本發(fā)明涉及可溶性目標蛋白準確定量技術領域，尤其是涉及一種基于血清的elisa標準品稀釋液的制備方法。
背景技術：
elisa(酶聯(lián)免疫吸附試驗)是進行樣本中可溶性目標蛋白準確定量的一種方法。elisa試劑盒的核心組件標準品稀釋液的功能就是保證elisa試劑盒的準確度。理論上標準品稀釋液的組分應該是除不含目標蛋白外其他組分與待檢樣本的組分完全相同，但實際情況是這是不可能的，特別是人的血清、血漿樣本。
教科書上的標準品稀釋液為含0.5％bsa的pbs-t溶液，此溶液用于細胞培養(yǎng)上清、組織研磨液、組織裂解液等低蛋白濃度的樣本類型的應用效果還是可以的，加標回收通常在80-120％之間。但對于血清、血漿這樣高蛋白濃度組分復雜的樣本，加標回收只有20-30％，這樣得到的結(jié)果與實際濃度相差太大，是非常不準確的。也有使用人的復鈣血漿做樣本稀釋液，效果是好些，問題是潛在傳染性、數(shù)量有限、價格昂貴，還有法律的禁制。
技術實現(xiàn)要素：
為解決現(xiàn)有技術中的不足，本發(fā)明的目的是提供一種基于血清的elisa標準品稀釋液的制備方法，旨在解決現(xiàn)有普通標準品稀釋液對高蛋白濃度組分復雜的樣本加標回收效果差，回收效果較好的標準品稀釋液價格昂貴，潛在問題嚴重。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術方案為：一種基于血清的elisa標準品稀釋液的制備方法，包括以下步驟，
a.用緩沖液配制若干動物血清，血清濃度為5％-95％，濃度梯度為5％，在各個濃度的動物血清中加入目標蛋白，取若干健康的人血清樣本，加入目標蛋白，配置后目標蛋白濃度與動物血清中接近；所述緩沖液的ph為7.2～7.4；
b.對加入目標蛋白后的各個濃度的動物血清與人血清樣本做常規(guī)elisa實驗操作；
c.制作od曲線：excel表橫軸為動物血清濃度，縱軸為od值制作od曲線；
d.確定與人血清樣本od平均值相交的動物血清濃度，即人血清中目標蛋白在elisa實驗中的反應性狀與該交點所示濃度的動物血清相近；
e.利用d中所得濃度的動物血清做加標回收實驗，確認回收率是否在80％到-120％，如有偏差，上下微調(diào)該動物血清濃度即可。
作為優(yōu)選，所述動物血清中目的蛋白濃度為200pg/ml。
為了消除由于試劑不純或試劑干擾等所造成的誤差，還包括以下步驟，對步驟a中的各個濃度的動物血清與健康的人血清做空白加樣，所得數(shù)據(jù)作為步驟d的數(shù)據(jù)背景。
為了方便采集并降低成本，所述動物血清采用山羊血清、兔血清或胎牛血清中的一種。
作為優(yōu)選，所述緩沖液為0.5％tween20bps或tbs-t。
本發(fā)明的有益效果：加標回收效果好，價格較低，制作方便。
附圖說明
圖1為本發(fā)明的實施例1的od曲線圖。
具體實施方式
實施例1，一種基于血清的elisa標準品稀釋液的制備方法，
a.用0.5％tween20bps系列配制山羊血清，濃度梯度5％，濃度分數(shù)分別為5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％，每個山羊血清濃度95ul中加入5ul濃度為4000pg/ml的h-il-6標準蛋白，標準蛋白終濃度為200pg/ml；取4個健康人血清，95ul中加入5ul濃度為4000pg/ml的h-il-6標準蛋白(一般健康人血清h-il-6的濃度在20pg/ml以下，加標后血清的標準蛋白濃度約為200pg/ml，如果遇到h-il-6表達較高的，剔除其數(shù)據(jù))；
b.將加標后的各濃度山羊血清和加標后的人血清樣本，加入預包被的h-il-6酶標板50ul/孔，再加入50ul/孔的h-il-6檢測抗體，室溫300轉(zhuǎn)/分鐘振蕩2小時孵育，然后洗滌液洗滌5次，加入100ul/孔的辣根過氧化物酶，隨后洗滌液洗滌5次，加入100ul/孔tmb顯色底物，顯色10分鐘，2m的硫酸終止反應；所得酶標儀檢測波長450nm，參考波長630nm讀取od值；
c.制作od曲線；
d.由od曲線圖可知，人血清樣本200pg/ml加標的平均od值與山羊血清加標的od曲線相交于60％處，即人血清中h-il-6在elisa實驗中的反應性狀與60％濃度山羊血清相近。
e.以60％濃度山羊血清作為h-il-6的標準品稀釋液，10個人血清樣本做加標回收實驗，回收率范圍99％-115％，平均回收率106％。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換或改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。