本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測定技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及基于核酸適體熒光探針的糖化血紅蛋白GHb試劑盒及其檢測方法。

背景技術(shù)：
糖尿病是人類健康的世界性公共衛(wèi)生問題，糖尿病是一種終生性疾病，其并發(fā)癥是至殘至死的主要原因，所以人們希望能盡早發(fā)現(xiàn)和治療糖尿病。傳統(tǒng)的糖尿病診斷和治療監(jiān)測采用空腹血糖、餐后血糖和口服葡萄糖耐量試驗(yàn)等，但是血糖參數(shù)僅代表抽血時(shí)的瞬間血糖水平，而糖化血紅蛋白(GHb)作為反映長期血糖水平的金標(biāo)準(zhǔn)，也是監(jiān)測糖尿病治療的重要指標(biāo)。GHb是紅細(xì)胞中血紅蛋白與葡萄糖緩慢、持續(xù)且不可逆地進(jìn)行非酶促蛋白糖化反應(yīng)的產(chǎn)物。形成兩周后不易分開。當(dāng)血液中葡萄糖濃度較高時(shí)，人體所形成的GHb含量也會(huì)相對(duì)較高.正常生理?xiàng)l件下，非酶促糖化反應(yīng)產(chǎn)物的生成量與反應(yīng)物的濃度成正比。由于蛋白質(zhì)濃度保持相對(duì)穩(wěn)定，糖化水平主要決定于葡萄糖濃度，也與蛋白質(zhì)與葡萄糖接觸的時(shí)間長短有關(guān)。GHb可以反映最近2—3個(gè)月的平均血糖水平。2002年美國糖尿病協(xié)會(huì)已明確規(guī)定應(yīng)定期檢測GHb，并將其作為監(jiān)測糖尿病血糖控制的金標(biāo)。普及糖尿病知識(shí)，更新治療理念，監(jiān)測并保持GHb達(dá)標(biāo)，更早、更合理地使用胰島素等藥物治療，對(duì)于控制糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展尤為重要。目前常用的糖化血紅蛋白GHb的檢測方法有以下幾種類型：高壓液相方法(HPLC)：可全自動(dòng)分離測定GHb及血蛋白的變異體和亞型，但儀器的操作保養(yǎng)要求較高，CV值1%以內(nèi)，難以在比較基層的醫(yī)院和實(shí)驗(yàn)室普及；微柱法手工操作步驟繁瑣，層析時(shí)間和微柱的質(zhì)量不易控制，易產(chǎn)生操作技術(shù)誤差，重復(fù)性欠佳；而且干擾因素很多，尤其對(duì)pH值和溫度的變化敏感，HbF及變異血紅蛋白(HbS、HbC、HbE等)對(duì)結(jié)果干擾，擾程度根據(jù)柱的分離能力而定，且要仔細(xì)觀察圖譜，所以該法得不到普遍采用。免疫方法：免疫方法是目前采用比較多的檢測手段，主要包括以下幾種檢測方式。（1）比濁法：利用抗原、抗體反應(yīng)的原理進(jìn)行測定。GHb的B鏈N末端提供了一個(gè)容易被抗體識(shí)別的抗原表位，用單克隆抗體特異識(shí)別GHb的B鏈N末端最后4～6個(gè)氨基酸組成的抗原表位，結(jié)合比濁法測定。（2）離子捕獲法：應(yīng)用抗原抗體反應(yīng)原理，并聯(lián)以熒光標(biāo)志物，通過連接帶負(fù)電的多陰離子復(fù)合物，吸附到帶正電的的纖維表面，經(jīng)過一系列徹底清洗等步驟后，測定熒光強(qiáng)度變化率，計(jì)算GHb濃度。（3）膠乳凝集法：利用抗原抗體反應(yīng)直接測定總lib中HbAlc的百分含量的方法。樣品中總Hb和GHb與膠乳有相同的非特異性吸附而固相化，當(dāng)加入HbAlc的特異性單克隆抗體后形成膠乳一GHb．鼠抗人GHb單克隆抗體的復(fù)合物，此復(fù)合物由于羊抗鼠抗體而形成凝集，凝集量因膠乳表面固相化的GHb量的不同而不同。通過測定其吸光度并與GHb百分濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較后即可求出樣品中GHb所占Hb的百分含量。免疫法測定糖化血紅蛋白其準(zhǔn)確性和重復(fù)性均有欠缺，測定受高濃度葡萄糖、高三酰甘油、高膽紅素等物質(zhì)的干擾，由于樣本的濁度會(huì)使光度計(jì)測定產(chǎn)生錯(cuò)誤。另外，抗體由動(dòng)物免疫獲得，成本高且篩選周期長，批與批之間存在差異；抗體對(duì)溫度濕度敏感，易變性難保存等缺點(diǎn)。親和層析法：利用硼化親和試驗(yàn)作為檢測原理。該法的試劑能溶解紅細(xì)胞并特異性沉淀血紅蛋白因子，其中藍(lán)色的硼酸綴合物能和糖化血紅蛋白上的Cis-diols相結(jié)合。血液加入試劑中，紅細(xì)胞立即溶解，使全部的血紅蛋白都沉淀，硼酸綴合物就和GHb中的cis-diol結(jié)構(gòu)相結(jié)合。血液和試劑混合后加入濾膜裝置，所有沉淀的血紅蛋白，不管是和綴合物結(jié)合的或未結(jié)合的都保留在濾膜的頂部。過量的顯色綴合物就被洗滌液洗掉。通過金標(biāo)定量儀測定藍(lán)色（糖化血紅蛋白）和紅色（總血紅蛋白）的強(qiáng)度，可以計(jì)算樣品中的GHb的百分比。核酸適配體是近年發(fā)展起來的一類新型識(shí)別分子，近年來受到科學(xué)家的廣泛關(guān)注，大量針對(duì)重要生理活性分子的核酸適配體被篩選出來；各種基于核酸適配體的分析方法和技術(shù)已被報(bào)道；核酸適配體藥物“Macugen”也已于2005年被FDA正式批準(zhǔn)上市。SELEX技術(shù)篩選得到的寡核苷酸序列被稱為適配子,國內(nèi)其翻譯為核酸適體、核酸適配子、核酸識(shí)體或核酸適配體等。SELEX技術(shù)是指應(yīng)用化學(xué)法合成大容量的隨機(jī)寡核苷酸(由兩端的固定序列和中間的隨機(jī)序列組成)文庫,通過施加選擇壓力(結(jié)合靶目標(biāo)，淘選與靶目標(biāo)高度特異結(jié)合片段的過程),并結(jié)合體外擴(kuò)增技術(shù),經(jīng)過多輪的循環(huán)選擇富集,獲得與靶物質(zhì)高度特異結(jié)合的寡核苷酸分子,可以是RNA也可以是DNA,長度一般為25~60個(gè)核苷酸。芘是一種可燃的淡黃色單斜晶體有機(jī)化合物，其分子結(jié)構(gòu)如下圖1，不溶于水，易溶于乙醇、乙醚?？蛇M(jìn)行親電取代，如鹵化、硝化、磺化等反應(yīng)。芘主要存在于煤焦油瀝青的蒸餾物中。芘為有機(jī)合成原料，經(jīng)氧化可制取1,4,5,8-萘四甲酸，用于染料、合成樹脂、分散性染料和工程塑料；酰化后可制還原染料艷橙GR及其他多種染料；還可制殺蟲劑、增塑劑等；目前芘分子可作為熒光探針用于基于核酸適體的檢測方法中。熒光染料芘，當(dāng)一個(gè)激發(fā)態(tài)分子（*Py）和另一個(gè)基態(tài)分子（Py）近距離遭遇的時(shí)候能形成激發(fā)態(tài)二聚體（*Py+Py），能在比芘單體波長更長的位置釋放一個(gè)光子。芘激發(fā)態(tài)二聚體在480到500nm處有一個(gè)寬的平的發(fā)射峰，這個(gè)發(fā)射峰很容易鑒別；因?yàn)榧词管艈误w的發(fā)射峰也很寬，但芘單體的發(fā)射峰在370到400nm之間。與熒光共振能量轉(zhuǎn)移類似，形成激發(fā)態(tài)二聚體具有嚴(yán)格的距離依賴性，有利于發(fā)展新型核酸探針。將兩個(gè)芘分子分別連接在分子信標(biāo)的兩端，設(shè)計(jì)成“激發(fā)態(tài)二聚體-單體轉(zhuǎn)換型”分子信標(biāo)，對(duì)目標(biāo)DNA進(jìn)行檢測；將兩個(gè)芘分子連接到分子信標(biāo)的一端作為熒光基團(tuán)，另一端連接熒光淬滅基團(tuán)，核酸適體與被測目標(biāo)的結(jié)合引起其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使兩端的芘分子靠近而形成激發(fā)態(tài)二聚體，通過檢測核酸適體探針的熒光強(qiáng)度和熒光壽命，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)被測目標(biāo)的高靈敏檢測。核酸適體與靶物質(zhì)結(jié)合所呈現(xiàn)的高敏感性和高特異性,使其在疾病診斷中具有良好的應(yīng)用前景,盡管目前成熟的臨床應(yīng)用報(bào)道較少,但應(yīng)用適體檢測靶蛋白的研究卻不斷增多,基于適體的檢測新技術(shù)也不斷出現(xiàn)。核酸適體由于其獨(dú)特的化學(xué)抗體特性成為新一代針對(duì)特定蛋白的分子藥物或靶向載體，以及用于檢測其特異性識(shí)別的靶分子物質(zhì)。但是目前基于核酸適體的針對(duì)于糖化血紅蛋白GHb診斷試劑還很缺乏，且針對(duì)于糖化血紅蛋白GHb的核酸適體熒光探針檢測試劑盒的開發(fā)尚未見有報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有的易產(chǎn)生操作技術(shù)誤差、重復(fù)性欠佳、干擾因素很多、操作繁瑣、測試成本高等不足，提供一種基于核酸適體熒光探針的糖化血紅蛋白GHb試劑盒及其檢測方法。本發(fā)明的方案是通過這樣實(shí)現(xiàn)的：一種基于核酸適體熒光探針的糖化血紅蛋白試劑盒，其特征在于，主要成分包括：含NH4Cl、Tris、EDTA-Na2的紅細(xì)胞裂解液；含MgCl2的0.2M磷酸緩沖液；糖化血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品；糖化血紅蛋白核酸適體熒光探針；所述糖化血紅蛋白核酸適體熒光探針為5'和3'兩端分別標(biāo)記熒光芘分子單體的核苷酸單鏈，該核苷酸單鏈序列為SEQIDNO:1~SEQIDNO:4中的任意一條DNA片段序列，其序列為：SEQIDNO:1：gggaggcatgtgtgctaaggcgtagcagggttggaaccc；SEQIDNO:2：gggaggcatgtgatttaaggcgcggcagatgttggaaccc；SEQIDNO:3：gggaggcatgagacctatggcgttgcattggttggaaccc；SEQIDNO:4：gggaggcatgggaaacaatgcgccgcagagttggaaccc。以上所述的一種基于核酸適體熒光探針的糖化血紅蛋白試劑盒，所述含NH4Cl、Tris、EDTA-Na2的紅細(xì)胞裂解液為含有1~280mmol/LNH4Cl,1~34mmol/LTris,1~2mmol/LEDTA-Na2,pH7.0~7.2；所述含MgCl2的0.2M磷酸緩沖液為含有1~10mmol/LMgCl2。以上任一所述的一種基于核酸適體熒光探針的糖化血紅蛋白試劑盒，其特征在于，所述含NH4Cl、Tris、EDTA-Na2的紅細(xì)胞裂解液、含MgCl2的0.2M磷酸緩沖液、糖化血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、糖化血紅蛋白核酸適體熒光探針為配制好直接使用的液體試劑或是使用前需加水溶解的干粉狀態(tài)。以上所述的一種基于核酸適體熒光探針的糖化血紅蛋白試劑盒，其特征在于，該試劑盒用于檢測肝素抗凝全血或末梢血中的糖化血紅蛋白濃度。一種用以上任一所述基于核酸適體熒光探針的糖化血紅蛋白試劑盒來檢測糖化血紅蛋白濃度的方法，其特征在于，方法步驟包括：（1）血樣裂解：將血樣和含NH4Cl、Tris、EDTA-Na2的紅細(xì)胞裂解液按1:0.5~5體積比混勻，靜置5~30min，再中速離心5~10min，收集上清液；（2）混合卵育：混合卵育：取20~100μl步驟1）得到的上清液和30~50ul的用含MgCl2的0.2M磷酸緩沖液，溶解糖化血紅蛋白核酸適體熒光探針得到的糖化血紅蛋白核酸適體熒光探針試劑混合，室溫下卵育5~15min，使糖化血紅蛋白核酸適體熒光探針與血樣充分結(jié)合，得到測試液；（3）熒光檢測：熒光檢測儀檢測步驟2）得到的測試液50ul，在熒光檢測儀熒光激發(fā)后，讀取熒光激發(fā)后20至100ns時(shí)間段內(nèi)波長在480~500nm的熒光值；（4）結(jié)果計(jì)算：使用生物醫(yī)學(xué)作圖軟件，參照糖化血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)樣品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)合步驟3）中檢測到的熒光值計(jì)算出血樣中糖化血紅蛋白的濃度。以上所述的生物醫(yī)學(xué)軟件為Sigmaplot軟件，于市面上可以購買到。以上所述的一種用基于核酸適體熒光探針的糖化血紅蛋白試劑盒來檢測糖化血紅蛋白濃度的方法，其特征在于，所述糖化血紅蛋白核酸適體熒光探針試劑中糖化血紅蛋白核酸適體熒光探針濃度為200~400nmol/L，其特性還在于,所述糖化血紅蛋白核酸適體熒光探針為5'和3'兩端分別標(biāo)記熒光芘分子單體的核苷酸單鏈，該核苷酸單鏈序列為SEQIDNO:1~SEQIDNO:4中的任意一條DNA片段序列，其序列為：SEQIDNO:1：gggaggcatgtgtgctaaggcgtagcagggttggaaccc；SEQIDNO:2：gggaggcatgtgatttaaggcgcggcagatgttggaaccc；SEQIDNO:3：gggaggcatgagacctatggcgttgcattggttggaaccc；SEQIDNO:4：gggaggcatgggaaacaatgcgccgcagagttggaaccc；糖化血紅蛋白核酸適體熒光探針不與糖化血紅蛋白結(jié)合時(shí)，核酸適體處于比較松散的結(jié)構(gòu)，5'和3'兩端的芘分子單體相互游離,熒光激發(fā)后發(fā)射波長在370~400nm之間；糖化血紅蛋白核酸適體熒光探針與糖化血紅蛋白結(jié)合時(shí)，糖化血紅蛋白誘導(dǎo)其發(fā)生結(jié)構(gòu)改變，核酸適體5'和3'兩端的芘分子單體相互靠近，形成激發(fā)態(tài)二聚體，熒光激發(fā)后激發(fā)態(tài)二聚體發(fā)射波長在480到500nm之間。以上所述的一種用基于核酸適體熒光探針的糖化血紅蛋白試劑盒來檢測糖化血紅蛋白濃度的方法，其特征在于，所述的血樣為肝素抗凝全血或末梢血，所述含NH4Cl、Tris、EDTA-Na2的紅細(xì)胞裂解液為含有1~280mmol/LNH4Cl,1~34mmol/LTris,1~2mmol/LEDTA-Na2,pH7.0~7.2；所述含MgCl2...