本發(fā)明涉及新的用于患者乳腺癌的診斷、預(yù)后、分級(jí)和/或治療監(jiān)測(cè)的方法。所述方法基于使用透明質(zhì)酸和S100P作為乳腺癌患者血漿中的組合生物標(biāo)志物。本發(fā)明的新的生物標(biāo)志物允許對(duì)乳腺癌特別是轉(zhuǎn)移性乳腺癌進(jìn)行診斷，甚至分級(jí)。所述方法提供了當(dāng)前程序(如分析循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)狀態(tài))的令人關(guān)注的替代方案。此外，本發(fā)明的生物標(biāo)志物允許監(jiān)測(cè)乳腺癌治療的成功以及估計(jì)患者的預(yù)后。

描述

乳腺癌是女性中最常見(jiàn)的癌癥，并且是癌癥死亡的第二原因。近年來(lái)，乳腺癌的發(fā)病率在美國(guó)為約90-100/100,000，在歐洲為約50-70/100,000，并且全世界該疾病的發(fā)病率仍在不斷增加。通?？蓪⑷橄侔┓譃槿舾芍饕A段：早期階段、局部晚期階段、局部復(fù)發(fā)階段和轉(zhuǎn)移階段。在歐洲大約450,000位女性被確診患有該疾病，140,000位死亡，其中轉(zhuǎn)移是死亡的主要原因。盡管早期階段乳腺癌的5年生存預(yù)后通常高于60％，但是對(duì)于晚期乳腺癌，該數(shù)值降至40-60％。對(duì)于轉(zhuǎn)移性乳腺癌，5年生存預(yù)后通常為約15％。乳腺癌遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的最常見(jiàn)部位包括肺、肝臟、骨、淋巴結(jié)、皮膚和CNS(腦)。一旦被診斷出轉(zhuǎn)移性乳腺癌，患者可以平均期望再活18-24個(gè)月。治愈轉(zhuǎn)移性乳腺癌不太可能，并且該全身性疾病的治療模式本質(zhì)上主要是緩和。

當(dāng)前的治療乳腺癌(包括轉(zhuǎn)移性乳腺癌)的治療選擇包括：手術(shù)(例如切除術(shù)、自體骨髓移植)、放療、化療(例如，蒽環(huán)類如多柔比星，烴化劑如環(huán)磷酰胺和絲裂霉素C，紫衫烷如紫杉醇和多西紫衫醇，抗代謝物如卡培他濱，微管抑制劑如長(zhǎng)春花生物堿長(zhǎng)春瑞賓)、內(nèi)分泌療法(例如抗雌激素類如他莫昔芬、孕激素類如醋酸甲羥孕酮和醋酸甲地孕酮、芳香酶抑制劑如氨魯米特和來(lái)曲唑)以及生物制品(例如細(xì)胞因子、免疫治療劑如單克隆抗體)。通過(guò)化療(最有效的藥物包括環(huán)磷酰胺、多柔比星、長(zhǎng)春瑞賓、卡培他濱和絲裂霉素C)和內(nèi)分泌療法中的一種或其組合來(lái)治療最常見(jiàn)的轉(zhuǎn)移性乳腺癌。

乳腺癌的診斷選擇包括從患者受影響的乳腺區(qū)域獲得的患者樣本的顯微分析，或活檢。兩種最常用的診斷方法是通過(guò)醫(yī)師進(jìn)行的乳腺體檢和乳房攝影術(shù)。當(dāng)這些檢查不確定時(shí)，通常將腫塊中的液體患者樣本進(jìn)行顯微分析，以幫助確立診斷?；顧z的其它選擇包括計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)、磁共振成像(MRI)、超聲檢查和中心活檢或者真空輔助乳腺活檢，這些是移出一部分乳腺腫塊的程序；或者切除活檢，其中移出整個(gè)腫塊。

在過(guò)去的幾十年中，許多因子被證明并確認(rèn)對(duì)于轉(zhuǎn)移性乳腺癌(MBC)患者的預(yù)后具有預(yù)測(cè)價(jià)值。已有記載充分證明了激素受體(雌激素/孕酮受體，ER/PR)陽(yáng)性和人表皮生長(zhǎng)因子受體2(HER2)陰性的表型，與患有ER和/或PR陰性疾病的女性相比，與有利的結(jié)果相關(guān)。然而，這些標(biāo)志物是基于組織的，其僅可以通過(guò)活檢或手術(shù)觀察到，而不能被用作疾病發(fā)展的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。

在臨床應(yīng)用中，對(duì)于MBC的監(jiān)測(cè)，更重視微創(chuàng)標(biāo)志物(如基于血液的標(biāo)志物)。CA 15-3主要用于監(jiān)測(cè)罹患MBC的患者。在患有晚期疾病的約70％的患者中發(fā)現(xiàn)了該標(biāo)志物的升高的血液水平。然而，CA 15-3水平在患有乳腺癌和未患乳腺癌的女性中的變化性限制了其作為BC的生物標(biāo)志物的應(yīng)用。癌胚抗原(CEA)是MBC的相關(guān)腫瘤標(biāo)志物，但是具有低靈敏度(在疾病發(fā)展的不同階段為53.5％至68.6％)。因此，僅建議將CEA和CA 15-3與其它預(yù)后因子共同考慮。

最近，循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)的計(jì)數(shù)被認(rèn)為是患有MBC的患者的預(yù)后標(biāo)志物。將高于5個(gè)CTC/7.5ml血液的基本截止點(diǎn)界定為CTC陽(yáng)性。與陰性CTC狀態(tài)的患者相比，那些陽(yáng)性患者在多中心前瞻性臨床試驗(yàn)中顯示出較短的無(wú)進(jìn)展生存期(11.7相對(duì)于30.3周)。在MBC患者的前瞻性研究中，CTC狀態(tài)被證明是無(wú)進(jìn)展生存期的獨(dú)立預(yù)后因素，風(fēng)險(xiǎn)比1.76。此外，同樣重要的是注意，約50％的具有明顯遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的患者是CTC陰性。這可能部分歸因于CTC中的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，在此種情況下，它們可能被利用上皮標(biāo)志物如EpCAM或細(xì)胞角蛋白的表達(dá)的計(jì)數(shù)技術(shù)漏掉。

鑒于上述

背景技術(shù)：
，本發(fā)明的目標(biāo)是提供用于診斷或監(jiān)測(cè)乳腺癌，特別是轉(zhuǎn)移性乳腺癌的簡(jiǎn)單且微創(chuàng)但卻特異且靈敏的測(cè)試系統(tǒng)。此外，本發(fā)明旨在提供允許直接監(jiān)測(cè)臨床中正在進(jìn)行的乳腺癌療法的成功治療的診斷策略，以及評(píng)價(jià)接受治療的乳腺癌患者的預(yù)后。

在第一方面，通過(guò)用于對(duì)象/患者中的癌癥的診斷、預(yù)后、分級(jí)和/或治療監(jiān)測(cè)的方法解決了上述問(wèn)題，所述方法包括下述步驟：

a.提供所述對(duì)象/患者的生物樣本，

b.測(cè)定所述生物樣本中選自細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)組分和S100家族蛋白的至少一種生物標(biāo)志物的水平，以及

c.將b中所測(cè)定的所述至少一種生物標(biāo)志物的水平與對(duì)照進(jìn)行比較，

其中與所述對(duì)照相比，所述生物樣本中所述至少一種生物標(biāo)志物水平的增加指示所述對(duì)象/患者中癌癥的存在。

在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，癌癥優(yōu)選地為上皮起源的癌癥。上皮癌是例如下述的上皮癌：卵巢、結(jié)腸、肺、直腸、乳腺、前列腺、胰腺、食道、膀胱、肝臟、子宮或者腦。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，上皮癌是前面提及的癌癥類型的轉(zhuǎn)移性癌癥。在本發(fā)明的上下文中，最優(yōu)選乳腺癌或者轉(zhuǎn)移性乳腺癌。

在本發(fā)明的上下文中的“診斷”或術(shù)語(yǔ)“診斷的”意為鑒定病理狀況的存在或性質(zhì)。診斷方法在其靈敏度和特異性方面存在不同。診斷分析的“靈敏度”是測(cè)試為陽(yáng)性的患病個(gè)體的百分?jǐn)?shù)(“真陽(yáng)性”的百分比)。通過(guò)分析未被檢測(cè)出的患病個(gè)體為“假陰性”。未患病且在分析中測(cè)試為陰性的對(duì)象被稱為“真陰性”。診斷分析的“特異性”是1減去假陽(yáng)性率，其中“假陽(yáng)性”率被定義為未患疾病但測(cè)試為陽(yáng)性的那些對(duì)象的比例。盡管特定的診斷方法可能不能提供病況的明確診斷，但是如果所述方法提供幫助診斷的陽(yáng)性指示，這就足夠了。

術(shù)語(yǔ)“預(yù)后”指由病例的性質(zhì)和癥狀所指示的關(guān)于疾病的可能結(jié)果以及從疾病中康復(fù)的前景的預(yù)測(cè)。相應(yīng)地，由較低的治療后生存期或生存率來(lái)界定陰性或不良預(yù)后。相反地，由升高的治療后生存期或生存率來(lái)界定陽(yáng)性或良好預(yù)后。通常，隨著無(wú)進(jìn)展生存期或總生存期的時(shí)間提供預(yù)后。

出于本發(fā)明的目的，術(shù)語(yǔ)“分級(jí)(stratification)”指根據(jù)本發(fā)明的方法提出下述可能的決定的優(yōu)勢(shì)：患者的治療和療法，患者是否住院治療，一種或多種藥物的使用、效果和/或劑量，治療措施或者監(jiān)測(cè)疾病的過(guò)程和治療的過(guò)程，或者疾病的病理學(xué)或分類(例如分為新的亞型或者既有的亞型)，或者疾病及其患者的區(qū)別等。具體而言，關(guān)于乳腺癌，在此背景下，“分級(jí)”意為鑒于轉(zhuǎn)移狀態(tài)或者是否存在循環(huán)腫瘤細(xì)胞，個(gè)體患者的乳腺癌疾病的分類。此外，術(shù)語(yǔ)“分級(jí)”特別涵蓋了關(guān)于陰性健康事件結(jié)果的預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)分級(jí)。

出于本發(fā)明的目的，術(shù)語(yǔ)“監(jiān)測(cè)治療”意為觀察接受乳腺癌治療的患者的疾病發(fā)展。換言之，在治療期間，定期監(jiān)測(cè)對(duì)患者應(yīng)用的治療的效果，這允許醫(yī)師在治療的早期階段估計(jì)規(guī)定的治療是否有效，從而相應(yīng)地調(diào)整治療方案。

本文使用的術(shù)語(yǔ)“對(duì)象”或“患者”指將成為具體治療的接受者的任何動(dòng)物(例如哺乳動(dòng)物)，包括但不限于人、非人靈長(zhǎng)類、嚙齒動(dòng)物等。通常，提及人類對(duì)象，術(shù)語(yǔ)“對(duì)象”和“患者”在本文可互換使用。本文使用的術(shù)語(yǔ)“疑患癌癥的對(duì)象”指顯示出指示癌癥的一個(gè)或多個(gè)癥狀(例如明顯的腫塊或團(tuán)塊)的對(duì)象。疑患癌癥的對(duì)象還可具有一種或多種風(fēng)險(xiǎn)因子。疑患癌癥的對(duì)象通常還未進(jìn)行癌癥測(cè)試。然而，“疑患癌癥的對(duì)象”包括已接受初步診斷(例如顯示團(tuán)塊的CT掃描)但是癌癥的亞型或階段未知的個(gè)體。該術(shù)語(yǔ)還包括曾經(jīng)患有癌癥的人(例如處于緩解的個(gè)體)以及患有癌癥并且懷疑原發(fā)性腫瘤轉(zhuǎn)移擴(kuò)散的人。

術(shù)語(yǔ)“癌癥”和“癌細(xì)胞”指在多細(xì)胞生物體的組織或器官中表現(xiàn)出不受控制的生長(zhǎng)的任何細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“乳腺癌”被理解意為與乳腺組織或乳腺組織細(xì)胞相關(guān)的任何癌癥或癌性損傷，并且可以包括乳腺癌的前兆，例如非典型導(dǎo)管增生或典型增生。乳腺癌是乳腺中存在原發(fā)性腫瘤或多個(gè)單獨(dú)的原發(fā)性腫瘤的疾病。通常，這意味著還未有癌細(xì)胞從乳腺中的原發(fā)性腫瘤分離，并且還未擴(kuò)散至“不同位置”。術(shù)語(yǔ)“腫瘤”指非炎癥性的且不具有生理功能的組織的異常良性團(tuán)塊或惡性團(tuán)塊。

本文使用的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)移性乳腺癌”應(yīng)被理解為至少一個(gè)發(fā)生轉(zhuǎn)變的疾病，即來(lái)自乳腺的原發(fā)性腫瘤的癌細(xì)胞與原發(fā)性腫瘤分離并在與原發(fā)性腫瘤的位置不同的位置處(下文稱為“不同位置”)繼續(xù)生長(zhǎng)為腫瘤。不同位置可以，例如位于原發(fā)性腫瘤所位于的同一乳腺內(nèi)(同側(cè)乳腺)或者位于另一乳腺(對(duì)側(cè)乳腺)內(nèi)。其它實(shí)例包括在一個(gè)或多個(gè)淋巴結(jié)中的轉(zhuǎn)移，不管這些是可移動(dòng)的還是固定的，是所述原發(fā)性腫瘤的同側(cè)還是對(duì)側(cè)，是位于鎖骨上還是腋窩還是其它位置。在TNM腫瘤分類的背景下，本文使用的“轉(zhuǎn)移性乳腺癌”將包括，即分期包括M＝1(即階段IV乳腺癌)的所有腫瘤，即遠(yuǎn)處位置存在任何程度的轉(zhuǎn)移的所有腫瘤，所述遠(yuǎn)處位置如例如肺、肝臟、骨、淋巴結(jié)、皮膚、腦和/或同側(cè)和/或?qū)?cè)乳腺的不同位置內(nèi)。

應(yīng)當(dāng)注意，本文使用的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)移性乳腺癌”不意指存在于“不同位置”的所述轉(zhuǎn)移必須起于乳腺的任何一個(gè)具體的原發(fā)性腫瘤。也就是說(shuō)，位于“不同位置”的轉(zhuǎn)移的起源對(duì)于將疾病稱為“轉(zhuǎn)移性乳腺癌”不重要，只要產(chǎn)生轉(zhuǎn)移的原發(fā)性腫瘤起源于乳腺組織。出于該目的，術(shù)語(yǔ)“乳腺組織”應(yīng)被理解為包括乳腺小葉和導(dǎo)管，即最常見(jiàn)的產(chǎn)生乳腺腫瘤的組織。

本文使用的術(shù)語(yǔ)“生物樣本”指獲得的并可以對(duì)如本發(fā)明所公開(kāi)的任何一種生物標(biāo)志物或其基因表達(dá)進(jìn)行分析的樣本。生物樣本可以包括生物流體(例如血液、腦脊髓液、尿、血漿、血清)，組織活檢等。在一些實(shí)施方案中，樣本為組織樣本，例如腫瘤組織，并且可以是新鮮的、冷凍的或者存檔的石蠟包埋的組織。出于本發(fā)明的目的，優(yōu)選的樣本為體液，特別是血漿樣本。

在本發(fā)明的上下文中，“生物標(biāo)志物”或“標(biāo)志物”指有機(jī)生物分子，特別是多肽或多糖，與采集自未患某病況的對(duì)象(例如陰性診斷、正?；蚪】档膶?duì)象，或者非轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者，這取決于所述患者是否進(jìn)行了乳腺癌或轉(zhuǎn)移性乳腺癌測(cè)試)的可比較的樣本相比，所述分子差異存在于采集自患有所述病況的患者的樣本中。例如，標(biāo)志物可以是與具有陰性診斷的患者或者非轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的樣本相比，以升高或降低的水平存在于轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的樣本中的多肽或多糖(具有特定的表觀分子量)。

如本文所述的，術(shù)語(yǔ)“確定樣本、對(duì)照或參照中的生物標(biāo)志物的水平”應(yīng)指對(duì)測(cè)試樣本中所述生物標(biāo)志物的存在進(jìn)行定量。例如，可以通過(guò)測(cè)量存在于測(cè)試樣本中的蛋白/多肽/多糖的量直接定量所述樣本中生物標(biāo)志物的濃度。然而，通過(guò)評(píng)估生物標(biāo)志物的編碼基因的基因表達(dá)(例如通過(guò)定量編碼各生物標(biāo)志物的表達(dá)的mRNA)而間接定量生物標(biāo)志物的量也是可能的。本發(fā)明不應(yīng)被限定于測(cè)定給定的生物標(biāo)志物的水平的任何特定方法，而應(yīng)包括允許直接或者間接定量或估計(jì)所述生物標(biāo)志物的水平的所有方式。因此，在本發(fā)明的上下文中，“水平”是描述給定樣本中生物標(biāo)志物的絕對(duì)量的參數(shù)，例如作為絕對(duì)重量、體積或摩爾量；或者可選地，“水平”涉及相對(duì)量，例如以及優(yōu)選地，測(cè)試樣本中所述生物標(biāo)志物的濃度，例如mol/l、g/l、g/mol等。在優(yōu)選實(shí)施方案中，“水平”指以g/l計(jì)的測(cè)試生物標(biāo)志物的濃度。

在優(yōu)選實(shí)施方案中，與對(duì)照相比，樣本中生物標(biāo)志物水平的“增加”指在本發(fā)明的優(yōu)選方面中統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的增加。

在本發(fā)明的可選實(shí)施方案中，在乳腺癌或轉(zhuǎn)移性乳腺癌或CTC陽(yáng)性乳腺癌的事件中，如本文所公開(kāi)的某些生物標(biāo)志物也可以顯著降低。

在本發(fā)明的過(guò)程中，研究了一組乳腺癌患者相關(guān)的數(shù)據(jù)，包括一整套臨床特征和隨訪數(shù)據(jù)，旨在找到用于乳腺癌的檢測(cè)和預(yù)測(cè)的潛在標(biāo)志物。出人意料地，透明質(zhì)酸(HA)和S100P蛋白被鑒定為在觀察的患者的血漿中顯著差異表達(dá)的目標(biāo)診斷標(biāo)志物。因此，根據(jù)本發(fā)明，血漿HA/S100P水平被用作獨(dú)立于CTC狀態(tài)的預(yù)后標(biāo)志物，并且甚至優(yōu)于現(xiàn)行的FDA批準(zhǔn)的基于CTC的測(cè)試。由于本發(fā)明的生物標(biāo)志物是通過(guò)免疫方法在分子水平上檢測(cè)的，本發(fā)明由于基于免疫的分析的簡(jiǎn)易性而特別有利，其是微創(chuàng)的，并且即使僅可提供微量的樣本材料仍十分靈敏。如本文所述的方法也具有成本效益。

因此，在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及如上文所述的診斷方法，其中所述至少一種生物標(biāo)志物選自透明質(zhì)酸(HA)和/或S100P。最優(yōu)選的是診斷方法包括測(cè)定至少兩種生物標(biāo)志物，優(yōu)選地，其中所述至少兩種生物標(biāo)志物是HA和S100P。HA和S100P是本文上下文所述的所有實(shí)施方案和方面的優(yōu)選生物標(biāo)志物。

S100P是95個(gè)氨基酸的蛋白，其為S100家族成員。該Ca2+結(jié)合蛋白參與許多細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外活動(dòng)并影響細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)，所述活動(dòng)包括蛋白磷酸化和酶激活、基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞增殖和分化。S100P可以通過(guò)結(jié)合Ca2+以及激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路，起始腫瘤細(xì)胞增殖并對(duì)抗化療劑像5-氟尿嘧啶而生存。

透明質(zhì)酸(HA)是陰離子型、非硫酸化的糖胺聚糖，廣泛分布于結(jié)締組織、上皮組織和神經(jīng)組織中。它在糖胺聚糖中是獨(dú)一無(wú)二的，因?yàn)槠涫欠橇蛩峄?，在質(zhì)膜而非高爾基體中形成，并且可以非常大，其中它的分子量通常達(dá)到數(shù)百萬(wàn)。它是結(jié)締組織的細(xì)胞外基質(zhì)中主要的大分子多糖，已被實(shí)驗(yàn)證明與細(xì)胞增殖和遷移相關(guān)。

因此，在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，優(yōu)選的是，至少一種生物標(biāo)志物為HA或S100P相關(guān)的生物標(biāo)志物。此類HA相關(guān)的生物標(biāo)志物可以優(yōu)選選自蛋白聚糖，如硫酸乙酰肝素、硫酸軟骨素、硫酸角質(zhì)素、巢蛋白、多功能蛋白聚糖和核心蛋白聚糖，或者膠原、彈性蛋白、纖連蛋白和層粘連蛋白、肌原纖維蛋白以及生腱蛋白。S100家族蛋白可以選自：S100A1、S100A2、S100A3、S100A4、S100A5、S100A6、S100A7、S100A8、S100A9、S100A10、S100A11、S100A12、S100A13、S100A14、S100A15、S100A16、S100B、S100P、S100Z、S100G、Cornulin、絲聚蛋白、絲聚蛋白-2、角蛋白、Repetin、毛透明蛋白以及毛透明蛋白樣1。然而，在本發(fā)明的上下文中最優(yōu)選的是，(至少一種或兩種)生物標(biāo)志物選自HA和/或S100P。

根據(jù)用于診斷、預(yù)后、分級(jí)和/或監(jiān)測(cè)的方法的本發(fā)明的主題，乳腺癌為轉(zhuǎn)移性乳腺癌或復(fù)發(fā)性乳腺癌，或者循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)陽(yáng)性的乳腺癌。

用于本文描述的發(fā)明方法中的對(duì)照對(duì)應(yīng)于所述至少一種生物標(biāo)志物在下述對(duì)照樣本中的水平：來(lái)自健康個(gè)體的對(duì)照樣本，或者來(lái)自非轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的對(duì)照樣本，或者來(lái)自循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)陰性的乳腺癌患者的對(duì)照樣本。因此，對(duì)照應(yīng)當(dāng)總與相當(dāng)于用于本發(fā)明的方法的生物樣本的對(duì)照樣本中待測(cè)定的生物標(biāo)志物的水平相對(duì)應(yīng)。

本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案涉及上文描述的方法，其用于患者中CTC陽(yáng)性乳腺癌的診斷、預(yù)后、分級(jí)和/或治療監(jiān)測(cè)。

在患有晚期乳腺癌的患者的循環(huán)中發(fā)現(xiàn)了極低濃度的從實(shí)體瘤中剝離的上皮細(xì)胞，并且血液中這些細(xì)胞的存在或相對(duì)數(shù)量與整體預(yù)后和對(duì)治療的應(yīng)答相關(guān)。這些剝離的上皮細(xì)胞(也被稱為循環(huán)腫瘤細(xì)胞)可能是臨床癥狀出現(xiàn)之前腫瘤擴(kuò)張或轉(zhuǎn)移的早期指示物。

循環(huán)腫瘤細(xì)胞通常具有大約一天的短半衰期，并且它們的存在通常指示來(lái)自增殖的腫瘤的近期流入。因此，循環(huán)腫瘤細(xì)胞代表了可能反映患者疾病的當(dāng)前臨床狀態(tài)和治療應(yīng)答的動(dòng)態(tài)過(guò)程。在一些情況下，循環(huán)腫瘤細(xì)胞可以裂解和/或經(jīng)受凋亡，留下循環(huán)腫瘤細(xì)胞的碎片。

本發(fā)明的方法包括，所述對(duì)照對(duì)應(yīng)于CTC陰性乳腺癌患者的樣本中所述至少一種生物標(biāo)志物的水平，并且其中與所述對(duì)照相比，所述生物樣本中所述至少一種生物標(biāo)志物水平的增加指示所述患者中的CTC陽(yáng)性乳腺癌。因此，在此背景下，測(cè)試對(duì)象/患者已被診斷為患有原發(fā)性乳腺癌或轉(zhuǎn)移性乳腺癌，但是其疑似患有CTC陽(yáng)性乳腺癌。由于CTC陽(yáng)性乳腺癌表型是乳腺癌患者的無(wú)進(jìn)展生存期和總生存時(shí)間的重要預(yù)后因素，在臨床上通過(guò)本發(fā)明的方法診斷CTC表型對(duì)于醫(yī)師而言是有利的，因?yàn)樗苊饬速M(fèi)力的CTC計(jì)數(shù)。

此外，通過(guò)用于評(píng)估接受乳腺癌治療的乳腺癌患者的治療成功的方法來(lái)解決本發(fā)明的目標(biāo)，所述方法包括下述步驟：

a.提供接受乳腺癌治療的所述乳腺癌患者的生物樣本，

b.測(cè)定所述生物樣本中選自細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)組分和S100家族蛋白的至少一種生物標(biāo)志物的水平，以及

c.將如b中所測(cè)定的所述至少一種生物標(biāo)志物的水平與參照進(jìn)行比較，

其中與所述參照相比，所述生物樣本中所述至少一種生物標(biāo)志物水平降低至少20％，優(yōu)選25％，優(yōu)選30％，更優(yōu)選35％至45％指示患者對(duì)所述治療的應(yīng)答。

本發(fā)明該方面的優(yōu)選生物標(biāo)志物對(duì)應(yīng)于上文描述的本發(fā)明的實(shí)施方案中的優(yōu)選生物標(biāo)志物。

在本發(fā)明此處所述方面的背景下，“參照”對(duì)應(yīng)于提供的獲自接受所述治療之前的所述患者的生物樣本中所述至少一種生物標(biāo)志物的水平。因此參照對(duì)應(yīng)于未處理的對(duì)照。

可選地，所述方法可以包括通過(guò)其它方法步驟提供所述參照，所述其它方法步驟包括：(i.)提供在所述患者接受所述治療之前獲得的所述患者的第二生物樣本，(ii.)測(cè)定所述第二生物樣本中選自細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)組分和S100家族蛋白的至少一種生物標(biāo)志物的水平，其中所述第二生物樣本中所述至少一種生物標(biāo)志物的所述水平構(gòu)成所述參照。因此，在患者還未接受待通過(guò)所述方法評(píng)估的所述治療時(shí)獲得第二生物樣本，而在待評(píng)估的所述治療開(kāi)始之后的某時(shí)獲得生物樣本，具體地在待評(píng)估的所述治療期間，在所述治療完成時(shí)或者在所述治療完成之后的某時(shí)獲得生物樣本。

然而，本發(fā)明的另一方面涉及用于乳腺癌患者的預(yù)后的方法，包括：

a.提供所述乳腺癌患者的生物樣本，

b.測(cè)定所述生物樣本中選自細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)組分和S100家族蛋白的至少一種生物標(biāo)志物的水平，

其中所述生物樣本中所述至少一種生物標(biāo)志物的水平升高指示無(wú)進(jìn)展生存期(PFS)和/或總生存期(OS)的時(shí)間減少。

當(dāng)然如果在上述方法的背景下使用其它生物標(biāo)志物，所述樣本中所述水平的降低也可指示無(wú)進(jìn)展生存期(PFS)和/或總生存期(OS)的時(shí)間減少。如果生物標(biāo)志物的降低的水平與不良預(yù)后相關(guān)，則所述樣本中所述生物標(biāo)志物的減少也可指示無(wú)進(jìn)展生存期(PFS)和/或總生存期(OS)的時(shí)間減少。

在本發(fā)明的上下文中–如上文已述的–所述至少一種生物標(biāo)志物優(yōu)選為HA和/或S100P。在該背景下，HA的升高的水平是所述生物樣本中至少約250ng/ml的HA濃度，和/或其中所述生物樣本中S100P的升高的水平是至少約7ng/ml的濃度。然而，絕對(duì)濃度水平強(qiáng)烈地依賴于使用的樣本處理和定量方法。以上水平適用于實(shí)施例的上下文中使用的方法相對(duì)應(yīng)的樣本處理。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，無(wú)需面臨過(guò)度實(shí)驗(yàn)，必須根據(jù)樣本處理方案的改變確定新的參照值。

本文中所有數(shù)值均被認(rèn)為用術(shù)語(yǔ)“約”進(jìn)行修飾，不管是否明確指明。術(shù)語(yǔ)“約”通常指本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)為等同于(即具有相同功能或結(jié)果)所記載數(shù)值的數(shù)字范圍。在許多情況下，術(shù)語(yǔ)“約”可以包括四舍五入為最接近的有效數(shù)的數(shù)字。在本發(fā)明的特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“約”可以指數(shù)值的最高20％的各數(shù)值的偏差，然而更優(yōu)選15％、10％、5％，以及最優(yōu)選4％、3％、2％，以及最優(yōu)選1％。

在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述樣本選自體液或組織，優(yōu)選地，其中所述體液樣本為血液樣本，更優(yōu)選血漿或血清樣本。

在本文所述的發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述患者為哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人，更優(yōu)選被診斷為患乳腺癌的人患者或者被診斷為患轉(zhuǎn)移性乳腺癌的人患者。由于本發(fā)明不僅允許診斷乳腺癌，還允許診斷轉(zhuǎn)移性乳腺癌，甚至CTC陽(yáng)性乳腺癌，因此本發(fā)明的患者/對(duì)象可以根據(jù)疾病的以上階段的哪一階段被診斷、預(yù)后、分級(jí)或測(cè)試而不同。技術(shù)人員意識(shí)到，已被診斷為患有轉(zhuǎn)移性乳腺癌的患者將不進(jìn)行此類乳腺癌的一般存在的測(cè)試。然而，當(dāng)然，這不應(yīng)被理解為限制本發(fā)明的范圍，因?yàn)橐汛_定的診斷也可用本文所述的本發(fā)明的方法中的任何一種進(jìn)行驗(yàn)證。

在本發(fā)明的所有方面和實(shí)施方案中，可以優(yōu)選通過(guò)核酸檢測(cè)方法或免疫學(xué)檢測(cè)方法測(cè)定所述樣本中所述至少一種生物標(biāo)志物的水平。然而，核酸檢測(cè)方法僅在表達(dá)的蛋白是生物標(biāo)志物的情況下適用。通常允許定量此類蛋白的表達(dá)的所有方法均應(yīng)包括于本發(fā)明中。因此，啟動(dòng)子分析和評(píng)價(jià)編碼本發(fā)明的蛋白生物標(biāo)志物的基因座位表觀遺傳狀態(tài)的程序也包括于本文所述的發(fā)明中。此外，例如作為多糖分子的HA不是基因表達(dá)的，因此優(yōu)選地使用允許基于分子的結(jié)構(gòu)(抗體)或通過(guò)其質(zhì)量來(lái)定量分子的方法進(jìn)行檢測(cè)?？蛇x地，可以評(píng)價(jià)調(diào)節(jié)HA代謝的酶的存在或表達(dá)，其指示HA的存在或水平。

在本文描述的發(fā)明的背景下優(yōu)選的檢測(cè)方法為，通過(guò)選自下述方法的檢測(cè)方法測(cè)定所述樣本中所述至少一種生物標(biāo)志物的水平：質(zhì)譜法、質(zhì)譜免疫分析法(MSIA)、基于抗體的蛋白質(zhì)芯片、2維凝膠電泳、穩(wěn)定同位素標(biāo)準(zhǔn)和抗肽抗體捕獲(SISCAPA)、高效液相色譜(HPLC)、蛋白質(zhì)印跡、流式微珠陣列(CBA)、蛋白免疫沉淀、放射免疫分析、配體結(jié)合分析以及酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，優(yōu)選地，其中所述蛋白檢測(cè)方法為ELISA。用于定量本發(fā)明的生物標(biāo)志物的合適的可選檢測(cè)方法對(duì)于技術(shù)人員是已知的。

本文描述的發(fā)明的方法優(yōu)選為體外方法，優(yōu)選不包括在人體或動(dòng)物體實(shí)施任何方法步驟的體外方法。

在另一方面，本發(fā)明提供了幫助診斷乳腺癌或轉(zhuǎn)移性乳腺癌或CTC陽(yáng)性乳腺癌的試劑盒，其中可將所述試劑盒用于檢測(cè)本發(fā)明的生物標(biāo)志物。例如，可將所述試劑盒用于檢測(cè)以上所述的生物標(biāo)志物的任何一種或其組合，所述生物標(biāo)志物在患有乳腺癌或轉(zhuǎn)移性乳腺癌或CTC陰性乳腺癌的患者以及正?；颊叩臉颖局胁町惔嬖?。本發(fā)明的試劑盒具有多種應(yīng)用。例如，可將所述試劑盒用于區(qū)分對(duì)象是否患有乳腺癌或轉(zhuǎn)移性乳腺癌或CTC陽(yáng)性乳腺癌，或者是否具有陰性診斷，從而有助于乳腺癌的診斷。在另一實(shí)例中，可將所述試劑盒用于鑒定調(diào)節(jié)體外乳腺癌細(xì)胞或乳腺癌體內(nèi)動(dòng)物模型中生物標(biāo)志物的表達(dá)的化合物。

任選地，試劑盒還可以包含標(biāo)簽或單獨(dú)插頁(yè)形式的合適的操作參數(shù)的說(shuō)明書。例如，所述試劑盒可以包含告知用戶在探針接觸血漿樣本之后如何洗滌探針的標(biāo)準(zhǔn)說(shuō)明書。

在另一實(shí)施方案中，試劑盒包含(a)與標(biāo)志物特異性結(jié)合的抗體；和(b)檢測(cè)試劑?？捎梢陨纤龅牟牧现苽浯祟愒噭┖?，以及之前關(guān)于所述材料(例如抗體,檢測(cè)試劑,固定化支持物等)的討論完全適用于該部分，并且無(wú)需重復(fù)。

在可選實(shí)施方案中，試劑盒還可以任選地包含標(biāo)準(zhǔn)或?qū)φ招畔?，以便可將測(cè)試樣本與對(duì)照信息標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較，從而確定樣本中檢測(cè)到的標(biāo)志物的測(cè)試量是否與癌癥(優(yōu)選乳腺癌)診斷的診斷量一致。

優(yōu)選地，本發(fā)明的試劑盒為用于實(shí)施根據(jù)本發(fā)明的方法的診斷試劑盒，其包含用于定量所述至少一種生物標(biāo)志物的水平的工具。優(yōu)選地，本發(fā)明的試劑盒包含用于定量HA和S100P的工具。用于定量的此類工具為，例如至少一種抗體，優(yōu)選地，其中所述抗體為單克隆抗體，如特異性結(jié)合HA或S100P的單克隆抗體。此類抗體在本領(lǐng)域是已知的，并且可商購(gòu)獲得。

在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的診斷試劑盒包含特異性結(jié)合HA的第一抗體和特異性結(jié)合S100P的第二抗體，優(yōu)選地，其中所述第一抗體和第二抗體是單克隆抗體。

特別優(yōu)選的是，本發(fā)明的診斷試劑盒包含實(shí)施ELISA的工具。

在另一方面，通過(guò)將選自細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)組分和S100家族的生物標(biāo)志物用于乳腺癌治療劑的篩選方法來(lái)解決本發(fā)明的目標(biāo)?？蛇x地，該方面可能反而涉及在此類篩選方法中的用途。用于篩選的優(yōu)選生物標(biāo)志物是HA或S100P。

一方面，本發(fā)明的篩選可以在細(xì)胞培養(yǎng)物或動(dòng)物模型中進(jìn)行，所述動(dòng)物模型如小鼠或大鼠乳腺癌模型。在所述篩選方法中，優(yōu)選地包括使用罹患乳腺癌的動(dòng)物。可以在針對(duì)將所述模型與候選乳腺癌治療劑或治療方案接觸的應(yīng)答中，基于本發(fā)明的生物標(biāo)志物監(jiān)測(cè)所述模型中乳腺癌的發(fā)展。因此，優(yōu)選這樣的用途，其中在所述篩選方法中，測(cè)試化合物引起所述至少一種生物標(biāo)志物的量的降低，所述測(cè)試化合物為待被用作乳腺癌治療劑的候選物。

可進(jìn)一步將以上方法用于測(cè)試在其它癌癥類型中有效的治療劑。因此該備選實(shí)施方案包括不是乳腺癌而是其它癌癥的癌癥，優(yōu)選其它上皮癌。優(yōu)選上文提及的上皮癌。

現(xiàn)在將參考附圖和序列，在以下實(shí)施例中進(jìn)一步描述本發(fā)明，但不限于此。出于本發(fā)明的目的，將本文引用的所有參考文獻(xiàn)通過(guò)引用整體并入。在圖和序列中：

圖1:(A)健康對(duì)照、原發(fā)性乳腺癌患者和轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者中的血漿透明質(zhì)酸和S100P水平；(B)通過(guò)轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的CTC狀態(tài)對(duì)其進(jìn)一步分級(jí)。

圖2:血漿HA/S100P的ROC分析和乳腺癌患者亞組。(A)CTC+轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者相對(duì)于健康對(duì)照(A)和原發(fā)性乳腺癌患者(B)；轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者相對(duì)于健康對(duì)照(C)和原發(fā)性乳腺癌患者(D)。

圖3:(A)通過(guò)血漿HA/S100P水平分級(jí)的無(wú)進(jìn)展生存期的卡普蘭-邁耶曲線；(B)通過(guò)CTC狀態(tài)分級(jí)的無(wú)進(jìn)展生存期的卡普蘭-邁耶曲線。

圖4:(A)通過(guò)血漿HA/S100P水平分級(jí)的總生存期的卡普蘭-邁耶曲線；(B)通過(guò)CTC狀態(tài)分級(jí)的總生存期的卡普蘭-邁耶曲線。

圖5:1個(gè)完整的化療周期之前或之后轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者中血漿HA和S100P水平。

圖6:血漿HA和S100P水平變化以及它們的組合在指示轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的治療結(jié)果中的ROC分析。同時(shí)繪出了CTC數(shù)目的變化以比較判別力。

圖7:轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者中治療后血漿HA/S100P水平的預(yù)后價(jià)值。(A)和(B)：通過(guò)血漿HA/S100P水平和CTC狀態(tài)分級(jí)的無(wú)進(jìn)展生存期的卡普蘭-邁耶曲線；(C)和(D)：通過(guò)血漿HA/S100P水平和CTC狀態(tài)分級(jí)的總生存期的卡普蘭-邁耶曲線。

圖8:來(lái)自驗(yàn)證組的患者的血漿HA水平及其對(duì)于MBC患者的預(yù)后價(jià)值。(A)驗(yàn)證組的MBC患者和PBC患者中的血漿HA水平；(B)血漿HA水平在區(qū)分MBC患者與PBC患者中的判別力；(C、D)如通過(guò)卡普蘭-邁耶曲線所估計(jì)的，驗(yàn)證組中血漿HA水平分別對(duì)于MBC患者的PFS和OS的預(yù)后價(jià)值。低HA：血漿中≤250ng/mL HA；高HA：血漿中>250ng/mL HA。CTC陰性：在7.5mL外周血中<5個(gè)CTC；CTC陽(yáng)性：在7.5mL外周血中≥5個(gè)CTC。

實(shí)施例

材料和方法

包括60名健康對(duì)照，48名原發(fā)性乳腺癌(PBC)患者以及212名MBC患者，并通過(guò)在10℃下以1300g離心20min來(lái)收集血漿，隨后在10℃下，將上清液以15,500g另外離心10min。將樣本快速冷凍，并保存于-80℃，以用于HA/S100P測(cè)量。通過(guò)FDA批準(zhǔn)的預(yù)后測(cè)試系統(tǒng)(Veridex,LLC,Raritan NJ)數(shù)MBC患者中的CTC數(shù)目。基于CTC數(shù)目，將患者分為CTC陽(yáng)性(≥5個(gè)完整的CTC/7.5ml血液)或CTC陰性(<5個(gè)完整的CTC/7.5ml血液)。在血液收集之后2小時(shí)內(nèi)，提取血漿。對(duì)所有病例進(jìn)行隨訪，并記錄疾病的發(fā)展。在66名CTC+患者的癌癥治療期間，對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步隨訪。在1個(gè)完整的化療周期之后，通過(guò)放射學(xué)檢查研究針對(duì)治療的應(yīng)答，并再次采集血液樣本用于CTC計(jì)數(shù)，以及提取血漿用于HA/S100P定量。通過(guò)ELISA測(cè)量血漿中的HA/S100P，這比捕獲并計(jì)數(shù)CTC容易地多。利用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(威爾科克森秩和檢驗(yàn)，邏輯回歸，Cox回歸以及ROC分析)。

實(shí)施例1：血漿HA/S100P水平可以區(qū)分MBC患者與健康對(duì)照和非MBC患者

為了研究疾病不同階段的血漿HA/S100P水平，在60名健康志愿者、48名PBC患者和212名MBC患者中分析血漿樣本。與對(duì)照相比(HA中值[IQR]：176,9ng/ml[144,1-216,9]；S100P中值[IQR]：4,5ng/ml[3,4-7,3])，PBC患者具有類似的血漿HA/S100P水平(HA中值[IQR]：199,9ng/ml[138,4-253,1]，p＝0,73；S100P中值[IQR]：5,9ng/ml[4,0-7,7],p＝0,95)，而MBC患者具有兩倍以上的更高血漿HA/S100P水平(HA中值[IQR]：371,9ng/ml[217,0-616,8]，p＝9,37×10-13；S100P中值[IQR]：5,9ng/ml[4,0-7,7]，p＝5,34×10-7，圖1A和表1)?；贛BC患者的CTC數(shù)目，我們將其進(jìn)一步分級(jí)為CTC+和CTC-。與CTC-MBC患者相比(HA中值[IQR]：253,5ng/ml[184,4-629,3]，p＝3,33×10-16；S100P中值[IQR]：8,1ng/ml[5,0-13,85]，p＝1,24×10-12，圖1B和表1)，發(fā)現(xiàn)血漿HA/S100P水平在CTC+患者中升高(HA中值[IQR]：442,7ng/ml[343,1-596,1]；S100P中值[IQR]：14,1ng/ml[7,7-29,4])。

表1：健康對(duì)照、PBC和MBC患者中的血漿HA/S100P水平

進(jìn)行ROC分析以研究血漿HA/S100P在檢測(cè)BC患者的亞組中的判別力。在相對(duì)于健康對(duì)照檢測(cè)CTC+MBC的病例中，血漿HA/S100P水平顯示出0,99的AUC(95％CI：0,96-1,00，圖2A)，而在相對(duì)于PBC患者的CTC+患者檢測(cè)中，其顯示出0,98的AUC(95％CI：0,96-0,99，圖2B)。血漿HA/S100P在相對(duì)于健康對(duì)照(AUC：0,87，95％CI：0,83-0,91，圖2C)和原發(fā)性乳腺癌患者(AUC：0,85，95％CI：0,80-0,90，圖2D)檢測(cè)MBC患者中也具有顯著的判別力。如圖2所示，該組合的HA/S100P指示物比單獨(dú)使用HA或S100P顯示出更好的判別力，因?yàn)榻M合的指示物的AUC總是大于單一標(biāo)記物。

因此，血漿HA/S100P水平能夠有效區(qū)分MBC患者與非轉(zhuǎn)移性個(gè)體，并且其為檢測(cè)BC轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的有前景的標(biāo)志物。

實(shí)施例2:作為MBC患者的無(wú)進(jìn)展生存期的標(biāo)志物的血漿S100P和HA水平的組合

由于血漿HA/S100P水平與已知作為MBC的預(yù)后標(biāo)志物的CTC狀態(tài)相關(guān)，我們進(jìn)一步研究了血漿HA/S100P水平在MBC患者中的預(yù)后價(jià)值。將無(wú)進(jìn)展生存期(PFS)定義為從招募至疾病發(fā)展的時(shí)間(以月計(jì))。最佳截止點(diǎn)選自一系列建議的血漿HA/S100P水平，在該點(diǎn)‘陽(yáng)性’患者的中值PFS時(shí)間最初達(dá)到平臺(tái)期。利用該策略，將顯示出高于250ng/ml的血漿HA水平和高于7ng/ml的S100P水平的患者定義為‘高’HA/S100P水平。如圖3A中所示，與具有‘高’HA/S100P水平的那些患者(中值PFS時(shí)間：3,7個(gè)月，95％CI：3,1–4,3個(gè)月，對(duì)數(shù)秩和檢驗(yàn)p＝2,66×10-6，圖3A和表2)相比，具有‘低’HA/S100P水平的患者顯示出更有利的結(jié)果(中值PFS時(shí)間：7,5個(gè)月，95％CI：5,2-9,8個(gè)月)。相比之下，在我們的研究中，我們僅觀察到了CTC陰性患者和陽(yáng)性患者之間PFS的分界線的顯著差異(對(duì)數(shù)秩和檢驗(yàn)p＝0,082，圖3B和表2)。在多變量Cox回歸模型中，血漿HA和S100P水平與PFS獨(dú)立相關(guān)(表3)。

表2：用血漿HA/S100P水平和CTC狀態(tài)進(jìn)行的無(wú)進(jìn)展生存期的卡普蘭-邁耶分析

表3：利用CTC狀態(tài)、血漿HA水平、S100P水平和與MBC患者的無(wú)進(jìn)展生存期相關(guān)的其它協(xié)變量的Cox回歸模型

由于HA顯示出針對(duì)PFS的良好預(yù)測(cè)價(jià)值，其也可能為研究它與總生存期(OS)的關(guān)系提供信息。OS被定義為從招募至死亡的時(shí)間(以月計(jì))。在隨訪期間，60名患者死于轉(zhuǎn)移或相關(guān)病況。卡普蘭-邁耶分析證明，與具有較低血漿HA水平的那些患者(中值OS時(shí)間：24,6個(gè)月，95％CI：22,6-26,6個(gè)月，對(duì)數(shù)秩和檢驗(yàn)p＝7,22×10-5，圖4A和表4)相比，具有較高血漿HA/S100P水平的患者具有較短的OS時(shí)間(中值OS時(shí)間：17,5個(gè)月，95％CI：14,9-20,0個(gè)月)。同時(shí)，CTC狀態(tài)也顯示出與OS的良好相關(guān)性。與具有陰性CTC狀態(tài)的那些患者(中值OS時(shí)間：23.6個(gè)月，95％CI：21,7-25,6個(gè)月，對(duì)數(shù)秩和檢驗(yàn)p＝0,001，圖4B和表4)相比，具有陽(yáng)性CTC狀態(tài)的患者具有較短的OS時(shí)間(中值OS時(shí)間：17.0個(gè)月，95％CI：14,1-20,0個(gè)月)。

表4：用血漿HA/S100P水平和CTC狀態(tài)進(jìn)行的總生存期的卡普蘭-邁耶分析

通過(guò)多變量Cox回歸模型確認(rèn)，血漿HA和S100P水平也與OS獨(dú)立相關(guān)(表5)。

表5：利用CTC狀態(tài)、血漿HA水平、S100P水平和與MBC患者的總生存期相關(guān)的其它協(xié)變量的Cox回歸模型

因此，相對(duì)于現(xiàn)行的FDA批準(zhǔn)的基于CTC的測(cè)試，血漿HA/S100P水平對(duì)于確定無(wú)進(jìn)展生存期和總生存期具有更好的預(yù)測(cè)能力。

實(shí)施例3：血漿HA/S100P水平變化的預(yù)后價(jià)值及其與治療結(jié)果的相關(guān)性

由于血漿HA/S100P水平顯示出與疾病發(fā)展的相關(guān)性，其可能具有評(píng)價(jià)針對(duì)抗腫瘤治療的應(yīng)答的潛力。在第一個(gè)完整的化療周期之前和之后收集來(lái)自66名CTC陽(yáng)性MBC患者的血液樣本。通過(guò)影像學(xué)評(píng)價(jià)，將疾病的發(fā)展確定為完全緩解(腫瘤縮小)、部分緩解(腫瘤縮小基線檢測(cè)的至少50％)、疾病穩(wěn)定(腫瘤大小穩(wěn)定)或者疾病發(fā)展(腫瘤大小增加或者在其它位置處轉(zhuǎn)移)。疾病發(fā)展的患者被認(rèn)為對(duì)治療‘無(wú)應(yīng)答’，而其它3種結(jié)果指示患者對(duì)治療‘應(yīng)答’。在顯示對(duì)治療應(yīng)答的患者中，血漿中的血漿S100P和HA水平顯著降低39％和37％(對(duì)于S100P，p＝1,08×10-3，以及對(duì)于HA，p＝5,22×10-5，圖5和表6)，而在無(wú)應(yīng)答的患者中S100P和HA的降低率僅分別為19％和17％。

表6：1個(gè)完整的化療周期之前和之后，MBC患者中的血漿HA/S100P水平

通過(guò)邏輯回歸模型構(gòu)建HA/S100P指數(shù)，并將其用于指示影像學(xué)應(yīng)答。與CTC的降低(AUC＝0.63，95％CI：0.48-0.78，圖6)相比，HA/S100P降低指數(shù)呈現(xiàn)出較大的曲線下面積(AUC＝0.82，95％CI：0.71-0.93)。同時(shí)，與單一標(biāo)志物相比，該HA/S100P指數(shù)更好地符合影像學(xué)結(jié)果。隨后通過(guò)卡普蘭-邁耶分析確認(rèn)治療后的血漿HA/S100P水平的預(yù)后價(jià)值。使用之前界定的高于250ng/ml HA和7ng/ml S100P的截止點(diǎn)，基于這66名患者化療之后的血漿HA/S100P水平對(duì)他們進(jìn)行分級(jí)。與具有低HA/S100P的那些患者相比，甚至是在治療之后顯示出高HA/S100P水平的患者呈現(xiàn)出較短的PFS(中值PFS時(shí)間：3,6個(gè)月相對(duì)于5,9個(gè)月，對(duì)數(shù)秩和檢驗(yàn)p＝0,02，圖7A和表7)。

表7：用治療之后的血漿HA/S100P水平和CTC狀態(tài)進(jìn)行的無(wú)進(jìn)展生存期的卡普蘭-邁耶分析

類似地，這些患者也顯示出顯著較短的OS(中值OS時(shí)間：11,2個(gè)月相對(duì)于20,9個(gè)月，對(duì)數(shù)秩和檢驗(yàn)p＝2,92×10-3，圖7C和表8)。治療后CTC數(shù)目顯示出與PFS非常弱的相關(guān)性，其在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不顯著(對(duì)數(shù)秩和檢驗(yàn)p＝0,1，圖7B和表7)，但是其對(duì)于總生存期具有較好的預(yù)后價(jià)值(對(duì)數(shù)秩和檢驗(yàn)p＝4,87×10-3，圖7D和表8)。

表8：用治療后的血漿HA/S100P水平和CTC狀態(tài)進(jìn)行的總生存期的卡普蘭-邁耶分析

綜上所述，血漿HA/S100P水平與BC的轉(zhuǎn)移性過(guò)程相關(guān)，并且可以用作檢測(cè)轉(zhuǎn)移的潛在標(biāo)志物。血漿HA與S100P的組合提供了MBC患者的無(wú)進(jìn)展生存期的預(yù)后標(biāo)志物，并且其變化可以指示抗癌治療的結(jié)果。

實(shí)施例4：HA作為單一生物標(biāo)志物的預(yù)后價(jià)值

為了進(jìn)一步驗(yàn)證血漿HA水平的預(yù)后價(jià)值，在由261名PBC患者和73名MBC患者組成的獨(dú)立的基于人群的組中對(duì)其進(jìn)行測(cè)量。在驗(yàn)證組中，在MBC患者中比在PBC患者中觀察到了更高的血漿HA水平(p＝3.07×10-7，圖8A)。與探索性研究類似，在驗(yàn)證性研究中，在PBC患者中，血漿HA水平顯示與腫瘤的臨床病理特征無(wú)關(guān)，而在MBC患者中，在具有陽(yáng)性淋巴結(jié)狀態(tài)和陰性雌激素受體(ER)狀態(tài)的患者中觀察到了升高的血漿HA水平。在驗(yàn)證組中，血漿HA水平也顯示出區(qū)分MBC患者與PBC患者的判別力(AUC＝0.70，95％CI：0.62–0.77，圖8B)。

在驗(yàn)證組中，在73名MBC患者的初次診斷之后，對(duì)其可能的疾病發(fā)展或死亡進(jìn)行隨訪，以記錄他們的PFS和OS。再次將之前界定的250ng/mL的截止點(diǎn)用于確定患者有‘高’血漿HA水平還是‘低’血漿HA水平，并進(jìn)一步驗(yàn)證血漿HA水平的預(yù)后價(jià)值。在34.6個(gè)月的中值隨訪時(shí)間之后，相對(duì)于具有高血漿HA水平的那些患者，具有低血漿HA水平的患者經(jīng)歷顯著更長(zhǎng)的PFS和OS(中值PFS時(shí)間：21.1個(gè)月相對(duì)于5.8個(gè)月，對(duì)數(shù)秩和檢驗(yàn)p＝3.66×10-4；中值OS時(shí)間：42.2個(gè)月相對(duì)于17.6個(gè)月，對(duì)數(shù)秩和檢驗(yàn)p＝1.43×10-4，圖8C、8D)。