分中所呈現(xiàn)的細胞的百分比)＝1/(HbA1c百分比標度上的級分大小)。在我們使用的模型中，可推測血液中紅細胞的HbA1c百分比隨時間而增加，因此(級分中所呈現(xiàn)的細胞的百分比)＝1/(HbA1c百分比標度上表示的時間)。在圖3a中，示出了未修正的HbA1c百分比與級分編號的關(guān)系。在圖3b和3c中，對HbA1c百分比進行修正，并且將級分大小替換為最初時間并進行調(diào)整，以給出HbA1c百分比隨細胞年齡的線性增加。具有高HbA1c百分比且細胞表現(xiàn)性較低的級分此時被分配更大的時間量。這是合理的，因為與理想模型相比，在真實情況下，高HbA1c級分表示一部分尚未出現(xiàn)或已消失的細胞。為了解釋取自六名正常受試者的參考樣品與假設(shè)模型之間較老級分的差異，可假定較老級分中的時間軸的修正主要針對網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)對紅細胞的清除率進行修正。該模型還允許計算分配給未成熟細胞的年齡。在該參考樣品中，此時間大約為分配給成熟細胞的第一級分的時間的30％，該年齡級分直接跟隨在網(wǎng)織紅細胞之后。考慮到存在10個級分，這意味著未成熟細胞的數(shù)量大約占紅血細胞總數(shù)的3％。我們在該測定法中發(fā)現(xiàn)的網(wǎng)織紅細胞占細胞總數(shù)的百分比僅為0.5％。明顯地，處于血紅蛋白形成與RNA消失之間的成熟階段的細胞大約80％未進入血流。對于時間計算而言，該實例中使用了FL4/SS的級分界限值和每個級分中的細胞數(shù)量的數(shù)據(jù)。未使用網(wǎng)織紅細胞級分的級分界限值。實際上，大多數(shù)未成熟紅細胞從血液循環(huán)缺如。因此，循環(huán)中存在的網(wǎng)織紅細胞被視為未成熟紅細胞的最成熟部分，故而網(wǎng)織紅細胞的平均FL4/SS值也被用作未成熟細胞的級分界限。圖3A是每個級分的IFCCHbA1c百分比的圖形表示。如實例2中所述的那樣從正常人受試者獲得FL4/SS級分，并如圖1中所示的那樣進行分析。這些級分如表1中所示并賦予了1至10的值，R表示網(wǎng)織紅細胞。對于每個級分而言，將平均FL4/SS值轉(zhuǎn)換成如表1中所示的IFCCHbA1c百分比值。將來自列(a)和(c)的值用于圖3A。圖3(B)是IFCCHbA1c百分比在時間軸上的圖形表示。圖3(C)是IFCCHbA1c百分比在年齡軸上的圖形表示。年齡以負值的天數(shù)表示。將來自表1的列(d)和(i)的值用于圖3B和圖3C。圖3(D)是導(dǎo)出的IFCC百分比HbA1c值對年齡的圖形表示。圖3C的求導(dǎo)得到常數(shù)值(參見表1)。該值已被歸一化為參考樣品的實測平均IFCCHbA1c百分比。將列(i)的值以及針對樣品的平均IFCCHbA1c百分比值進行歸一化的常數(shù)值(d)/(i)(3.44)用于圖3D，作為圖1C的微分。圖3(E)是每個級分的級分大小的圖形表示。如表1中所示的那樣計算以IFCCHbA1c百分比單位表示的級分大小。圖3(F)是血液循環(huán)中所呈現(xiàn)的細胞的百分比在年齡軸上的圖形表示。該百分比的計算結(jié)果在表1中給出。將列(a)和(e)的值用于圖3E，并且將來自列(h)和(i)的值用于圖3F。圖3A-3F中表示的值匯總于表1中。表1計算每個級分的IFCCHbA1c百分比(圖3A)、以天數(shù)計的每個時間的IFCCHbA1c百分比(圖3B)或以天數(shù)計的每個年齡的IFCCHbA1c百分比(圖3C)；以及計算以天數(shù)計的每個時間的IFCCHbA1c百分比的導(dǎo)數(shù)(圖3D)。每個級分的級分大小(圖3E)，以及計算作為以天數(shù)計的時間的函數(shù)的呈現(xiàn)的細胞(圖3F)。a.網(wǎng)織紅細胞以及按編號列出的級分，如圖1B中給出。b.HbA1c熒光值除以級分界限的側(cè)向散射值，如圖1B中給出。血流中存在的網(wǎng)織紅細胞的平均值被用作級分界限值。最后級分10的級分界限估計為最后級分10的平均熒光值加上級分8和9的級分界限值之差的一半。針對熒光的背景和補償對這些值進行修正。c.以最初IFCC百分比HbA1c表示的級分界限值。將列b中的每個級分界限值除以列b的平均值。將所得值乘以樣品的平均IFCCHbA1c百分比值3.44。d.以IFCC百分比HbA1c表示的級分界限值。列d(d)的值由列c的值使用公式(VIII)得出；(d)＝4.54*(e0.157*(c)-1)e.以HbA1c百分比計的級分大?。絹碜粤衐的級分(n)-級分(n-1)。f.倒數(shù)值；1/根據(jù)公式(II)的列e的級分(n)的值。g.每個級分的細胞事件的數(shù)量。h.列f的值乘以列g(shù)的值。列h的最大值被用作100％。相應(yīng)地計算其他值。i.來自列e的級分10的值被用作100天。相應(yīng)地計算列j的其他值。使用上述公式VIII，并保留恒定葡萄糖濃度和HbA1c形成的線性動力學(xué)的假設(shè)，可計算級分中呈現(xiàn)的細胞的百分比。年齡軸開頭的級分(其中細胞較幼小)較大，推測起來是因為細胞在釋放到血流中之前隱藏在骨髓或脾中。在該坐標軸的末尾，級分較大，推測起來是因為老細胞經(jīng)歷了清除。在(圖3F)中，所呈現(xiàn)的細胞的百分比被繪制在年齡軸上。最小級分的值被用作100％。該模式響應(yīng)于這樣的普遍預(yù)期：至少在相當長時間期間，紅細胞在血流中被完全呈現(xiàn)并且尚未經(jīng)歷消除。在實施例中，采用該方法分析血樣中的細胞的呈現(xiàn)。使用這些條件時，細胞數(shù)量的波動看起來是在正常個體中公認正常的波動，從而有力地指示所選條件是正確的(圖3F)。在如上所述的時間軸的計算中，血液所經(jīng)歷的恒定葡萄糖濃度是一種條件。就糖尿病血樣而言，必須考慮葡萄糖濃度的變化。細胞事件分成所述十個級分并不取決于葡萄糖濃度或細胞血紅蛋白，因此可以比較來自正常樣品和糖尿病樣品的對應(yīng)級分。當葡萄糖濃度發(fā)生變化或呈現(xiàn)的細胞的百分比發(fā)生變化時，級分界限的值可變化。與呈現(xiàn)的細胞的百分比的變化相比，葡萄糖濃度的變化在HbA1c百分比對時間的曲線圖上可具有不同效應(yīng)。時間軸由HbA1c百分比軸導(dǎo)出，如在例如實例3中所述。時間軸相對于HbA1c反應(yīng)/時間曲線的修正。使用由標準曲線導(dǎo)出的公式以及根據(jù)實例3對時間/百分比軸的修改，提供了與葡萄糖值的合理擬合，但對于不同年齡的細胞從血流回收而言給出了不太可能的圖形。尤其是較幼小年齡群體似乎代表性不足。明顯地，葡萄糖和血紅蛋白的反應(yīng)遵照的時間曲線不完全呈直線而是具有飽和曲線的外觀。Amadori反應(yīng)的最開始幾步不是不可逆的，這可能造成飽和效應(yīng)。另外，糖化血紅蛋白經(jīng)歷進一步反應(yīng)而生成糖化終末(AGE)產(chǎn)物(參見Makita,Z.etalScience1992,vol.258,pp651-653(Makita,Z.等人，《科學(xué)》，1992年，第258卷，第651-653頁))。應(yīng)用于時間軸的公式(XII)：y＝x1.3的應(yīng)用給出了與不同年齡的細胞從血流回收的百分比的良好擬合(實例3、圖3H)。所得的曲線提供了作為時間的函數(shù)的“實際HbA1c值”(圖3E)。該曲線的導(dǎo)數(shù)于是提供了作為時間級分的函數(shù)的實際HbA1c百分比形成速率(圖3F)?！癏bA1c速率”在本文被定義為樣品的平均HbA1c值，要是給定年齡級分中的HbA1c百分比的形成速率將為紅細胞整個生命周期的形成速率。由于實際HbA1c形成速率隨時間下降，與葡萄糖值進行比較是不可行的。為此，將如圖3D中所示給出隨時間推移的常數(shù)值的導(dǎo)出的HbA1c百分比值與新構(gòu)建的時間軸結(jié)合。假定標準曲線的應(yīng)用以及飽和效應(yīng)的排除提供了僅依賴于葡萄糖濃度的HbA1c形成速率，則經(jīng)修改的HbA1c形成速率將稱為“葡萄糖依賴性HbA1c百分比速率”。用于計算時間軸的參考值用作計算來自不同樣品的級分中的細胞年齡的模板(“時間模板”)。級分的HbA1c百分比界限值用作任意年齡或時間單位，并構(gòu)建反應(yīng)曲線(實例3、圖3A、B和C)。反應(yīng)曲線的導(dǎo)數(shù)將為水平線，這表示HbA1c形成的恒定速率，如在恒定葡萄糖濃度及上述假設(shè)下所預(yù)期的(圖3D)。如可從圖3E觀察到，時間標度上的級分的大小不規(guī)則，并且彼此有很大差異。這可能是由于這樣的事實：某些年齡的紅細胞由于不同原因而從循環(huán)中消失。實例4該實例描述了26名糖尿病患者的血紅蛋白的分析。方法和結(jié)果在獲得當?shù)貍惱砦瘑T會批準的情況下進行包括26名糖尿病患者的研究。這些患者從到糖尿病門診看病的患者中選取，而不考慮糖尿病的類型或其他病理狀況。選取一天測量并管理其自身毛細血管葡萄糖值數(shù)次的患者，并從他們記錄了一段時間葡萄糖測量的筆記本中復(fù)制。將血液抽取到EDTA上，并如實例1中所述的那樣分析。使用流式細胞術(shù)程序測量HbA1c。計算在抽取血樣之前的30天時間段內(nèi)每名患者的平均葡萄糖值，并且將這些平均值與流式細胞術(shù)程序的HbA1c值進行比較，顯示出R2值為0.45的相關(guān)性(圖5A)。該低相關(guān)性正如預(yù)期，在文獻中已有報道(McCarteretal.DiabetesCare.2004；27:1259-1264(McCarter等人，《糖尿病醫(yī)療》，2004年；第27卷，第1259-1264頁)，Hudsonetal.Ann.Clin.Biochem.1999；vol.36,451-459(Hudson等人，《臨床生化年鑒》，1999年；第36卷，第451-459頁))。表2A-2E示出了患者8的各年齡級分相對于參考而言的HbA1c百分比導(dǎo)數(shù)或葡萄糖濃度的計算。表2A參考；各級分相對于參考級分的位置的計算。表2A患者8；各級分相對于參考級分的位置的計算。abcdef網(wǎng)織紅細胞(R)級分149.001.2600.740.26級分272.001.2500.750.25級分395.001.2800.720.28級分4117.001.3000.700.30級分5136.001.3100.690.31級分6154.001.3200.680.30級分7171.001.3000.700.30級分8191.001.3000.700.30級分9217.001.2800.720.28級分10261.891.2400.760.24a.按編號列出的級分，如圖1B中給出。b.FL4/SS標度上的級分界限值，如圖1B中給出；最后級分10的級分界限估計為最后級分10的平均熒光值加上級分8和9的級分界限值之差的0.5倍。未針對對熒光的背景和補償對這些值進行修正。c.樣品的(b)值除以參考的(b)值，顯示了級分界限相對于參考的位置。d、e和f.樣品級分中分別分配給參考的前一個級分(d)、對應(yīng)級分(e)和下一個級分(f)的部分。表2B參考；各級分內(nèi)的平均HbA1c值的位置的計算。表2B患者8；各級分內(nèi)的平均HbA1c值的位置的計算。aghijklmn網(wǎng)織紅細胞(R)15.2615.2615.2650.160.591.790.33級分130.3730.3743.1344.7944.791.671.601.05級分255.9025.5424.3167.7122.930.940.821.15級分378.9923.0922.7890.7623.050.880.821.07級分4101.4722.4821.57112.7922.030.840.791.06級分5122.12420.6519.48131.8419.050.750.681.11級分6140.4418.3217.96149.9418.100.700.651.08級分7158.0417.5917.91167.0517.100.690.611.14級分8176.2718.2320.56187.2020.150.800.721.11級分9199.1522.8834.61213.3626.161.340.931.44級分10245.4846.3346.33258.4845.121.801.611.12g.FL4/SS標度上的級分平均值，如圖1B中給出。針對熒光的背景和補償對這些值進行修正。h.級分平均值之間的差值；hn＝gn-gn-1。單獨地添加網(wǎng)織紅細胞值。i.級分平均值差值(h)與級分界限的同步(參見圖1B)；in＝(hn+hn+1)/2。在級分1中，因h1的長度只有一半，故乘以2。網(wǎng)織紅細胞級分不同步。j.(b)的級分界限值，但針對熒光的背景和補償對其進行了修正。作為網(wǎng)織紅細胞的級分界限值，取平均值。k.級分界限值之間的差值(級分大小)；kn＝j(luò)n-jn-1。單獨地確定網(wǎng)織紅細胞的級分大小。l.將同步的級分平均值差值(i)除以(i)值的平均值，得到平均值為1的值。m.將級分界限值(k)除以(k)值的平均值，得到平均值為1的值。n.平均值在級分內(nèi)的位置；l/m。表2C參考；每個級分的導(dǎo)出的NGSPHbA1c百分比的計算以及與葡萄糖濃度值的比較。aopqrst網(wǎng)織紅細胞(R)10015.30106級分110015.30106級分210015.30106級分310015.30106級分410015.30106級分510015.30106級分610015.30106級分710015.30106級分810015.30106級分910015.30106級分1010015.30106表2C患者8；每個級分的導(dǎo)出的NGSPHbA1c百分比的計算以及與葡萄糖濃度值的比較。o.參考平均值相對于樣品級分的位置的計算；將(d)、(e)和(f)乘以參考的(n)并求和。p.(o)-1。q.平均值在級分內(nèi)的位置相對于參考的修正位置的轉(zhuǎn)換；將(q)絕對值的平方根乘以1或-1，具體取決于(q)的符號。將結(jié)果乘以常數(shù)；0.4。r.(r)+1s.每個級分的導(dǎo)出的NGPSHbA1c百分比值，其通過將(s)乘以樣品的NGPSHbA1c百分比值得出。t.將自我監(jiān)測所確定的以mg/100ml表示的級分的葡萄糖濃度的平均值除以級分(t)的導(dǎo)出的HbA1c百分比值的平均值。將所得系數(shù)乘以每個級分的(t)值，得到與葡萄糖濃度值可比較的相對導(dǎo)出的HbA1c百分比值。表2D參考；各級分的年齡的計算。表2D患者8；各級分的年齡的計算。auvwxyzaaabacad網(wǎng)織紅細胞(R)0.120.400.070.070.082330.083.513.51級分10.341.180.200.140.1435751.000.146.419.92級分20.521.780.320.120.1136251.010.115.1015.01級分30.692.390.450.130.1335010.980.135.8520.87級分40.862.970.590.140.1436661.020.156.8227.69級分51.013.470.720.130.1235570.990.125.6133.31級分61.153.940.860.130.1435921.000.146.3239.63級分71.284.390.990.140.1335010.980.126.6545.28級分81.434.921.170.170.2036231.010.209.1954.47級分91.635.611.410.250.2235430.990.2210.2464.71級分101.986.801.910.490.4837231.040.4922.8487.55u.除網(wǎng)織紅細胞級分以外與列(j)中相同的級分界限值。在該級分中，取平均值。將每個級分的值(j)除以各級分的平均值。v.將(u)的值乘以參考樣品的IFCCHbA1c百分比(3.44％)w.將公式XI應(yīng)用于(v)的值；w＝e0.157*(v)-1x.w的值之間的差值；x＝wn-wn-1。y.將(x)的值除以級分的平均值的位置，后者是相對于參考的對應(yīng)級分的平均值的位置(如列(s)中)而言的。z.每個級分中的細胞事件的總數(shù)。aa.將(z)除以十個級分的細胞事件數(shù)并乘以10。ab.(y)*(aa)。ac.將(ab)乘以通過最佳擬合確定的或如表E中給出的那樣計算的壽命系數(shù)。在該表中，使用通過最佳擬合確定的壽命系數(shù)。ad.(ac)的累積值；acn+acn-1，表示以天數(shù)計的級分的年齡。表2E參考；壽命系數(shù)的計算。aaeafagahaiajakalam5網(wǎng)織紅細胞(R)6.435.386.1210.5540.921.001.0064.64全部樣品1.050.8840.80表2E患者8；壽命系數(shù)的計算。aaeafagahaiajakalam網(wǎng)織紅細胞(R)8.397.307.9318.1737.600.940.9081.10全部樣品1.090.9240.00ae.吖啶橙RNA染色；FL1(488nm)熒光值。af.將網(wǎng)織紅細胞(ae)減去細胞總數(shù)(ae)。ag.將細胞總數(shù)(ae)減去FL1背景值(0.17)。ah.將網(wǎng)織紅細胞(af)除以細胞總數(shù)(ag)。ai.將(ah)乘1.3次方。aj.細胞血紅蛋白含量；側(cè)向散射值。ak.將網(wǎng)織紅細胞(aj)除以細胞總數(shù)(aj)。al.將(ak)乘1.7次方。am.將(ai)*(al)乘以常數(shù)值(6.10)。(am)表示壽命系數(shù)。使用時間軸的參考值計算不同樣品的時間軸。假定葡萄糖HbA1c百分比速率的水平恒定及大約120天的壽命，以此假定為基礎(chǔ)，確定參考樣品的時間軸。然而無法直接計算如實例4中所述的患者樣品的時間軸，這是由于葡萄糖依賴性HbA1c百分比速率在這些患者中將不恒定。為了由患者樣品計算時間軸，使用參考(時間模板)的HbA1c值的微分，因為其用于參考的最初時間軸的計算。應(yīng)用患者樣品所固有的變量來修改樣品的x軸。這些變量的選擇很重要，這是由于它們不僅影響x軸上的時間，而且間接影響患者樣品的葡萄糖依賴性HbA1c百分比值，原因在于x值構(gòu)成葡萄糖依賴性HbA1c值的公式的一部分；d(y)/d(x)。如參考樣品情形中所進行的那樣由d(y)導(dǎo)出d(x)將得到平直線，這是參考樣品情形的目的，而非患者樣品情形的目的。影響x軸上的時間的變量是：1)如由計算機給出的每個級分中的細胞的數(shù)量，2)相對于理想模型而言患者樣品中所呈現(xiàn)的細胞的數(shù)量，或如圖1B(公式1)中給出的原始FL4/SS標度上的級分的長度的倒數(shù)，這也由計算機給出。應(yīng)用這些修正不會得到如上所述的平直線。級分內(nèi)的平均值的位置已明確地排除在外，這是由于該位置確切地反映各級分之間的HbA1c速率水平的差異。如需演示說明；參見實例6。該操作還可以相反方式進行，不對樣品時間模板就級分的長度的倒數(shù)進行修正，而是對級分內(nèi)的平均值的位置(這可如實例6中所示的那樣使用幾何平均數(shù)計算)進行修正。實例5和表2中展示了修正系數(shù)1和2的應(yīng)用。為了確認最新構(gòu)建的時間軸與參考樣品的時間軸最佳可比較，將坐標軸上的時間級分的總天數(shù)恢復(fù)到參考時間軸的115天總天數(shù)。如實例7中所示，此時將患者樣品的HbA1c百分比值的微分d(y)除以級分的最新計算的時間值d(x)。按如下方式進行圖形表示：將d(x)/d(y)或葡萄糖依賴性HbA1c百分比值對級分時間值d(x)的積分(x)作圖。實例5該實例描述了取自糖尿病患者的血樣的分析以及各級分內(nèi)的平均HbA1c值的位置。方法和結(jié)果如實例1和圖1中所示，制備并分析非糖尿病和糖尿病全血樣。收集每個成熟紅細胞級分的FL4/SS級分界限值以及FL4/SS平均值。作為非糖尿病參考，使用六名正常受試者的數(shù)據(jù)，如實例3中所述。參考的級分的導(dǎo)出HbA1c百分比，作為年齡的函數(shù)，本意是平坦的，并且被賦予平均NGSPHbA1c百分比的常數(shù)值。如實例3中展示的那樣FL4/SS軸向時間軸的轉(zhuǎn)換，僅可應(yīng)用于其導(dǎo)出的HbA1c百分比值被認為恒定的血樣。在血液葡萄糖濃度隨時間推移而發(fā)生變化的糖尿病患者中，無法作出這種假設(shè)。就糖尿病患者而言，如FL4/SS軸上測量的級分的大小不僅是由該級分表示的年齡段的函數(shù)，而且是HbA1c百分比的可能變化的函數(shù)。在一個級分中，以導(dǎo)出HbA1c百分比表達的HbA1c百分比的變化，與由算法計算的該級分內(nèi)的平均FL4/SS值的位置具有關(guān)系。如圖1B中所示的曲線圖中平均值在一個級分內(nèi)的位置，由細胞的數(shù)量與細胞的FL4/SS值的乘積限定。平均值的位置是這樣的位置：低于平均位置的這些乘積和高于平均位置的這些乘積是相等的。這意味著如圖1B中所示的級分的表面被分成兩個相等部分。糖尿病患者的細胞所經(jīng)歷的導(dǎo)出HbA1c值的偏高或偏低變化，將分別引起級分內(nèi)的平均FL4/SS值偏高或偏低的重新定位。通過將平均值的值除以級分的大小，級分內(nèi)的平均值的位置的每次移動都與細胞的年齡無關(guān)，因此可用于計算糖尿病患者的級分的導(dǎo)出的HbA1c百分比值。使用樣品的級分內(nèi)的平均值的位置與參考的級分內(nèi)的平均值的位置相比較，來直接計算患者樣品的導(dǎo)出的HbA1c百分比。為了確保計算正確，必須考慮患者級分不具有與參考級分類似的大小。由于級分的平均值取決于級分界限在FL4/SS軸上的位置，在第一步中，確定樣品級分相對于參考級分的重疊。相應(yīng)的、前面的和后面的級分的這些重疊的計算在表2A中示出。疊加的級分由值1表示(列d、e和f)?？紤]到如表2A中所示的重疊，計算了樣品級分的平均值的相對位置。計算對重疊進行修正后樣品位置與參考位置的商，如表2B列n中所示。值1表示兩個位置的同一性(表2C、列o)。為了比較患者與參考之間對應(yīng)級分中平均值的相對位置，通過減去1而得到患者級分的平均值的偏差(表2C列p)。為了獲得與級分相關(guān)的微分HbA1c百分比或葡萄糖濃度的線性關(guān)系式，必須應(yīng)用兩種另外的修正；首先，如上所述，如圖1B中所描繪的平均值將級分分成具有相等表面的兩個部分。平均值的位置因此取決于該表面，并取決于決定HbA1c百分比增加值的函數(shù)的積分。該增加值的函數(shù)未知，但可推測該函數(shù)應(yīng)呈線性或接近線性。在這種情況下，平均值的偏差是導(dǎo)出的HbA1c百分比或葡萄糖濃度的平方的函數(shù)。相反，平均值的位置相對于參考的偏差與微分HbA1c值或葡萄糖濃度的平方根有關(guān)(表2C、列q)。上述計算提供了平均值的偏差與導(dǎo)出HbA1c百分比值的變化之間的關(guān)系式，從而在參考樣品(據(jù)信已經(jīng)歷恒定葡萄糖濃度)與糖尿病患者樣品之間進行比較。在對由患者管理的葡萄糖濃度的變化與導(dǎo)出HbA1c百分比的計算的變化進行仔細比較之后，將常數(shù)(表2C、列q)乘以該計算的最終結(jié)果，從而確認與葡萄糖濃度的最佳擬合。由此獲得的系數(shù)顯示出HbA1c百分比的導(dǎo)數(shù)相對于參考的增加值或減小值。與樣品的HbA1c百分比相乘，得到級分的導(dǎo)出HbA1c百分比值(表2C列r)。如表2D中所示，在對每個級分中的細胞的確切數(shù)量進行修正后，時間段不與如實例3中那樣給出120天壽命的系數(shù)相乘，而是與如實例7和表2E中所概述的壽命系數(shù)相乘，所計算的時間提供了級分的年齡。此時可構(gòu)建級分的導(dǎo)出HbA1c百分比的時間曲線，并且與患者血漿中的所監(jiān)測葡萄糖濃度進行比較(圖6)。在計算導(dǎo)出HbA1c年齡曲線時計入以下考慮因素。對于級分界限而言，使用以下修改。在最后級分N°10的區(qū)域中，細胞事件非常分散，還疑似有污染事件。因此，該級分界限由其平均值和之前的兩個級分界限之差估算得出，如表2B中所示。網(wǎng)織紅細胞級分的RNA染色不同于成熟紅細胞，被單獨分析。只有少部分最成熟的網(wǎng)織紅細胞在血液中循環(huán)。因此，網(wǎng)織紅細胞級分的平均值將實際上與級分界限一起下降。為了計算時間軸，將平均值用作級分界限。然而，對于導(dǎo)出HbA1c百分比的計算而言，這將不允許測量級分內(nèi)的平均值的變化。在這些網(wǎng)織紅細胞的最高HbA1c值處選擇級分界限得到了相對較高值，這是由于最高HbA1c的網(wǎng)織紅細胞伸展很遠。然而，該級分界限的選擇看起來可用于測量HbA1c平均值的相對位置的變化(表2b、列k)。平均值在級分內(nèi)的相對位置是平均值除以級分大小。由于級分界限值比級分的平均值提前半個級分，將級分的平均值向前移動半個級分，以便級分界限值和級分平均值在時間標度上同步(表2B、列i)。實例6該實例顯示了應(yīng)用于糖尿病患者樣品的最初時間標度的構(gòu)建。方法和結(jié)果如實例1以及實例3和5中所述的那樣得出和計算FL4/SS級分界限值。并不使用網(wǎng)織紅細胞級分界限值，而是使用網(wǎng)織紅細胞平均值。如實例3和5中所概述，網(wǎng)織紅細胞級分界限值是虛高的，應(yīng)當處于或接近級分值。針對FL1的補償和背景，對級分界限值進行修正。用于6名正常受試者的參考匯編的最初時間標度在圖3c和3d中示出，并且如表1中所示的那樣計算。該最初時間標度用作確定糖尿病患者的時間標度的模板，其中以與參考樣品的級分類似的方式導(dǎo)出和計算級分。在參考樣品與糖尿病患者樣品之間比較，用于構(gòu)建圖1b的計算機數(shù)據(jù)。對以下兩者進行比較：A，患者樣品每個級分中的細胞的確切數(shù)量，與參考樣品相應(yīng)級分中的細胞的確切數(shù)量。將患者值除以參考值，并且將模板時間值除以根據(jù)細胞百分比與時間呈負相關(guān)的原則得出的系數(shù)(參見表2A，了解該計算)。比較患者樣品與參考樣品之間相應(yīng)級分在FL4/SS軸上的級分長度。為此，通過減法運算來測量如圖1b中所示的相鄰截止值之間的距離(參見表2B)。對于相應(yīng)級分而言，將患者值除以參考值，并且將模板時間值乘以所得的系數(shù)(參見表2C，了解該計算)。上述修正系數(shù)不能應(yīng)用于網(wǎng)織紅細胞級分，后者須單獨分析。然而在將網(wǎng)織紅細胞的葡萄糖濃度與FL4/SS值進行比較的實驗中，觀察到歸屬于網(wǎng)織紅細胞的時間與成熟細胞的第一級分的時間之間存在相關(guān)性。將參考樣品的網(wǎng)織紅細胞的時間與參考樣品的第一級分的時間之比應(yīng)用于患者樣品。根據(jù)網(wǎng)織紅細胞的血紅蛋白含量進行第二次修正。血紅蛋白的低水平與網(wǎng)織紅細胞的緩慢成熟相關(guān)，因此必須通過除以下列系數(shù)來增加額外時間；(參考樣品的網(wǎng)織紅細胞細胞血紅蛋白/患者樣品的網(wǎng)織紅細胞細胞血紅蛋白)0.3(參見表2D，了解該計算)。為了計算級分的年齡，以與實例3中給出的計算類似的方式應(yīng)用時間計算。圖4中給出了HbA1c百分比導(dǎo)數(shù)的變化將如何影響時間的計算。上述計算提供了HbA1c導(dǎo)數(shù)的變化系數(shù)(表2C、列r)，并且將時間段除以該系數(shù)。使用參考的平均HbA1c將患者樣品的修正FL4/SS值歸一化，并且代入公式(I)進行計算，如(表2D列w)中所示。如圖4中所概述，所得出的值對HbA1c百分比值的微分變化進行修正。圖4提供了正常受試者的血液葡萄糖濃度短暫上升的效應(yīng)的模擬的圖形表示；(A)；如圖3B中那樣呈現(xiàn)并如實例3和表1中那樣確定的正常受試者的HbA1c曲線；(B)；與(A)中一樣，但存在血液葡萄糖濃度的短暫上升；(C)；與(B)中一樣，但如實例5和表3中所述的那樣確定。由于時間軸由HbA1c百分比值導(dǎo)出，在如以下4(a)所示的曲線圖中，％HbA1c的短暫升高將影響％HbA1c軸以及時間軸4(b)。需要％HbA1c的獨立參數(shù)，以便可修正時間并且可單獨地確定％HbA1c，以給出正確表示4(c)。所得到的時間標度被給定100天的長度，產(chǎn)生大約120天的壽命，如實例3、圖3F中所示。實例7該實例示出了葡萄糖值與葡萄糖依賴性HbA1c百分比速率的對準。方法和結(jié)果在構(gòu)建患者樣品的時間軸并計算葡萄糖依賴性HbA1c百分比速率值之后，獲得檢驗該程序有效性的統(tǒng)計數(shù)據(jù)。在相應(yīng)患者的自我監(jiān)測葡萄糖讀數(shù)的日程表上規(guī)劃患者樣品的流式細胞術(shù)程序的時間點。在圖5中，示出了級分平均值在FL4/SS軸上及“計數(shù)”軸上的行為。在圖5A中，區(qū)域A的表面等于表面區(qū)域B，這是由于“計數(shù)”值是累積的。如果級分的FL4/SS軸的中間被給定值1，則通過給出平均值(m)的位置；其中a和b是如圖所示的相應(yīng)截止值。在圖5B中，F(xiàn)L4/SS值不是累積的。如圖所示，只有當該曲線以指數(shù)方式升高或降低時，“計數(shù)”軸上的平均值(m)才會移位。如果級分的“計數(shù)”軸的中間被給定值1，則通過以下公式給出平均值(m)的位置；1+(反正切(級分的平均FL4/SS值的二階導(dǎo)數(shù)))/3.14。該實例顯示，在每種情況下，級分內(nèi)的平均值的位置與葡萄糖依賴性HbA1c百分比速率一致地向上和向下移動。計算機在數(shù)值上計算平均值，并且按與上文用幾何平均值計算的類似方式將平均值定位在級分中。針對患者樣品的FL4/SS級分的長度對基本模板進行修正，將使平均值在級分內(nèi)的位置保持原樣，并且將生成與葡萄糖依賴性HbA1c速率相關(guān)的值。由于參考樣品與患者樣品之間的差異相對較小，已通過假定參考樣品和患者樣品的特定級分內(nèi)的平均值的相應(yīng)位置之間的線性關(guān)系來簡化該計算。在圖3d中，示出了葡萄糖依賴性HbA1c百分比速率在最初時間標度上的圖形表示。這些值的計算在表2A和2B中示出，并且在表2B列k和l中給出。最初時間標度(表1；列k)由表1；列j計算。表1；列j和k在表2中作為“時間模板”和最初時間標度給出。對于如實例5中所述的每份樣品而言，在對每個級分中的細胞的確切數(shù)量以及由每個級分代表的時間量進行修正之后，構(gòu)建最初時間標度，如實例5中所述。每份樣品的級分的時間總量與參考樣品一樣保持在115天。表1；列i給出了參考樣品的級分的HbA1c百分比值的微分(時間模板)。與參考樣品類似，對每份患者樣品計算這些微分。如表2E中對于一份患者樣品所示，將HbA1c百分比值的微分除以經(jīng)修正的最初時間標度的微分，并且對樣品的總HbA1c百分比值進行修正，得出了最初時間標度上的葡萄糖依賴性HbA1c百分比速率。為了如圖3e中給出的那樣給出時間標度上的葡萄糖依賴性HbA1c百分比速率，使用實例3中所述的公式轉(zhuǎn)換級分的時間值(如需了解該計算，參見表2F)。術(shù)語“實際時間標度”還無法用于患者樣品，因為患者樣品似乎顯示出重要的壽命變化，有必要采取進一步修正措施。然而直接比較所有患者的葡萄糖和葡萄糖依賴性HbA1c速率值會遇到葡萄糖與HbA1c之間低相關(guān)性的問題，如實例4和圖5A中所示。為了更好地比較，將患者的總平均葡萄糖值除以由流式細胞術(shù)測定法所得出的總HbA1c值(表2C列t)。另外，需要針對歸屬于樣品的120天壽命進行修正。基于導(dǎo)出的HbA1c百分比概況與葡萄糖監(jiān)測概況之間的最佳擬合，來確定如表2D列ad中所應(yīng)用的壽命系數(shù)。所得的獨立壽命顯示出患者之間的變化。在應(yīng)用這兩種調(diào)整之后，可在每個時間點附近的平均葡萄糖值與對應(yīng)時間點的導(dǎo)出HbA1c百分比之間進行比較。所得的相關(guān)性具有0.8的R2(圖5B)。圖6中示出了個別比較。結(jié)果的統(tǒng)計分析如可在圖6中看出，葡萄糖依賴性HbA1c百分比速率與患者自我監(jiān)測葡萄糖值之間存在隨時間推移的良好一致性。在長時間搜索之后，通過比較得出的壽命系數(shù)似乎與歸屬于網(wǎng)織紅細胞的參數(shù)相關(guān)，這提示了紅細胞破壞與紅細胞形成之間的反饋機制。壽命系數(shù)為網(wǎng)織紅細胞的血紅蛋白含量與RNA含量的乘積。然而，如實例9中所示，只有在這兩種數(shù)據(jù)對準之后，才可以對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。葡萄糖水平與HbA1c形成的不一致性尚有爭議(Hudsonetal.Ann.Clin.Biochem.1999；vol.36,451-459(Hudson等人，《臨床生化年鑒》，1999年；第36卷，第451-459頁))。圖5中所示的數(shù)據(jù)清楚顯示了葡萄糖水平和HbA1c形成的以時間計的模式之間的預(yù)期相關(guān)性。只有絕對水平的相關(guān)性較差。原因可能是HbA1c反應(yīng)/時間曲線在各個體之間有很大差異。血液中的氧化條件可產(chǎn)生晚期糖基化終產(chǎn)物的不同形成速率，如Makita,Z.etalScience1992,vol.258,pp651-653(Makita,Z.等人，《科學(xué)》，1992年，第258卷，第651-653頁)中所述。在上述計算中，使用應(yīng)用于時間軸的如下固定公式：y＝x1.2在各別情況下，指數(shù)值的變化進一步改善了葡萄糖水平隨時間推移的模式與葡萄糖依賴性HbA1c百分比速率隨時間推移的模式的比較。用較高指數(shù)值擬合的模式將表明，HbA1c百分比值將比平均葡萄糖水平低。平均細胞血紅蛋白時間曲線。該分析的級分中細胞年齡的確定提供了時間軸對所選紅血細胞參數(shù)的應(yīng)用。在上述分析中，確定了細胞年齡級分的平均細胞血紅蛋白。在圖9中，示出了這些平均細胞血紅蛋白曲線。通常，血紅蛋白在5或6天年齡的細胞中達到最大水平。如所報道，更老年齡的細胞喪失了血紅蛋白(Giffordetal.,Br.J.Haematol.2006Nov；135(3):395-404(GiffordSC、DergancJ、ShevkoplyasSS、YoshidaT、BitenskyMW，《英國血液學(xué)雜志》，2006年11月，第135卷，第3期，第395-404頁))。在患者樣品中，發(fā)現(xiàn)了一些異常模式(患者7和患者10)。明顯地，這些異常模式與HbA1c的高水平相關(guān)。血液中所呈現(xiàn)的細胞的百分比。圖8中所示的模式給出了初始形成的細胞中有多少在血液中呈現(xiàn)的印象。該類型的示意圖是時間量的關(guān)系式的結(jié)果，該時間量的關(guān)系式由級分表示并且是所呈現(xiàn)的細胞的百分比的倒數(shù)。對于該類型的曲線而言，沒有限定所呈現(xiàn)的細胞的100％值的參考。因此該曲線的最高點被任意分配100％的值。該曲線的形狀高度依賴于該時間軸上的時間點的值。這些時間軸使用已應(yīng)用于該時間軸的以下HbA1c反應(yīng)/時間公式構(gòu)建：y＝x1.3由于該指數(shù)可能受到如上所述患者之間的變化的影響，因此隨該指數(shù)的此類變化，這些曲線的模式可能略有差異。在所有情況下，這些曲線在該曲線的最后部分描述了細胞死亡，并且在該曲線的最開始部分描述了新形成的紅細胞在血液中緩慢出現(xiàn)。眾所周知，紅細胞在成熟期間，從骨髓進入脾，然后再釋放到血液中。然而還沒有這需要多長時間的相關(guān)信息。根據(jù)我們的分析以及圖8，紅細胞釋放至血液的過程，在各個體之間似乎存在高度變化。實例8該實例示出了患者樣品的壽命系數(shù)的計算。方法和結(jié)果將實例6中所述和表2中計算的葡萄糖依賴性HbA1c百分比速率和時間標度的圖形表示，與實例4由患者自我監(jiān)測所測量的登記葡萄糖值的圖形表示進行比較。使用與葡萄糖值相關(guān)的日程表建立自我監(jiān)測的葡萄糖值的時間標度。通過檢查時間標度上的葡萄糖概況以及所計算的時間標度上的葡萄糖依賴性HbA1c值，可清楚看出這兩種測量之間存在大量一致性。這兩種模式之間的變化顯然是由于患者樣品的壽命的變化。如實例7中所示，對于每名患者而言，將所計算的時間標度的值乘以一個系數(shù)，該系數(shù)是變化的，直到獲得這兩種模式之間的最佳擬合。對于每名患者獲得不同的系數(shù)，并且在這些系數(shù)與目前所知的患者不同參數(shù)之間尋找相關(guān)性。發(fā)現(xiàn)網(wǎng)織紅細胞的FL1值(RNA含量)函數(shù)與側(cè)向散射值(血紅蛋白含量)函數(shù)的乘積有最佳相關(guān)性(圖7；R2＝0.9)(見表2E)?；颊咧屑t血細胞的壽命的計算如實例8中所述的模擬實驗示出了紅血細胞的壽命與歸屬于網(wǎng)織紅細胞的參數(shù)之間的相關(guān)性。最開始，在樣品的較老級分中尋找這些參數(shù)，但無法找到。在網(wǎng)織紅細胞的成熟期間，RNA含量逐漸消失，同時血紅蛋白含量上升達到最高值。在實例8中給出的RNA含量與血紅蛋白含量乘積的函數(shù)中，逐漸降低的RNA和逐漸上升的血紅蛋白將彼此平衡，并且該函數(shù)的值將在網(wǎng)織紅細胞的成熟期間保持恒定。然而，如果RNA和血紅蛋白兩者都較低，這意味著在抽取血樣時網(wǎng)織紅細胞未能達到正常血紅蛋白水平。根據(jù)實例8中的觀察結(jié)果，可以推斷出網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)中紅細胞的破裂與網(wǎng)織紅細胞中血紅蛋白的合成之間存在聯(lián)系。鐵的循環(huán)利用可在這種反饋機制中起到主要作用。實例9該實例示出了血液中所呈現(xiàn)的細胞的時間曲線。方法和結(jié)果在構(gòu)建患者樣品的時間軸、計算葡萄糖依賴性HbA1c百分比速率值以及應(yīng)用患者的紅細胞壽命值之后，獲得統(tǒng)計數(shù)據(jù)以檢驗該程序的有效性。在相應(yīng)患者的自我監(jiān)測葡萄糖讀數(shù)的日程表上規(guī)劃患者樣品的流式細胞術(shù)程序的時間點。對于一個時間點而言，收集到上一時間點的一半時間和到下一時間點的一半時間的葡萄糖讀數(shù)值，并計算平均值。這樣，對于用流式細胞術(shù)測定法得出的每名患者的每個時間點而言，可在葡萄糖依賴性HbA1c百分比速率與血液葡萄糖濃度之間進行比較。但排除超出患者日程表的時間及沒有可用計數(shù)器值的那些時間點。然而直接比較所有患者的葡萄糖和葡萄糖依賴性HbA1c速率值(圖5A)會遇到葡萄糖與HbA1c之間低相關(guān)性的問題，如實例4和圖4中所示。為了更好地比較，將患者的總平均葡萄糖值除以由流式細胞術(shù)測定法所得出的總HbA1c值。將所得的系數(shù)乘以分析的每個時間點的葡萄糖依賴性HbA1c百分比速率，從而允許更好地比較。所得的相關(guān)性具有0.8的R2(圖5B)。圖6中示出了個別比較。根據(jù)公式VIII，通過對年齡級分的大小(表2D列ac)乘以每個級分中的細胞數(shù)(表2D列z)并取倒數(shù)，可以導(dǎo)出與理想模型中的細胞數(shù)相比在血液中可回收多少細胞，在該理想模型中，細胞立即出現(xiàn)于血液中并在完全相同的時間全部死亡。顯示每名患者隨時間推移的細胞百分比的示意圖在圖8中給出。每個系列中的最高值被用作100％參考點。實例10該實例示出了壽命和平均年齡的估計。方法和結(jié)果如圖8中所示循環(huán)中的細胞的呈現(xiàn)允許將曲線外推到零值。該零值在時間軸上的點將反映血液中的最老細胞的年齡以及紅血細胞的壽命。圖8中所示的外推是曲線在級分10的值之后的延長部。該延長部與時間軸所成的角度占第9和第10級分之間的線段與時間軸所成的角度的一半。通過以下方式計算平均年齡：將每個級分中的細胞的數(shù)量乘以級分的年齡。將這些乘積之和除以該分析的紅細胞的總數(shù)。表3匯總了圖8和9中所述的參考樣品和患者樣品的估計壽命和平均年齡。表3實例11該實例示出了平均細胞血紅蛋白含量的時間曲線。方法和結(jié)果使用患者血液的年齡曲線的時間點，并且在葡萄糖依賴性HbA1c速率測定法中確認這些時間點之后，有可能構(gòu)建平均細胞血紅蛋白時間曲線。該研究的患者的時間曲線在圖9中給出。上述內(nèi)容是對本公開的舉例說明，而不應(yīng)理解為是對本公開的限制。本公開由以下權(quán)利要求限定，權(quán)利要求的等同內(nèi)容應(yīng)被包括在其中。本文提到的所有參考文獻和資料均據(jù)此以引用方式并入。當前第1頁1 2 3