本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種分離測(cè)定他扎羅汀倍他米松乳膏中兩種藥物含量及有關(guān)物質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
：他扎羅汀倍他米松乳膏為治療銀屑病的復(fù)方制劑，內(nèi)含他扎羅汀及二丙酸倍他米松，是由0.05％他扎羅汀和0.05％二丙酸倍他米松(以倍他米松計(jì))組成的全新復(fù)方制劑，主要用于治療尋常型銀屑病。他扎羅汀是第三代維a酸類(lèi)藥物，對(duì)尋常性斑塊型銀屑病有特效，他扎羅汀給藥后在體內(nèi)快速脫脂并轉(zhuǎn)化成活性成分他扎羅汀酸，選擇性地與維a酸受體結(jié)合，靶向作用于病變組織，調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、抗增殖、抗炎；二丙酸倍他米松是一種脂溶性、糖皮質(zhì)激素類(lèi)藥物；他扎羅汀與二丙酸倍他米松均為臨床上治療銀屑病的有效藥物，他扎羅汀與二丙酸倍他米松均為臨床上治療銀屑病的有效藥物，臨床研究結(jié)果表明該濃度下兩藥的協(xié)同作用增強(qiáng)，且能減輕糖皮質(zhì)激素引起的皮膚萎縮而不抑制其抗炎作用，同時(shí)可降低他扎羅汀的刺激性而不影響療效。在現(xiàn)臨床皮膚科領(lǐng)域，廣泛應(yīng)用他扎羅汀乳膏和二丙酸倍他米松乳膏乳兩藥聯(lián)用。他扎羅汀倍他米松乳膏是全新復(fù)方制劑，現(xiàn)有的方法是對(duì)他扎羅汀和二丙酸倍他米松兩種藥物分別進(jìn)行檢測(cè)。到目前為止，還沒(méi)有公開(kāi)的方法報(bào)道可有效對(duì)他扎羅汀倍他米松乳膏中兩種藥物及其有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行分離和定量測(cè)定。因此開(kāi)發(fā)一種同時(shí)分離測(cè)定他扎羅汀倍他米松乳膏兩種藥物含量及有關(guān)物質(zhì)的方法，對(duì)于實(shí)現(xiàn)他扎羅汀倍他米松乳膏的質(zhì)量控制、安全性保證具有極其重要的意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種分離測(cè)定他扎羅汀倍他米松乳膏中兩種藥物含量及有關(guān)物質(zhì)的方法，該方法屬于一種反相高效液相色譜法，可同時(shí)分離測(cè)定他扎羅汀倍他米松乳膏中兩種藥物含量及有關(guān)物質(zhì)，本發(fā)明的方法重復(fù)性好，檢查結(jié)果準(zhǔn)確可靠。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：用于固液分離測(cè)定他扎羅汀倍他米松乳膏中兩種藥物含量及有關(guān)物質(zhì)的試劑組合物，其特征在于，由以下試劑組成：試劑a：酸性水溶液體系；試劑b：乙腈；所述兩種藥物為他扎羅汀和二丙酸倍他米松；所述酸性水溶液體系由酸性添加劑，甲醇和水組成；甲醇和水的體積比為2-10：90-98；酸性添加劑的體積百分比為0.05％～0.15％。作為一種優(yōu)選，甲醇和水的體積比為5：95。作為一種優(yōu)選，酸性添加劑的體積百分比為0.1％。進(jìn)一步，所述酸性添加劑為三氟乙酸、冰醋酸中的一種或多種。作為一種優(yōu)選，所述酸性添加劑選用三氟乙酸。所述的他扎羅汀倍他米松乳膏中兩種藥物為他扎羅汀和二丙酸倍他米松，有關(guān)物質(zhì)包括：倍他米松，倍他米松17-丙酸酯，倍他米松21-丙酸酯、他扎羅汀亞砜、他扎羅汀砜、他扎羅汀酸。本發(fā)明的目的之二在于提供一種用所述試劑組合物分離測(cè)定他扎羅汀倍他米松乳膏中兩種藥物含量及有關(guān)物質(zhì)的方法，具體包括以下步驟：1)配制供試樣品溶液：取供試樣品溶于乙腈，得樣品溶液；2)配制流動(dòng)相：a配制所述試劑a得流動(dòng)相a；b所述試劑b做流動(dòng)相b；3)將步驟1)所述樣品溶液注入分離檢測(cè)系統(tǒng)中，用步驟2)所述流動(dòng)相對(duì)步驟1)所述樣品溶液進(jìn)行線(xiàn)性梯度洗脫得洗脫液；4)步驟3)所述洗脫液進(jìn)入檢測(cè)器測(cè)定。進(jìn)一步，步驟3)所述的他扎羅汀倍他米松乳膏中兩種藥物為他扎羅汀和二丙酸倍他米松，有關(guān)物質(zhì)包括：倍他米松，倍他米松17-丙酸酯，倍他米松21-丙酸酯、他扎羅汀亞砜、他扎羅汀砜、他扎羅汀酸。進(jìn)一步，步驟3)所述的線(xiàn)性梯度洗脫的程序如下表：作為一種優(yōu)選，步驟3)所述的線(xiàn)性梯度洗脫的程序如下表：進(jìn)一步，步驟3)所述的流動(dòng)相的流速為每分鐘0.9ml-1.1ml。作為一種優(yōu)選，步驟3)所述的流動(dòng)相的流速為每分鐘1.0ml。本發(fā)明的目的之三在于提供一種高效液相色譜法分離測(cè)定他扎羅汀倍他米松乳膏中兩種藥物含量及有關(guān)物質(zhì)的方法，具體包括以下步驟：1)配制空白溶液：取乙腈稀釋溶液作為空白溶液；2)配制供試樣品溶液：取供試樣品溶于乙腈，得樣品溶液；3)配制對(duì)照品溶液：取他扎羅汀對(duì)照品、二丙酸倍他米松對(duì)照品及各有關(guān)物質(zhì)對(duì)照品，用乙腈溶解稀釋制成對(duì)照品溶液；4)分別取步驟1)所述空白溶液、步驟2)所述供試樣品和步驟3)所 述對(duì)照品溶液進(jìn)樣，進(jìn)行高效液相色譜分析，記錄色譜圖，確定他扎羅汀倍他米松乳膏中兩種藥物及其有關(guān)物質(zhì)的保留時(shí)間，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算供試樣品溶液中他扎羅汀倍他米松乳膏兩種藥物含量及有關(guān)物質(zhì)。記錄的色譜圖按出峰順序依次為倍他米松、倍他米松17-丙酸酯、他扎羅汀亞砜、倍他米松21-丙酸酯、他扎羅汀砜、他扎羅汀酸、二丙酸倍他米松和他扎羅??；理論板數(shù)按他扎羅汀峰計(jì)算不低于50000、按二丙酸倍他米松峰計(jì)算不低于50000。檢測(cè)中溶劑峰不干擾他扎羅汀倍他米松乳膏中有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定，且他扎羅汀倍他米松乳膏中有關(guān)物質(zhì)均能有效分離，分離度大于2.0。進(jìn)一步，步驟4)所述高效液相色譜分析采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱，色譜柱柱箱溫度為20-35℃；以酸性水溶液體系和乙腈作為流動(dòng)相。進(jìn)一步，步驟4)所述檢測(cè)器的檢測(cè)波長(zhǎng)為240-260nm。作為一種優(yōu)選，步驟4)所述檢測(cè)器的檢測(cè)波長(zhǎng)為250nm。進(jìn)一步，所述色譜柱的規(guī)格為4.6×250mm，5μm。本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明的分離測(cè)定他扎羅汀倍他米松乳膏中有關(guān)物質(zhì)的方法屬于一種反相高效液相色譜法，可同時(shí)分離測(cè)定他扎羅汀倍他米松乳膏中的有關(guān)物質(zhì)，即能同時(shí)測(cè)定他扎羅汀和二丙酸倍他米松兩種藥物的含量，本發(fā)明的方法重復(fù)性好，檢測(cè)中溶劑峰不干擾他扎羅汀倍他米松乳膏兩種藥物含量及有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定，且他扎羅汀倍他米松乳膏中兩種藥物及其有關(guān)物質(zhì)均能有效分離，分離度大于2.0，檢查結(jié)果準(zhǔn)確可靠，對(duì)于實(shí)現(xiàn)他扎羅汀倍他米松乳膏的質(zhì)量控制具有重要的意義。附圖說(shuō)明圖1為他扎羅汀、二丙酸倍他米松及相關(guān)雜質(zhì)的混合溶液高效液相色譜圖。圖2為他扎羅汀酸倍他米松乳膏空白基質(zhì)高效液相色譜圖。圖3為他扎羅汀酸倍他米松乳膏樣品高效液相色譜圖。具體實(shí)施方式以下將參照附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)描述。優(yōu)選實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，所舉實(shí)施例是為了更好地對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容進(jìn)行說(shuō)明，但并不是本發(fā)明的內(nèi)容僅限于所舉實(shí)施例。所以熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)上述
發(fā)明內(nèi)容對(duì)實(shí)施方案進(jìn)行非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整，仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1分離測(cè)定他扎羅汀倍他米松乳膏中有關(guān)物質(zhì)的方法儀器：shimadzulc-20a(日本島津)色譜柱：vp-ods4.6×250mm5μm流動(dòng)相a：0.1％三氟乙酸溶液-甲醇(95：5)流動(dòng)相b：乙腈流速：1.0ml/min檢測(cè)器：uv檢測(cè)波長(zhǎng)：250nm進(jìn)樣體積：20μl色譜工作站：labsolution線(xiàn)性梯度洗脫程序：樣品配制：取本品約5g，精確加入乙腈25ml，置50℃水浴中加熱，攪拌使膏體融化分散均勻后，繼續(xù)攪拌2分鐘，取出，趁熱轉(zhuǎn)移至50ml具塞離心管中，置冰水浴中冷卻30分鐘以上，離心使分層，取上清液迅速濾過(guò)， 取續(xù)濾液，放至室溫，作為供試品溶液；分別精密稱(chēng)取倍他米松、倍他米松17-丙酸酯、倍他米松21-丙酸酯、他扎羅汀亞砜、他扎羅汀砜和他扎羅汀酸對(duì)照品適量，加乙腈溶解并稀釋制成每1ml中各約1μg的溶液，作為對(duì)照品溶液。實(shí)施例2分離測(cè)定他扎羅汀倍他米松乳膏中兩種藥物含量的方法儀器：shimadzulc-20a(日本島津)色譜柱：vp-ods4.6×250mm5μm流動(dòng)相a：0.1％三氟乙酸溶液-甲醇(95：5)流動(dòng)相b：乙腈流速：1.0ml/min檢測(cè)器：uv檢測(cè)波長(zhǎng)：250nm進(jìn)樣體積：20μl色譜工作站：labsolution線(xiàn)性梯度洗脫程序：樣品配制：取本品2.0g(約相當(dāng)于他扎羅汀1mg與倍他米松1mg)，精密稱(chēng)定，置50ml棕色量瓶中，加乙腈25ml，置50℃水浴中加熱，振搖使主藥溶解，放冷至室溫，并用乙腈稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取他扎羅汀對(duì)照品和二丙酸倍他米松對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，置棕色量瓶中，加乙腈溶解并定量稀釋制成每1ml中約含他扎羅汀20μg和倍他米松20μg的溶液，搖勻，同法測(cè)定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算(其中二丙酸倍他米松乘以0.7778折算為倍他米 松)，即得。實(shí)施例3樣品檢測(cè)結(jié)果按實(shí)施例1和實(shí)施例2方法，對(duì)多批次他扎羅汀倍他米松乳膏的有關(guān)物質(zhì)和含量進(jìn)行檢測(cè)。表8他扎羅汀倍他米松乳膏有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)結(jié)果批號(hào)倍他米松17-丙酸酯，％倍他米松21-丙酸酯，％他扎羅汀亞砜，％20100030.100.220.4420100040.130.240.4620100050.140.230.48201306010.070.350.25201306020.070.330.28201306030.070.260.25表9他扎羅汀倍他米松乳膏含量檢測(cè)結(jié)果批號(hào)二丙酸倍他米松(按倍他米松計(jì))，％他扎羅汀，％2010003100.5100.6201000499.9100.3201000597.999.92013060198.297.02013060297.896.62013060399.696.8實(shí)施例4方法學(xué)驗(yàn)證分離測(cè)定他扎羅汀倍他米松乳膏有關(guān)物質(zhì)1、系統(tǒng)適用性試驗(yàn)分別稱(chēng)取倍他米松、倍他米松17-丙酸酯、倍他米松21-丙酸酯、他扎羅汀亞砜、他扎羅汀砜、他扎羅汀酸、他扎羅汀和二丙酸倍他米松對(duì)照品適量，加乙腈溶解并稀釋制成每1ml中約含倍他米松1μg、倍他米松17-丙酸酯1μg、倍他米松17-丙酸酯1μg、他扎羅汀亞砜1μg、他扎羅汀砜1μg、他扎羅汀酸1μg、他扎羅汀100μg和二丙酸倍他米松100μg的混合溶液，照上述有關(guān)物質(zhì)方法(實(shí)施例1)進(jìn)樣20μl，記錄色譜圖(圖1)。試驗(yàn)結(jié)果：理論板數(shù)按他扎羅汀峰計(jì)算為147610、按二丙酸倍他米松峰計(jì)算為80699；他扎羅汀酸和二丙酸倍他米松的分離度為2.18。2、空白基質(zhì)干擾試驗(yàn)取他扎羅汀倍他米松乳膏和空白基質(zhì)各5g，照上述有關(guān)物質(zhì)方法處理 溶配后，進(jìn)樣20μl，并記錄色譜圖(圖2、圖3)。試驗(yàn)結(jié)果：空白基質(zhì)不干擾各相關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)。3、定量限用乙腈配制每1ml中約含倍他米松0.128μg、倍他米松17-丙酸酯0.128μg、倍他米松21-丙酸酯0.128μg、二丙酸倍他米松0.128μg、他扎羅汀亞砜0.1μg、他扎羅汀砜0.1μg、他扎羅汀酸0.1μg和他扎羅汀0.1μg的溶液(相當(dāng)于有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)供試品溶液濃度0.1％)，作為定量限溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，考察峰面積重復(fù)性及信噪比。表1檢測(cè)方法定量限試驗(yàn)結(jié)果：各組分在相當(dāng)于供試品溶液濃度0.1％時(shí)重復(fù)進(jìn)樣，峰面積rsd均小于2％，信噪比(s/n)均大于10，符合高效液相色譜法對(duì)有關(guān)物質(zhì)測(cè)定的要求。4、線(xiàn)性關(guān)系取倍他米松、倍他米松17-丙酸酯、倍他米松21-丙酸酯和二丙酸倍他米松12.85mg，精密稱(chēng)定，用乙腈溶解并稀釋成每1ml中約含0.064μg～2.57μg(相當(dāng)于供試品溶液濃度0.05％～2.0％)的溶液；取他扎羅汀亞砜、他扎羅汀砜、他扎羅汀酸和他扎羅汀10mg，精密稱(chēng)定，用乙腈溶解并稀釋成每1ml中約含0.05μg～2μg(相當(dāng)于供試品溶液濃度0.05％～2.0％)的溶 液，進(jìn)樣20μl，記錄色譜圖，量取峰面積進(jìn)行線(xiàn)性回歸。表2有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)方法線(xiàn)性關(guān)系組分名稱(chēng)線(xiàn)性方程相關(guān)系數(shù)倍他米松y＝349.36x+12.11r＝0.9999倍他米松17-丙酸酯y＝333.70x+33.80r＝1.0000倍他米松21-丙酸酯y＝352.82x–9.54r＝1.0000二丙酸倍他米松y＝320.93x+17.94r＝1.0000他扎羅汀亞砜y＝377.65x-20.53r＝1.0000他扎羅汀砜y＝406.19x+18.04r＝0.9999他扎羅汀酸y＝455.20x–43.73r＝0.9999他扎羅汀y＝486.73x–91.86r＝1.0000試驗(yàn)結(jié)果：各組分在相當(dāng)于供試品溶液濃度為0.05％～2.0％范圍內(nèi)，測(cè)定溶液濃度與峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，符合高效液相色譜法對(duì)有關(guān)物質(zhì)測(cè)定的要求。5、精密度按有關(guān)物質(zhì)方法配制9份樣本試驗(yàn)，有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)供試品溶液濃度80％，100％，120％各三個(gè)樣本。表3有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)方法精密度試驗(yàn)結(jié)果：各雜質(zhì)測(cè)試結(jié)果rsd小于3％，，符合高效液相色譜法對(duì)有關(guān)物質(zhì)測(cè)定的要求。6、回收試驗(yàn)用乙腈配制每1ml中約含倍他米松128μg、倍他米松17-丙酸酯128μg、倍他米松21-丙酸酯128μg、他扎羅汀亞砜100μg、他扎羅汀砜100μg和他扎羅汀酸100μg的混合溶液。精密量取混合液0.1ml、0.5ml、1.0ml置于5g樣品乳膏中(相當(dāng)于加入供試品溶液濃度0.1％，0.5％，1.0％)，攪拌均勻，每個(gè)濃度制備三個(gè)樣本，照有關(guān)物質(zhì)方法配制供試品溶液和對(duì)照品溶液。 扣除樣品本底后計(jì)算各雜質(zhì)回收率。表4有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)方法回收率試驗(yàn)結(jié)果：在相當(dāng)于0.1％～1.0％范圍內(nèi)，各雜質(zhì)的回收率均在為85％～115％，rsd均小于5％。表明該方法準(zhǔn)確度高，符合高效液相色譜法對(duì)有關(guān)物質(zhì)測(cè)定的要求。實(shí)施例5方法學(xué)驗(yàn)證分離測(cè)定他扎羅汀倍他米松乳膏兩種藥物的含量1、系統(tǒng)適用性試驗(yàn)分別稱(chēng)取倍他米松、倍他米松17-丙酸酯、倍他米松21-丙酸酯、他扎羅汀亞砜、他扎羅汀砜、他扎羅汀酸、他扎羅汀和二丙酸倍他米松對(duì)照品適量，加乙腈溶解并稀釋制成每1ml中約含倍他米松1μg、倍他米松17-丙酸酯1μg、倍他米松17-丙酸酯1μg、他扎羅汀亞砜1μg、他扎羅汀砜1μg、他扎羅汀酸1μg、他扎羅汀100μg和二丙酸倍他米松100μg的混合溶液，照上述有關(guān)物質(zhì)方法(實(shí)施例1)進(jìn)樣20μl，記錄色譜圖(圖1)。試驗(yàn)結(jié)果：理論板數(shù)按他扎羅汀峰計(jì)算為147610、按二丙酸倍他米松峰計(jì)算為80699；他扎羅汀酸和二丙酸倍他米松的分離度為2.18。2、空白基質(zhì)干擾試驗(yàn)取他扎羅汀倍他米松乳膏和空白基質(zhì)各5g，照上述有關(guān)物質(zhì)方法處理溶配后，進(jìn)樣20μl，并記錄色譜圖(圖2、圖3)。試驗(yàn)結(jié)果：空白基質(zhì)不干擾兩種藥物的檢測(cè)。3、定量限用乙腈配制每1ml中約含二丙酸倍他米松0.128μg和他扎羅汀0.1μg的 溶液(相當(dāng)于含量檢測(cè)供試品溶液濃度0.5％)，作為定量限溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，考察峰面積重復(fù)性及信噪比。表1檢測(cè)方法定量限試驗(yàn)結(jié)果：兩種藥物在相當(dāng)于含量檢測(cè)供試品溶液濃度0.5％時(shí)重復(fù)進(jìn)樣，峰面積rsd均小于1％，信噪比(s/n)均大于10，符合高效液相色譜法對(duì)含量測(cè)定的要求。4、線(xiàn)性關(guān)系精密稱(chēng)取二丙酸倍他米松對(duì)照品約32mg(相當(dāng)于倍他米松25mg)，他扎羅汀對(duì)照品約25mg，置200ml容量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，作為貯備液，精密量取貯備液各2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml，分別置25ml量瓶中，用乙腈稀釋至刻度(相當(dāng)于含量供試品濃度50％～150％)，搖勻，依次取20μl進(jìn)樣，分別記錄峰面積，并進(jìn)行線(xiàn)性回歸。表5含量檢測(cè)方法線(xiàn)性關(guān)系組分名稱(chēng)線(xiàn)性方程相關(guān)系數(shù)二丙酸倍他米松y＝36702x+4048.0r＝0.99999他扎羅汀y＝49333x+2330.2r＝0.99999試驗(yàn)結(jié)果：各組分在相當(dāng)于含量檢測(cè)供試品溶液濃度50％～150％范圍內(nèi)，測(cè)定溶液濃度與峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。5、精密度按含量方法配制9份樣本試驗(yàn)，含量檢測(cè)供試品溶液濃度80％，100％，120％各三個(gè)樣本。表6含量檢測(cè)方法精密度試驗(yàn)結(jié)果：各組分測(cè)試結(jié)果rsd均小于2％，符合高效液相色譜法對(duì)含量測(cè)定的要求。6、回收試驗(yàn)用乙腈配制每1ml中約含二丙酸倍他米松0.25mg(相當(dāng)于倍他米松0.2mg)和他扎羅汀0.2mg的混合溶液。精密量取4.0ml，5.0ml，6.0ml各3份，分別加入2g空白基質(zhì)中，攪拌均勻，照含量方法制備成供試品溶液，依法測(cè)定各份的含量，計(jì)算回收率。表7含量檢測(cè)方法回收率試驗(yàn)結(jié)果：本品在相當(dāng)于80％～120％范圍內(nèi)，測(cè)得二丙酸倍他米松的平均回收率為100.5％，rsd為0.63％；他扎羅汀的平均回收率為100.6％，rsd為0.64％。表明該方法準(zhǔn)確度好，符合高效液相色譜法對(duì)含量測(cè)定的要求。最后說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的宗旨和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。當(dāng)前第1頁(yè)12