本發(fā)明屬于分析檢測(cè)領(lǐng)域，涉及基于fret(熒光共振能量轉(zhuǎn)移)用于檢測(cè)樣品中核酸靶標(biāo)的試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

國(guó)民經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展極大提升了國(guó)民對(duì)健康的關(guān)注。為在獲得高標(biāo)準(zhǔn)健康的同時(shí)實(shí)現(xiàn)健康的低成本，亟需開(kāi)發(fā)新型的診斷技術(shù)或藥物篩選方法。

熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fret)是指兩種熒光物質(zhì)在超近距離(<10nm)時(shí)發(fā)生能量轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象。受激發(fā)的供體以非輻射方式把能量轉(zhuǎn)移給受體熒光物質(zhì)，使其發(fā)光。這種熒光共振能量轉(zhuǎn)移在生物分析化學(xué)領(lǐng)域作為一種簡(jiǎn)便快捷的檢測(cè)模式已越來(lái)越受到青睞，并在體外診斷領(lǐng)域，藥物篩選等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。其中，以鑭系偶合物為熒光共振能量轉(zhuǎn)移供體的檢測(cè)模式，相比一般熒光檢測(cè)方法，可以有效的去除散色、自發(fā)熒光等樣品對(duì)熒光檢測(cè)的干擾，大大提高信噪比，從而提高檢測(cè)靈敏度和檢測(cè)準(zhǔn)確性。

微小rna因在分子生物學(xué)層面對(duì)生命現(xiàn)象起著極其重要的調(diào)控作用，而成為近年來(lái)備受矚目的明星生物分子。人體中有2500種以上的微小rna，它們通過(guò)控制絕大部分基因的轉(zhuǎn)錄-翻譯過(guò)程調(diào)控細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的平衡。多種重大疾病的重要病發(fā)機(jī)理之一已被確證是微小rna的失控表達(dá)。微小rna在血液內(nèi)的穩(wěn)定性高，其與各種疾病早期診斷、預(yù)后具有高關(guān)聯(lián)性，從而使其體外診斷成為未來(lái)診斷技術(shù)的重要前沿課題。要將微小rna作為實(shí)用型疾病診斷的有效生物標(biāo)記物，其重要前提是方便準(zhǔn)確地建立對(duì)血清、組織細(xì)胞、相應(yīng)rna提取物中的微小rna進(jìn)行分析定量的方法，但由于微小rna通常只有18-24個(gè)堿基的長(zhǎng)度且序列之間具有高相似性，使得傳統(tǒng)檢測(cè)中單純依靠雜交的模式難以有效應(yīng)用。目前微小rna的檢測(cè)通常利用實(shí)時(shí)熒光定量pcr，但該技術(shù)存在難以避免的背景擴(kuò)增，且所需檢測(cè)儀器價(jià)格昂貴，無(wú)法在臨床實(shí)驗(yàn)室得到廣泛應(yīng)用。目前均相檢測(cè)法備受臨床實(shí)驗(yàn)室青睞，該方法避免了洗滌、離心等繁瑣的人工操作，大大簡(jiǎn)化對(duì)人力、裝備的要求，因此發(fā)展一種微小rna的均相檢測(cè)技術(shù)對(duì)于實(shí)現(xiàn)微小rna成為診斷疾病的有效可靠生物標(biāo)記物有著重要的意義。

2015年，巴黎十一大學(xué)的nikohildebrandt教授工作組首次將基于鑭系偶合物的時(shí)間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用在多組分微小rna的快速診斷上(angew.chem.int.ed.2015,54,1-7)，實(shí)現(xiàn)了同一樣本中3種微小rna的同時(shí)檢出。微小rna的準(zhǔn)確檢出依賴于獲得其與核酸探針?lè)€(wěn)定結(jié)合，形成有效能量轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)，此過(guò)程中需要用到t4rna連接酶2(t4rnaligase2)，而該連接酶只能識(shí)別核酸片段5’端骨架為rna的結(jié)構(gòu)，因此，對(duì)核酸適配體的設(shè)計(jì)要求苛刻，該核酸適配體必須同時(shí)滿足既能與待測(cè)微小rna序列互補(bǔ)，又擁有5’端為rna結(jié)構(gòu)的要求。為滿足該要求，nikohildebrandt教授工作組只能合成一種由dna和rna骨架共同構(gòu)成的核酸適配體，這極大提高了檢測(cè)成本及探針的設(shè)計(jì)、合成難度，限制了該方法的應(yīng)用范圍。目前尚未有研究可以解決規(guī)避該復(fù)雜結(jié)構(gòu)核酸適配體，轉(zhuǎn)為僅僅采用dna核酸探針的試劑盒。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供基于fret用于檢測(cè)樣品中核酸靶標(biāo)的試劑盒，該試劑盒包括splintr連接酶，使用該試劑盒無(wú)需采用由dna和rna骨架共同構(gòu)成的核酸適配體即可實(shí)現(xiàn)基于fret來(lái)檢測(cè)核苷酸靶標(biāo)。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種基于fret用于檢測(cè)樣品中核酸靶標(biāo)的生物傳感體系的構(gòu)建方法。

本發(fā)明的再一目的在于提供一種splintr連接酶在制備基于fret用于檢測(cè)樣品中核酸靶標(biāo)的試劑盒中的應(yīng)用。

本發(fā)明的再一目的在于提供一種基于fret檢測(cè)樣品中核酸靶標(biāo)的方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供基于fret用于檢測(cè)樣品中核酸靶標(biāo)的試劑盒，所述試劑盒包括：

(i)供體核酸片段；

(ii)受體核酸片段；

(iii)能與所述受體核酸片段結(jié)合的第一核酸適配體；

(iv)能與所述供體核酸片段結(jié)合的第二核酸適配體；

(v)能使所述第一核酸適配體與所述第二核酸適配體結(jié)合的splintr連接酶。

本發(fā)明中所述的splintr連接酶(ligase)為商業(yè)化產(chǎn)品，可購(gòu)自于新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)(newengland)。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，在本發(fā)明所述試劑盒中，所述供體核酸片段為標(biāo)記第一熒光物質(zhì)的供體核酸片段或?yàn)樯锼鼗w核酸片段；

所述第一熒光物質(zhì)包括鑭系偶合物；

優(yōu)選地，所述鑭系偶合物包括時(shí)間分辨熒光檢測(cè)用激發(fā)態(tài)壽命大于50ns的熒光物質(zhì)；

更優(yōu)選地，所述激發(fā)態(tài)壽命大于50ns的熒光物質(zhì)包括鋱的熒光化合物(luminescentterbiumcomplex，l4tb)或銪的熒光化合物(luminescenteuropiumcomplex，l4eu)；

任選地，當(dāng)所述供體核酸片段為生物素化供體核酸片段時(shí)，所述試劑盒還包括使其成為標(biāo)記第一熒光物質(zhì)的供體核酸片段的試劑，優(yōu)選地，該試劑為l4tb標(biāo)記的鏈霉親和素；

所述受體核酸片段為標(biāo)記第二熒光物質(zhì)的受體核酸片段；所述第二熒光物質(zhì)與所述第一熒光物質(zhì)具有兩者間能發(fā)生共振能量轉(zhuǎn)移的光譜特性；

所述第二熒光物質(zhì)包括有機(jī)熒光染料、納米熒光材料和熒光蛋白質(zhì)中的一種或多種；

優(yōu)選地，所述有機(jī)熒光染料包括cy3、cy5或cy5.5；所述納米熒光材料包括量子點(diǎn)納米熒光材料或碳點(diǎn)納米熒光材料；所述熒光蛋白質(zhì)包括cfp、gfp、yfp或rfp。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，在本發(fā)明所述試劑盒中，所述第一核酸適配體還含有與所述核酸靶標(biāo)的第一部分序列完全互補(bǔ)或部分互補(bǔ)的序列，其中，所述第一部分序列位于所述核酸靶標(biāo)的3'或5'端；

所述第二核酸適配體含有與所述受體核酸片段完全互補(bǔ)或部分互補(bǔ)的序列；且

所述第二核酸適配體還含有與所述核酸靶標(biāo)的第二部分序列完全互補(bǔ)或部分互補(bǔ)的序列，所述第二部分序列位于所述核酸靶標(biāo)的另一端，所述核酸靶標(biāo)的第二部分序列的每一端位于所述的核酸靶標(biāo)的第一部分序列的外部；

優(yōu)選地，所述第二部分序列為所述核酸靶標(biāo)除所述第一部分序列外的剩余序列。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，在本發(fā)明所述試劑盒中，所述的供體核酸片段、受體核酸片段、第一核酸適配體或第二核酸適配體為單鏈的dna；

所述核酸靶標(biāo)包括微小rna、ssrna和sirna中的一種或多種，優(yōu)選鏈長(zhǎng)小于等于30bp的微小rna，更優(yōu)選地，所述微小rna為mir-208a。

本發(fā)明所述mir-208a具有seqidno:5序列；

seqidno:5’-uagcagcacguaaauauuggcg-3’。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，在本發(fā)明所述試劑盒中，所述供體核酸片段為seqidno:1；所述受體核酸片段為seqidno:2；所述第一核酸適配體為seqidno:3；所述第二核酸適配體為seqidno:4。

seqidno:15’-cgatcagtcaggcaa-3’。

seqidno:25’-ttgtgttccgataggctaaaaaa-3’。

seqidno:35’-ttgcctgactgatcgcgccaatattt-3’。

seqidno:45’-acgtgctgctaagcctatcggaacacaa-3’。

優(yōu)選地，所述seqidno:1的5’端標(biāo)記有l(wèi)4tb；或其5’端標(biāo)記有teg-生物素；任選地，當(dāng)所述seqidno:1的5’端標(biāo)記有teg-生物素時(shí)，所述試劑盒還包括l4tb的鏈霉親和素；

優(yōu)選地，所述seqidno:2的3’端標(biāo)記有cy5。

本發(fā)明發(fā)展了一種包含splintr連接酶的試劑盒，利用該新型核酸連接酶可構(gòu)建高靈敏核酸及其類似物檢測(cè)生物傳感體系(生物傳感器)，尤其是微小rna檢測(cè)生物傳感體系，相較于現(xiàn)有技術(shù)(angew.chem.int.ed.2015,54,1-7)使用的t4rna連接酶2檢測(cè)微小rna，本發(fā)明試劑盒無(wú)需包含復(fù)雜的dna-rna雜交結(jié)構(gòu)核酸適配體，僅需設(shè)計(jì)合成全dna單鏈核酸適配體即可實(shí)現(xiàn)對(duì)微小rna的有效準(zhǔn)確檢測(cè)。本發(fā)明所述試劑盒在臨床應(yīng)用中具有更好的實(shí)用性價(jià)值，并可在此基礎(chǔ)上提供可實(shí)現(xiàn)多種生物標(biāo)記物的高靈敏快速均相檢測(cè)的方法。

另一方面，本發(fā)明提供一種基于fret用于檢測(cè)樣品中核酸靶標(biāo)的生物傳感體系的構(gòu)建方法，所述方法包括如下步驟：

(a)制備本發(fā)明標(biāo)記第一熒光物質(zhì)的供體核酸片段或生物素化供體核酸片段，及標(biāo)記第二熒光物質(zhì)的受體核酸片段；

(b)制備本發(fā)明第一核酸適配體及第二核酸適配體；

(c)在緩沖溶液中分散制得的標(biāo)記第一熒光物質(zhì)的供體核酸片段或生物素化供體核酸片段、標(biāo)記第二熒光物質(zhì)的受體核酸片段、第一核酸適配體及第二核酸適配體；并且加入splintr連接酶以及atp得所述生物傳感體系，優(yōu)選地，該酶在所述生物傳感體系的濃度為0.1～1反應(yīng)單位/100～150μl，atp的濃度為0.8～1.2mm；

當(dāng)加入生物素化供體核酸片段時(shí)，在緩沖溶液中還分散使其成為標(biāo)記第一熒光物質(zhì)的供體核酸片段的試劑；優(yōu)選地，該試劑為l4tb標(biāo)記的鏈霉親和素；

任選地，所述方法還包括將步驟(c)所得生物傳感體系進(jìn)行凍干處理。

本發(fā)明所述凍干處理是將除了待檢測(cè)核酸靶標(biāo)以外在緩沖溶液中混合好的生物傳感體系進(jìn)行凍干處理，使其轉(zhuǎn)變成粉末狀，以使其更好的保存，確保生物傳感體系中的生物分子不會(huì)被降解而是去活性。

再一方面，本發(fā)明提供一種splintr連接酶在制備基于fret用于檢測(cè)樣品中核酸靶標(biāo)的試劑盒中的應(yīng)用。

優(yōu)選地，所述應(yīng)用包括如下步驟：

(a)根據(jù)本發(fā)明所述的方法構(gòu)建待檢測(cè)核酸靶標(biāo)的生物傳感體系；

(b)加入待檢測(cè)核酸靶標(biāo)后，以供體核酸片段中標(biāo)記的第一熒光物質(zhì)的發(fā)射光為體系檢測(cè)熒光能量來(lái)源，檢測(cè)體系中的供體通道熒光強(qiáng)度與受體通道熒光強(qiáng)度，并將兩者的比值為定量依據(jù)；

(c)比較步驟(b)中得到的供體通道熒光強(qiáng)度與受體通道熒光強(qiáng)度的比值與預(yù)先建立的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，以確定待檢測(cè)核酸靶標(biāo)的量；

任選地，當(dāng)本發(fā)明所述生物傳感體系的構(gòu)建方法包括將步驟(c)所得生物傳感體系進(jìn)行凍干處理時(shí)，上述步驟(a)還包括在凍干處理所得粉末中加入水以構(gòu)建待檢測(cè)核酸靶標(biāo)的生物傳感體系。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，在本發(fā)明所述應(yīng)用中，建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的步驟包括：將待檢測(cè)核酸靶標(biāo)加入所述生物傳感體系中反應(yīng)，檢測(cè)供體通道信號(hào)及受體通道信號(hào)，計(jì)算熒光強(qiáng)度比值；采用不同濃度的待檢測(cè)核酸靶標(biāo)重復(fù)上述步驟，根據(jù)在不同待檢測(cè)核酸靶標(biāo)的濃度條件下，得到的供體通道信號(hào)與受體通道信號(hào)強(qiáng)度的比值，繪制待檢測(cè)核酸靶標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)濃度工作曲線；

優(yōu)選所述待檢測(cè)核酸靶標(biāo)包括鏈長(zhǎng)小于等于30bp的微小rna，更優(yōu)選地，所述微小rna為mir-208a。

本發(fā)明的原理是采用高特異性的splintr連接酶，將標(biāo)記有第一熒光物質(zhì)的供體核酸片段、標(biāo)記有第二熒光探針的受體核酸片段、第一核酸適配體及第二核酸適配體在待測(cè)核酸靶標(biāo)的介導(dǎo)下，例如在微小rna的介導(dǎo)下，相互連接形成可實(shí)現(xiàn)高效熒光共振能量轉(zhuǎn)移的復(fù)合結(jié)構(gòu)，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)移熒光信號(hào)，構(gòu)建出基于高連接活性的核酸靶標(biāo)的高靈敏高特異熒光檢測(cè)傳感器，例如基于高連接活性的微小rna的高靈敏高特異熒光檢測(cè)傳感器。

再一方面，本發(fā)明提供一種基于fret檢測(cè)樣品中核酸靶標(biāo)的方法，所述方法包括如下步驟：

(a)根據(jù)本發(fā)明所述的方法構(gòu)建待檢測(cè)核酸靶標(biāo)的生物傳感體系；

(b)加入待檢測(cè)核酸靶標(biāo)后，以供體核酸片段中標(biāo)記的第一熒光物質(zhì)的發(fā)射光為體系檢測(cè)熒光能量來(lái)源，檢測(cè)體系中的供體通道熒光強(qiáng)度與受體通道熒光強(qiáng)度，并將兩者的比值為定量依據(jù)；

(c)比較步驟(b)中得到的供體通道熒光強(qiáng)度與受體通道熒光強(qiáng)度的比值與預(yù)先建立的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，以確定待檢測(cè)核酸靶標(biāo)的量；

任選地，當(dāng)本發(fā)明所述生物傳感體系的構(gòu)建方法包括將步驟(c)所得生物傳感體系進(jìn)行凍干處理時(shí)，上述步驟(a)還包括在凍干處理所得粉末中加入水以構(gòu)建待檢測(cè)核酸靶標(biāo)的生物傳感體系。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，在本發(fā)明所述基于fret檢測(cè)樣品中核酸靶標(biāo)的方法中，建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的步驟包括：將待檢測(cè)核酸靶標(biāo)加入所述生物傳感體系中反應(yīng)，檢測(cè)供體通道信號(hào)及受體通道信號(hào)，計(jì)算熒光強(qiáng)度比值；采用不同濃度的待檢測(cè)核酸靶標(biāo)重復(fù)上述步驟，根據(jù)在不同待檢測(cè)核酸靶標(biāo)的濃度條件下，得到的供體通道信號(hào)與受體通道信號(hào)強(qiáng)度的比值，繪制待檢測(cè)核酸靶標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)濃度工作曲線；

本發(fā)明檢測(cè)核酸靶標(biāo)的原理是采用高特異性的splintr連接酶，將標(biāo)記有第一熒光物質(zhì)的供體核酸片段、標(biāo)記有第二熒光探針的受體核酸片段、第一核酸適配體及第二核酸適配體在待測(cè)核酸靶標(biāo)的介導(dǎo)下，例如在微小rna的介導(dǎo)下，相互連接形成可實(shí)現(xiàn)高效熒光共振能量轉(zhuǎn)移的復(fù)合結(jié)構(gòu)，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)移熒光信號(hào)，構(gòu)建出基于高連接活性的核酸靶標(biāo)的高靈敏高特異熒光檢測(cè)傳感器，例如基于高連接活性的微小rna的高靈敏高特異熒光檢測(cè)傳感器。

本發(fā)明所述的檢測(cè)樣品中核酸靶標(biāo)的方法為均相檢測(cè)法，其具有如上所述的優(yōu)勢(shì)。

本發(fā)明以檢測(cè)樣品中的微小rna為例，詳細(xì)說(shuō)明如下：

(1)生物傳感器的構(gòu)建

在緩沖溶液中，例如ph7.4左右的緩沖液中，依次加入標(biāo)記第一熒光物質(zhì)的供體核酸片段、標(biāo)記第二熒光物質(zhì)的受體核酸片段、第一核酸適配體及第二核酸適配體及splintr連接酶，當(dāng)加入微小rna后即通過(guò)核酸片段間的配對(duì)形成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的微小rna檢測(cè)傳感器；其中，緩沖溶液里包含一定濃度的鎂離子作為splintr連接酶的輔助因子，一定濃度的atp作為連接反應(yīng)的能量供給源；緩沖溶液中加入含微小rna待測(cè)樣本后，均勻混合，在37℃孵育30分鐘。

(2)熒光信號(hào)的采集及樣品檢測(cè)

利用酶標(biāo)儀對(duì)體系中的熒光共振能量轉(zhuǎn)移進(jìn)行定量，分別讀取供體通道的熒光強(qiáng)度和受體通道的熒光強(qiáng)度，其比值作為本生物傳感器檢測(cè)微小rna的有效檢測(cè)指標(biāo)。

本發(fā)明中的生物傳感器，不僅可直接對(duì)體系中的微小rna進(jìn)行快速準(zhǔn)確定量，也可通過(guò)在核酸適配體的微小rna檢測(cè)區(qū)域設(shè)計(jì)不同序列實(shí)現(xiàn)對(duì)不同序列生物分子，如dna、rna、核酸類似物等的靶向檢測(cè)。

所述的第一熒光物質(zhì)包括：l4tb、l4eu等時(shí)間分辨熒光檢測(cè)用長(zhǎng)壽命熒光物質(zhì)；

所述的第二熒光物質(zhì)包括：cy3、cy5、cfp、量子點(diǎn)納米材料、gfp、yfp、rfp等；包括發(fā)光波長(zhǎng)在400～700nm的現(xiàn)有技術(shù)產(chǎn)品。

綜上所述，本發(fā)明主要提供基于fret用于檢測(cè)樣品中核酸靶標(biāo)的試劑盒，其可應(yīng)用于均相檢測(cè)，當(dāng)應(yīng)用于檢測(cè)微小rna時(shí)，其利用splintr連接酶對(duì)dna和rna雜交鏈均可實(shí)現(xiàn)高效連接的特點(diǎn)，無(wú)需對(duì)核酸適配體進(jìn)行特殊修飾，有效避免dna/rna異類雜交。本發(fā)明既能保證檢測(cè)傳感器結(jié)構(gòu)穩(wěn)定高效形成，大大提高檢測(cè)效率，又可有效簡(jiǎn)化核酸片段的設(shè)計(jì)和制備，降低檢測(cè)成本。

附圖說(shuō)明

圖1為基于fret用于檢測(cè)微小rna的生物傳感器的檢測(cè)特異性比較結(jié)果示意圖；

圖2為基于fret用于檢測(cè)微小rna的生物傳感器的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖3atp濃度相同(10μmol)時(shí)，微小rna熒光檢測(cè)生物傳感體系中splintr連接酶的濃度優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖；

圖4為splintr連接酶濃度相同(0.1u)時(shí)，微小rna熒光檢測(cè)生物傳感體系中atp的濃度優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖；

圖5為本發(fā)明構(gòu)建的基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的生物傳感器在最優(yōu)條件下檢測(cè)mir-208a的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

具體實(shí)施方式

為了對(duì)本發(fā)明的技術(shù)特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，現(xiàn)結(jié)合具體實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行以下詳細(xì)說(shuō)明，應(yīng)理解這些實(shí)例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1

本實(shí)施例欲檢測(cè)樣品中mir-208a，其序列為：5’-uagcagcacguaaauauuggcg-3’；

檢測(cè)如上mir-208a的方法包括如下步驟：

(1)核酸片段的制備

(a)制備生物素化的供體核酸片段：

生物素化的供體核酸片段序列為5’-teg-生物素-cgatcagtcaggcaa-3’；

(b)制備cy5標(biāo)記的受體核酸片段的：

受體核酸片段序列為5’-ttgtgttccgataggctaaaaaa-3’，3’端標(biāo)記cy5熒光染料；

(c)制備與供體核酸片段結(jié)合的第一核酸適配體：

該核酸配體的序列為5’-ttgcctgactgatcgcgccaatattt-3’。

(d)制備與受體核酸片段結(jié)合的第二核酸配體：

該核酸配體序列為5’-acgtgctgctaagcctatcggaacacaa-3’，5’端磷酸化修飾；

(e)合成mir-208a

mir-208a序列為：5’-uagcagcacguaaauauuggcg-3’

(2)基于熒光能量共振轉(zhuǎn)移的微小rna檢測(cè)生物傳感器構(gòu)建：

將前述的制備好的第一核酸適配體、第二核酸配體、sa-l4tb(標(biāo)記有l(wèi)4tb的鏈霉親和素)、atp分散于1ml緩沖溶液(pbs，ph7.4)中，終濃度均為2nm，在室溫下混合均勻，分別加入100μl/孔于樣品板中。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分別在不同孔中分別加入生物素化的供體核酸片段(僅供體，終濃度2nm)；cy5標(biāo)記的受體核酸片段(僅受體，終濃度2nm)；生物素化的供體核酸片段和cy5標(biāo)記的受體核酸片段(供體+受體，無(wú)連接酶，終濃度2nm)；生物素化的供體核酸片段和cy5標(biāo)記的受體核酸片段(終濃度均為2nm)和0.01反應(yīng)單位splintr連接酶(供體+受體，0.01u連接酶)；生物素化的供體核酸片段和cy5標(biāo)記的受體核酸片段(終濃度均為2nm)和0.1反應(yīng)單位splintr連接酶(供體+受體，0.1u連接酶)；生物素化的供體核酸片段和cy5標(biāo)記的受體核酸片段(終濃度均為2nm)和1反應(yīng)單位splintr連接酶(供體+受體，1u連接酶)。

在反應(yīng)孔中加入濃度為1nm的mir-208a，并最后補(bǔ)足反應(yīng)總體積至150μl，37℃孵育30分鐘，利用酶標(biāo)儀測(cè)量485±20nm(供體)及665±8nm(受體)通道內(nèi)熒光信號(hào)的變化，分別繪制不同孔中柱狀圖。所得結(jié)果如圖1所示，從圖1中可以看出只有在待測(cè)mir-208a存在時(shí)，該生物傳感器才能產(chǎn)生有效熒光共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。所形成的生物傳感器的結(jié)構(gòu)示意圖如圖2所示。

將前述的制備好的生物素化的供體核酸片段、cy5標(biāo)記的受體核酸片段、第一核酸適配體、第二核酸適配體、sa-l4tb(標(biāo)記有l(wèi)4tb的鏈霉親和素)、atp分散于1ml緩沖溶液(pbs，ph7.4)中，終濃度均為2nm，在室溫下混合均勻，分別加入100μl/孔于樣品板中。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分別在不同孔中分別加入splintr連接酶，使其終濃度分別為0.1、1、2、5、10個(gè)反應(yīng)單位。

在反應(yīng)孔中加入濃度為1nm的mir-208a，37℃孵育30分鐘，利用酶標(biāo)儀測(cè)量485±20nm(供體)及665±8nm供體/(受體)通道內(nèi)熒光信號(hào)的變化，分別繪制加入不同濃度splintr連接酶的信號(hào)柱狀圖。所得結(jié)果如圖3所示，從圖3中可以看出利用受體通道與供體通道中熒光信號(hào)的比值，可判斷當(dāng)splintr連接酶為1u時(shí)檢測(cè)的特異性最好；

將前述的制備好的生物素化的供體核酸片段、cy5標(biāo)記的受體核酸片段、第一核酸適配體、第二核酸適配體、sa-l4tb(標(biāo)記有l(wèi)4tb的鏈霉親和素)、splintr連接酶分散于1ml緩沖溶液(pbs，ph7.4)中，終濃度均為2nm，在室溫下混合均勻，分別加入100μl/孔于樣品板中。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分別在不同孔中分別加入atp，使其終濃度分別為0.1、1、10、100、1000μm。

在反應(yīng)孔中加入濃度為1nm的mir-208a，37℃孵育30分鐘，利用酶標(biāo)儀測(cè)量485±20nm(供體)及665±8nm供體/(受體)通道內(nèi)熒光信號(hào)的變化，分別繪制加入不同濃度atp的信號(hào)柱狀圖。所得結(jié)果如圖4所示，從圖4中可以看出利用受體通道與供體通道中熒光信號(hào)的比值，可判斷當(dāng)atp為1μmol時(shí)檢測(cè)的特異性最好。

實(shí)施例2

(1)將實(shí)施例1制備好的生物素化的供體核酸片段、cy5標(biāo)記的受體核酸片段、第一核酸適配體、第二核酸配體、atp、splintr連接酶分散于1ml緩沖溶液(pbs，ph7.4)中，終濃度均為2nm，在室溫下混合均勻，各核酸片段存在序列相互互補(bǔ)部分，而在溶液形成雜交。隨后，向溶液中加入標(biāo)記有l(wèi)4tb的鏈霉親和素(終濃度為2nm)，因其會(huì)與標(biāo)記有teg-生物素的供體核酸特異性結(jié)合，而獲得l4tb標(biāo)記的供體核酸片段，即傳感檢測(cè)體系中的能量供體。

(2)繪制生物傳感器檢測(cè)mir-208a的工作曲線

將濃度分別為20pm、100pm、500pm、1nm、1.5nm、2nm的mir-208a加入如上構(gòu)建的生物傳感器中，在37℃孵育30分鐘，利用酶標(biāo)儀測(cè)量485±20nm(供體)及665±8nm(受體)通道內(nèi)熒光信號(hào)的變化，以兩者的比值為檢測(cè)指標(biāo)，繪制定量mir-208a的工作曲線，所得結(jié)果如圖5所示。

(3)檢測(cè)樣本中微小rna16的濃度

將未知濃度的mir-208a直接加入如上構(gòu)建的生物傳感器體系，在37℃孵育30分鐘，利用酶標(biāo)儀測(cè)量供體/受體通道內(nèi)熒光信號(hào)的變化，以兩者的比值為檢測(cè)指標(biāo)，結(jié)合工作曲線，計(jì)算得到樣本中目標(biāo)mir-208a的濃度為850pm。

最后說(shuō)明的是：以上實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施過(guò)程和特點(diǎn)，而非限制本發(fā)明的技術(shù)方案，盡管參照上述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：依然可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明的精神和范圍的任何修改或局部替換，均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍當(dāng)中。