本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種治療腰膝酸痛、坐骨神經(jīng)痛的中藥組合物的檢測(cè)方法，所述的中藥組合物是舒筋健腰丸。

背景技術(shù)：

舒筋健腰丸收載于《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第十二冊(cè)，標(biāo)準(zhǔn)號(hào)為ws3-b-2441-97。舒筋健腰丸由狗脊、金櫻子、雞血藤、千斤拔、黑老虎、牛大力、女貞子、桑寄生、菟絲子、延胡索、兩面針、乳香、沒(méi)藥等十三味藥制成，具有補(bǔ)益肝腎，強(qiáng)健筋骨，驅(qū)風(fēng)除濕，活絡(luò)止痛的作用，用于治療腰膝酸痛、坐骨神經(jīng)痛。

在現(xiàn)行藥品標(biāo)準(zhǔn)中，對(duì)本品進(jìn)行了顯微鑒別，理化鑒別以及狗脊和沒(méi)藥的薄層色譜鑒別。其中理化鑒別采用生物堿沉淀反應(yīng)，只能說(shuō)明制劑中含有生物堿這一類成分，沒(méi)有專屬性。狗脊的薄層鑒別色譜特征圖譜分離不好，特征點(diǎn)不清晰。本品種現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)沒(méi)有指標(biāo)成分的含量測(cè)定。

因此，有必要制定出更有針對(duì)性、更能反映舒筋健腰丸質(zhì)量的檢測(cè)方法，從而提升其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，更好地保障患者用藥安全。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種舒筋健腰丸的檢測(cè)方法。該檢測(cè)方法包括了對(duì)黑老虎中(2′s)-南五味子木質(zhì)素j(c27h34o8)的含量測(cè)定和女貞子中特女貞苷(c31h42o17)的含量測(cè)定，還包括狗脊、黑老虎和桑寄生的薄層色譜鑒別。相較現(xiàn)行的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本發(fā)明提供的檢測(cè)方法對(duì)藥品特征成分的監(jiān)測(cè)更全面：現(xiàn)有技術(shù)中的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅有沒(méi)藥和狗脊兩味藥的薄層鑒別，本發(fā)明的檢測(cè)方法不僅優(yōu)化了狗脊薄層色譜鑒別方法，而且增加了定量檢測(cè)黑老虎和女貞子的特征成分，以及定性鑒別黑老虎、桑寄生的方法，從而對(duì)原料藥的檢測(cè)數(shù)量達(dá)到了5味。本發(fā)明的檢測(cè)方法專屬性強(qiáng)，重現(xiàn)性良好，有利于實(shí)現(xiàn)對(duì)舒筋健腰丸成品質(zhì)量的有效控制。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用了如下的技術(shù)方案。

一種治療腰膝酸痛、坐骨神經(jīng)痛的中藥組合物的檢測(cè)方法，所述中藥組合物的原料包括狗脊、金櫻子、雞血藤、千斤拔、黑老虎、牛大力、女貞子、桑寄生、菟絲子、延胡索、兩面針、乳香和沒(méi)藥；所述檢測(cè)方法包括采用高效液相色譜法測(cè)定黑老虎中(2′s)-南五味子木質(zhì)素j的含量。

優(yōu)選的，所述高效液相色譜法測(cè)定黑老虎中(2′s)-南五味子木質(zhì)素j的含量的色譜條件如下：

填充劑：十八烷基硅烷鍵合硅膠；

柱溫：30℃；

檢測(cè)波長(zhǎng)：214nm；

流動(dòng)相：體積比為60～80:20～40的乙腈-水，或體積比為60～90:10～40的甲醇-水；更優(yōu)選為體積比為70:30的乙腈-水；

流速：1ml/min；

理論板數(shù)按(2′s)-南五味子木質(zhì)素j峰計(jì)算應(yīng)不低于2500。

上述高效液相色譜法測(cè)定黑老虎中(2′s)-南五味子木質(zhì)素j的含量的具體操作步驟為：

1)對(duì)照品溶液的制備：取(2′s)-南五味子木質(zhì)素j對(duì)照品，精密稱定，加乙醇制成每1ml含(2′s)-南五味子木質(zhì)素j6～30μg的溶液，即得；

2)供試品溶液的制備：取所述中藥組合物，研細(xì)，取2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入95％乙醇50ml，稱定重量，功率250w、頻率40khz超聲處理45分鐘，放冷，再稱定重量，用95％乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得；

3)測(cè)定：分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。

優(yōu)選的，上述檢測(cè)方法還可以包括高效液相色譜法測(cè)定女貞子中特女貞苷的含量。

優(yōu)選的，所述高效液相色譜法測(cè)定女貞子中特女貞苷的色譜條件如下：

填充劑：十八烷基硅烷鍵合硅膠；

柱溫：30℃；

檢測(cè)波長(zhǎng)：224nm；

流動(dòng)相：體積比為10～30:90～70的乙腈-水，或體積比為20～45:80～55的甲醇-水；更優(yōu)選為體積比為17:83的乙腈-水；

理論板數(shù)按特女貞苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2500。

上述高效液相色譜法測(cè)定女貞子中特女貞苷的含量的具體操作步驟為：

1)對(duì)照品溶液的制備：取特女貞苷對(duì)照品，精密稱定，加體積百分比濃度為80％的甲醇水溶液制成每1ml含20～80μg的溶液，即得；

2)供試品溶液的制備：取所述中藥組合物，研細(xì)，取5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入體積百分比濃度為80％的甲醇水溶液50ml，稱定重量，超聲處理(功率250w、頻率40khz)30分鐘，放冷，再稱定重量，用體積百分比濃度為80％的甲醇水溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)；取續(xù)濾液20ml，蒸干，殘?jiān)皿w積百分比濃度為80％的甲醇水溶液5ml使溶解，加在中性氧化鋁柱上，用80％甲醇50～100ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)芋w積百分比濃度為80％的甲醇水溶液使溶解并定容至10ml，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得；其中所述中性氧化鋁柱內(nèi)徑1.5cm，內(nèi)裝5g100～200目中性氧化鋁；

3)測(cè)定法：分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。

上述高效液相色譜法測(cè)定女貞子中特女貞苷的含量的操作步驟中，所述供試品溶液還可以通過(guò)如下方法制備：

取所述中藥組合物，研細(xì)，取2.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入體積百分比濃度為70％的甲醇水溶液50ml，密塞，稱定重量，功率250w、頻率40khz超聲處理45分鐘，放冷，再稱定重量，用體積百分比濃度為70％的甲醇水溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)；精密量取續(xù)濾液20ml，置蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，殘?jiān)眉状既芙猓c3g100～200目硅膠攪拌均勻，蒸干，干法上硅膠柱(柱層析用，100～200目,5g)，先用1,2-二氯乙烷50ml洗脫，棄去洗脫液，繼用體積比為3:1的1，2-二氯乙烷-甲醇混合溶劑80ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)皿w積百分比濃度為70％的甲醇水溶液溶解并定容至5ml，即得。

優(yōu)選的，上述檢測(cè)方法還可以包括薄層色譜法檢測(cè)黑老虎。

優(yōu)選的，所述薄層色譜法檢測(cè)黑老虎的色譜條件如下：

采用硅膠g薄層板，以體積比為5:1:0.2的甲苯-丙酮-甲酸混合溶劑為展開(kāi)劑，預(yù)飽和10分鐘；以10％硫酸乙醇溶液為顯色劑，紫外光燈365nm下檢視。

優(yōu)選的，上述薄層色譜法檢測(cè)黑老虎的操作步驟為：

1)供試品溶液制備：取所述中藥組合物4g，研細(xì)，置具塞錐形瓶中，加水10ml潤(rùn)濕，再加醋酸乙酯50ml，超聲處理30分鐘，冷卻，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状?ml使溶解，即得；

2)對(duì)照藥材溶液的制備：取黑老虎對(duì)照藥材2g，粉碎，置具塞錐形瓶中，加水10ml潤(rùn)濕，再加醋酸乙酯50ml，超聲處理30分鐘，冷卻，濾過(guò)， 濾液蒸干，殘?jiān)蛹状?ml使溶解，即得；

3)檢測(cè)：吸取上述兩種溶液各2μl，分別點(diǎn)于同一硅膠g薄層板上，以體積比為5:1:0.2的甲苯-丙酮-甲酸為展開(kāi)劑，預(yù)飽和10分鐘，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置紫外光燈365nm下檢視，供試品色譜中，是否在與黑老虎對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的墨綠色斑點(diǎn)。

優(yōu)選的，上述檢測(cè)方法還可以包括薄層色譜法檢測(cè)狗脊。

優(yōu)選的，所述薄層色譜法檢測(cè)狗脊的色譜條件如下：

采用硅膠g薄層板，以體積比為5:1:0.2的甲苯-丙酮-甲酸混合溶劑為展開(kāi)劑，紫外光燈365nm下檢視。

上述薄層色譜法檢測(cè)狗脊的操作步驟為：

1)供試品溶液制備：取所述中藥組合物3.5g，研細(xì)，加入鹽酸乙醇溶液50ml，超聲30分鐘，濾液蒸干，用5ml甲醇超聲使溶解，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得；其中，所述鹽酸乙醇溶液的配制方法為：取1.35ml分析純的濃鹽酸用95％乙醇稀釋至100ml；

2)對(duì)照藥材溶液的制備：取狗脊對(duì)照藥材2g，粉碎，加入所述鹽酸乙醇溶液50ml，超聲30分鐘，濾液蒸干，用5ml甲醇超聲使溶解，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得；

3)檢測(cè)：吸取上述兩種溶液各4μl，分別點(diǎn)于同一硅膠g薄層板上，以體積比為5:1:0.2的甲苯-丙酮-甲酸為展開(kāi)劑，預(yù)飽和10分鐘，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈365nm下檢視，供試品色譜中，是否在與狗脊對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。

優(yōu)選的，上述檢測(cè)方法還可以包括薄層色譜法檢測(cè)桑寄生。

優(yōu)選的，所述薄層色譜法檢測(cè)桑寄生的色譜條件如下：

采用硅膠g薄層板，以體積比8:2:0.5的三氯甲烷-甲醇-甲酸混合溶劑為展開(kāi)劑，以5％三氯化鋁乙醇溶液為顯色劑，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置紫外光燈365nm下檢視。

上述薄層色譜法檢測(cè)桑寄生的具體操作步驟為：

1)供試品溶液制備：取本發(fā)明所述中藥組合物10g，研細(xì)，加水5ml使?jié)櫇?，再加乙酸乙?0ml，浸泡過(guò)夜，超聲處理30分鐘，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状?.5ml使溶解，即得；

2)對(duì)照藥材溶液制備：取桑寄生對(duì)照藥材1g，加水2ml使?jié)櫇瘢偌右宜嵋阴?0ml，浸泡過(guò)夜，超聲處理30分鐘，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状?.5ml使溶解，即得；

3)檢測(cè)：吸取上述兩種溶液各8μl，分別點(diǎn)于同一硅膠g薄層板上， 以體積比8:2:0.5的三氯甲烷-甲醇-甲酸混合溶劑為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以5％三氯化鋁乙醇溶液，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置紫外光燈365nm下檢視；供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的綠色熒光斑點(diǎn)。

本發(fā)明的所述檢測(cè)方法中的各檢測(cè)項(xiàng)并不需要按照固定的順序進(jìn)行。

上述治療腰膝酸痛、坐骨神經(jīng)痛的中藥組合物，除所述原料藥外，還可以包括藥學(xué)上可以接受的輔料，制成臨床上可以接受的制劑。

所述藥學(xué)上可以接受的輔料可以選自煉蜜、水、淀粉、糊精、預(yù)膠化淀粉、乳糖、微晶纖維素、硫酸鈣、磷酸氫鈣、碳酸鈣、氧化鎂、碳酸鎂、氫氧化鋁凝膠、β-環(huán)糊精、甘露醇、山梨醇、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、羥甲基纖維素鈉、羧甲基淀粉鈉、低取代羥丙基纖維素、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇和十二烷基硫酸鈉中的一種或多種。

所述臨床上可以接受的制劑選自丸劑、片劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑或口服液。優(yōu)選的，所述制劑為上述治療腰膝酸痛、坐骨神經(jīng)痛的中藥組合物為濃縮水蜜丸。

作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，本發(fā)明所述治療腰膝酸痛、坐骨神經(jīng)痛的中藥組合物為舒筋健腰丸，原料藥組成為：

狗脊600重量份，金櫻子192重量份，雞血藤360重量份，千斤拔144重量份，黑老虎360重量份，牛大力240重量份，蒸女貞子30重量份，蒸桑寄生180重量份，鹽制菟絲子30重量份，制延胡索26重量份，兩面針26重量份，制乳香12重量份，制沒(méi)藥20重量份；

通過(guò)如下方法制備：

以上十三味，狗脊、金櫻子、雞血藤、千斤拔、黑老虎的木部加水煎煮二次，濾過(guò)，合并濾液，濃縮成稠膏；其余牛大力、蒸女貞子、蒸桑寄生、鹽制菟絲子、制延胡索、兩面針、制乳香、制沒(méi)藥及黑老虎的皮部共粉碎成粗粉，加入上述稠膏，混勻，干燥，粉碎成細(xì)粉，過(guò)篩，混勻；每100g粉末用煉蜜35～40g與水泛丸，用黑氧化鐵包衣，干燥，打光，即得。

對(duì)于上述舒筋健腰丸，在進(jìn)行上述各項(xiàng)檢測(cè)的同時(shí)，還可以進(jìn)行常規(guī)檢測(cè)，如形狀的觀察和顯微鑒別，即：取舒筋健腰丸成品，置顯微鏡下觀察，應(yīng)見(jiàn)：嵌晶纖維近無(wú)色，直徑30～50μm，壁極厚，胞腔淺形或不明顯，纖維壁外層密嵌細(xì)小草酸鈣方晶；石細(xì)胞近無(wú)色，類方形，直徑14～76μm，大多三面壁厚，胞腔靠一側(cè)，常含草酸鈣方晶或棕色團(tuán)塊狀物。

上述舒筋健腰丸還應(yīng)符合中國(guó)藥典丸劑項(xiàng)下有關(guān)的各項(xiàng)規(guī)定。

現(xiàn)有技術(shù)中，舒筋健腰丸的檢測(cè)方法全部為定性檢測(cè)，包括常規(guī)的顯微鑒別、碘化鉍鉀定性鑒別生物堿的反應(yīng)、以及薄層色譜法檢測(cè)狗脊和沒(méi)藥。 碘化鉍鉀鑒別反應(yīng)結(jié)果假陽(yáng)性或假陰性幾率大；即使不受干擾，其結(jié)果并不能給出生物堿來(lái)源的任何信息，即無(wú)法直接反映本發(fā)明所述中藥組合物原料藥的組成和質(zhì)量。薄層色譜法檢測(cè)狗脊時(shí)，還存在供試品色譜中的斑點(diǎn)不清楚的問(wèn)題。與現(xiàn)有技術(shù)相較，本發(fā)明具有如下有益技術(shù)效果：

1.本發(fā)明的檢測(cè)方法增加了對(duì)主要原料藥——黑老虎和女貞子特征成分的定量檢測(cè)，能更加有效控制產(chǎn)品質(zhì)量。試驗(yàn)過(guò)程可操作性強(qiáng)，經(jīng)過(guò)方法學(xué)考察證明本法靈敏度高，重復(fù)性好，回收率良好，可以作為控制所述中藥組合物內(nèi)在質(zhì)量的方法之一。

2.從供試品溶液制備、薄層色譜展開(kāi)劑、顯色方法和顯色劑等方面改進(jìn)了狗脊的薄層色譜檢測(cè)方法，供試品色譜中的斑點(diǎn)更清楚、顯色方法更簡(jiǎn)單。通過(guò)上述改進(jìn)，提高了結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3.增加了桑寄生和黑老虎的薄層色譜鑒別，使定性、定量檢測(cè)的原料藥總數(shù)達(dá)到5種，占原料藥總數(shù)的三分之一，從而更有效地保證藥品質(zhì)量，滿足醫(yī)療需求。

附圖說(shuō)明

以下，結(jié)合附圖來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方案，其中：

圖1顯示的是實(shí)施例1中的薄層色譜照片，其中：1是批號(hào)ax7721的舒筋健腰丸，2是批號(hào)ax7771的舒筋健腰丸，3是批號(hào)vo6013的舒筋健腰丸，4是狗脊對(duì)照藥材，5是陰性樣品。

圖2顯示的是對(duì)比例1中的薄層色譜照片，其中：1是批號(hào)ax7721的舒筋健腰丸，2是批號(hào)ax7771的舒筋健腰丸，3是批號(hào)vo6013的舒筋健腰丸，4是狗脊對(duì)照藥材，5是陰性樣品。

圖3顯示的是實(shí)施例2中的薄層色譜照片，其中：1是批號(hào)ax7721的舒筋健腰丸，2是批號(hào)ax7771的舒筋健腰丸，3是批號(hào)vo6013的舒筋健腰丸，4是黑老虎對(duì)照藥材，5是陰性樣品。

圖4顯示的實(shí)施例4中的薄層色譜照片，其中：1是批號(hào)ax7721的舒筋健腰丸，2是批號(hào)ax7771的舒筋健腰丸，3是桑寄生對(duì)照藥材，4是批號(hào)vo6013的舒筋健腰丸，5是陰性樣品。

圖5顯示的是實(shí)施例5中提取溶劑考察試驗(yàn)的高效液相色譜圖，其中：圖5a以甲醇為提取溶劑，圖5b以乙醇為提取溶劑，圖5c以70％乙醇為提取溶劑，圖中標(biāo)注1的吸收峰為(2′s)-南五味子木質(zhì)素j的吸收峰。各圖的橫坐標(biāo)表示時(shí)間，單位為min，縱坐標(biāo)表示電信號(hào)，單位mau。

圖6顯示的是實(shí)施例5中黑老虎陰性樣品的高效液相色譜圖。圖中橫 坐標(biāo)表示時(shí)間，單位為min，縱坐標(biāo)表示電信號(hào)，單位mau。

圖7顯示的是實(shí)施例5中(2′s)-南五味子木質(zhì)素j對(duì)照品的高效液相色譜圖；圖中標(biāo)注1的吸收峰為(2′s)-南五味子木質(zhì)素j的吸收峰。圖中橫坐標(biāo)表示時(shí)間，單位為min，縱坐標(biāo)表示電信號(hào)，單位mau。

圖8顯示的是實(shí)施例5批號(hào)fu4901的舒筋健腰丸的高效液相色譜圖，圖中標(biāo)注1的吸收峰為(2′s)-南五味子木質(zhì)素j的吸收峰。圖中橫坐標(biāo)表示時(shí)間，單位為min，縱坐標(biāo)表示電信號(hào)，單位mau。

圖9顯示的是實(shí)施例8中女貞子陰性樣品的高效液相色譜圖。圖中橫坐標(biāo)表示時(shí)間，單位為min，縱坐標(biāo)表示電信號(hào)，單位mau。

圖10顯示的是實(shí)施例8中特女貞苷對(duì)照品的高效液相色譜圖；圖中標(biāo)注2的吸收峰為特女貞苷的吸收峰。圖中橫坐標(biāo)表示時(shí)間，單位為min，縱坐標(biāo)表示電信號(hào)，單位mau。

圖11顯示的是實(shí)施例8中批號(hào)fu4901的舒筋健腰丸的高效液相色譜圖；圖中標(biāo)注2的吸收峰為特女貞苷的吸收峰。圖中橫坐標(biāo)表示時(shí)間，單位為min，縱坐標(biāo)表示電信號(hào)，單位mau。

具體實(shí)施方式

以下參照具體的實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，其不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。

下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的藥材原料、試劑材料等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為市售購(gòu)買產(chǎn)品。

其中，所用的供試品都是廣州白云山陳李濟(jì)藥廠有限公司生產(chǎn)的舒筋健腰丸(在以下各實(shí)施例中均簡(jiǎn)稱“本品”)，其為黑色的包衣濃縮水蜜丸，除去包衣后顯黑褐色；味甘、澀、微苦。原料藥處方為：

狗脊600g，金櫻子192g，雞血藤360g，千斤拔144g，黑老虎360g，牛大力240g，蒸女貞子30g，蒸桑寄生180g，鹽制菟絲子30g，制延胡索26g，兩面針26g，制乳香12g，制沒(méi)藥20g；

通過(guò)如下方法制備：

以上十三味，狗脊、金櫻子、雞血藤、千斤拔、黑老虎的木部加水煎煮二次，濾過(guò)，合并濾液，濃縮成稠膏；其余牛大力、蒸女貞子、蒸桑寄生、鹽制菟絲子、制延胡索、兩面針、制乳香、制沒(méi)藥及黑老虎的皮部共粉碎成粗粉，加入上述稠膏，混勻，干燥，粉碎成細(xì)粉，過(guò)篩，混勻；每100g粉末用煉蜜35～40g與適量水泛丸，用黑氧化鐵包衣，干燥，打光，即得。

另外，按照上述舒筋健腰丸的原料藥處方及制備方法，分別制備不含狗脊的陰性樣品，不含黑老虎的陰性樣品，不含桑寄生的陰性樣品和不含女貞 子的陰性樣品。

實(shí)施例1薄層色譜法檢測(cè)狗脊

1)供試品溶液的制備：分別取批號(hào)為ax7721、ax7771和vo6013的本品3.5g，研細(xì)，加入鹽酸乙醇溶液(1.35→100)50ml，超聲30分鐘，濾液蒸干，用5ml甲醇超聲使溶解，過(guò)濾，作為供試品溶液。

2)對(duì)照藥材溶液的制備：取狗脊對(duì)照藥材2g，按照步驟1相同的方法制成對(duì)照藥材溶液。

3)陰性樣品溶液的制備：取不含狗脊的陰性樣品，按照供試品溶液相同的步驟和方法制備得到陰性樣品溶液。

4)檢測(cè)：照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄vib)試驗(yàn)，吸取上述各種溶液各4μl，分別點(diǎn)于同一硅膠g預(yù)制薄層板上，以甲苯-丙酮-甲酸(5:1:0.2)為展開(kāi)劑，預(yù)飽和10分鐘，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。見(jiàn)附圖1。

對(duì)比例1薄層色譜法檢測(cè)狗脊

1)供試品溶液的制備：分別取批號(hào)為ax7721、ax7771和vo6013的本品15g，研細(xì)，加入乙醚50ml，浸漬并時(shí)時(shí)振搖約一小時(shí)，濾過(guò)，濾液揮去乙醚，殘?jiān)靡颐?ml溶解，作為供試品溶液。

2)對(duì)照藥材溶液的制備：取狗脊對(duì)照藥材5g，按照步驟1相同的方法制成對(duì)照藥材溶液。

3)陰性樣品溶液的制備：取不含狗脊的陰性樣品，按照供試品溶液相同的步驟和方法制備得到陰性樣品溶液。

4)檢測(cè)：照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄vib)試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各10μl，分別點(diǎn)于同一硅膠g薄層板上，以氯仿-醋酸乙酯-甲酸(8:2:0.1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以5％三氯化鐵的0.5mol/l鹽酸溶液(必要時(shí)加熱使顯色)。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的墨綠色斑點(diǎn)。見(jiàn)附圖2。

與圖1比較，圖2中供試品色譜斑點(diǎn)不太清晰。說(shuō)明本發(fā)明對(duì)狗脊薄層色譜檢測(cè)方法改進(jìn)后，供試品色譜斑點(diǎn)清晰，結(jié)果更顯著。

實(shí)施例2薄層色譜法檢測(cè)黑老虎

1)供試品溶液的制備：分別取批號(hào)為ax7721、ax7771和vo6013的本品4g，研細(xì)，置具塞錐形瓶中，加水10ml潤(rùn)濕，再加醋酸乙酯50ml，超 聲處理30分鐘，冷卻，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状?ml使溶解，作為供試品溶液。

2)對(duì)照藥材溶液的制備：取黑老虎對(duì)照藥材2g,按照步驟1相同的方法制成對(duì)照藥材溶液。

3)陰性樣品溶液的制備：取不含黑老虎的陰性樣品，按照供試品溶液相同的步驟和方法制備得到陰性樣品溶液。

4)檢測(cè)：照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄vib)試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各2μl，分別點(diǎn)于同一硅膠g預(yù)制薄層板上，以甲苯-丙酮-甲酸(5:1:0.2)為展開(kāi)劑，預(yù)飽和10分鐘，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。見(jiàn)附圖3。

實(shí)施例3薄層色譜法檢測(cè)桑寄生

1)供試品溶液的制備：分別取批號(hào)為ax7721、ax7771和vo6013的本品10g，研細(xì)，加水5ml使?jié)櫇?，再加乙酸乙?0ml，浸泡過(guò)夜，超聲處理30分鐘，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状?.5ml使溶解，作為供試品溶液。

2)對(duì)照藥材溶液的制備：取桑寄生對(duì)照藥材1g，加水2ml使?jié)櫇?，再加乙酸乙?0ml，按照步驟1相同的方法制成對(duì)照藥材溶液。

3)陰性樣品溶液的制備：取不含桑寄生的陰性樣品，按照供試品溶液相同的步驟和方法制備得到陰性樣品溶液。

4)檢測(cè)：照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄vib)試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各8μl，分別點(diǎn)于同一硅膠g預(yù)制薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-甲酸(8:2:0.5)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以5％三氯化鋁乙醇溶液，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的綠色熒光斑點(diǎn)。見(jiàn)附圖4。

實(shí)施例4高效液相色譜法測(cè)定黑老虎中(2′s)-南五味子木質(zhì)素j的含量

色譜條件:

waters2695型高效液相色譜儀；waters2487dualλabsorbancedetector；

色譜柱：agilentzorbaxeclipsexdb-c18,5μm,4.6×250mm；

柱溫：30℃；

檢測(cè)波長(zhǎng)：214nm；

流動(dòng)相：乙腈-水(70:30)；

流速：1ml/min；

理論板數(shù)按(2′s)-南五味子木質(zhì)素j峰計(jì)算應(yīng)不低于2500。

具體操作步驟為：

1)對(duì)照品溶液的制備：取(2′s)-南五味子木質(zhì)素j對(duì)照品(純度為98.7％)適量，精密稱定，加乙醇制成每1ml含(2′s)-南五味子木質(zhì)素j9.45μg的溶液，即得。

2)供試品溶液的制備：取本品適量，研細(xì)，取約2.0g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入乙醇50ml，稱定重量，超聲處理(功率250w，頻率40khz)45分鐘，放冷，再稱定重量，用乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

3)測(cè)定法：照高效液相法(《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄ⅵd)，分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。

本品每1g含黑老虎以(2′s)-南五味子木質(zhì)素j計(jì)，不得少于0.25mg。

實(shí)施例5高效液相法測(cè)定黑老虎中(2′s)-南五味子木質(zhì)素j含量的方法學(xué)考察

所用儀器為waters2695型高效液相色譜儀；waters2487dualλabsorbancedetector；agilent1200型高效液相色譜儀；sb-5200dtd超聲波處理器(寧波新芝生物科技股份有限公司)；紫外光譜儀:uv-2450(shimadzu)。

1.色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

1.1流動(dòng)相的選擇

考察了不同比例的甲醇-水和乙腈-水系統(tǒng)，結(jié)果以乙腈-水(70:30)為流動(dòng)相，供試品中(2′s)-南五味子木質(zhì)素j峰達(dá)到基線分離，峰形對(duì)稱，保留時(shí)間適中(約18分鐘)，理論板數(shù)為5482，因此，選用乙腈-水(70:30)為流動(dòng)相。

1.2測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

取(2′s)-南五味子木質(zhì)素j對(duì)照品的乙醇溶液(0.05mg/ml)，在紫外分光光度計(jì)200～380nm波長(zhǎng)間掃描。結(jié)果，在214nm波長(zhǎng)處有最大吸收，故選擇214nm為本品的測(cè)定波長(zhǎng)。

1.3色譜柱

agilentzorbaxeclipsexdb-c18,5μm,4.6×250mm色譜柱。

2.色譜條件的考察

2.1提取溶劑的考察

考察五種溶劑的提取效果，分別是甲醇、95％乙醇、70％乙醇(其中的濃度都是體積百分比濃度)。

取同一批號(hào)的舒筋健腰丸(批號(hào):fa1071)粉末分別稱取3份，每份2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入溶劑50ml，密塞，稱定重量，超聲處理45分鐘，放冷，再稱定重量，用溶劑補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

取上述供試品溶液，分別按含量測(cè)定方法測(cè)定(2′s)-南五味子木質(zhì)素j的含量。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1，圖譜見(jiàn)附圖5a～5c。

表1不同提取溶劑的試驗(yàn)結(jié)果(n＝2)

上述不同溶劑的提取效果基本相當(dāng)，結(jié)合附圖可以看出用95％乙醇提取雜質(zhì)峰峰高相對(duì)較小。因此，選用95％乙醇作為提取溶劑。

2.2提取方法的選擇

同一批號(hào)的舒筋健腰丸(批號(hào):fa1071)粉末分別稱取2份，每份2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入95％乙醇50ml，密塞，稱定重量，其中1份回流提取2小時(shí)，另外1份超聲提取45分鐘,放冷，再稱定重量，用95％乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

取上述供試品溶液，分別按含量測(cè)定方法測(cè)定(2′s)-南五味子木質(zhì)素j的含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2不同提取方法的試驗(yàn)結(jié)果(n＝2)

結(jié)果顯示，超聲提取和回流提取效果相似，但超聲提取操作更方便，因此，選擇超聲提取。

2.3超聲提取時(shí)間的選擇

同一批號(hào)的舒筋健腰丸(批號(hào):fa1071)粉末分別稱取3份，每份2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入95％乙醇50ml，密塞，稱定重量，超聲時(shí)間分別為30分鐘、45分鐘、60分鐘，放冷，再稱定重量，用95％乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

取上述供試品溶液，分別按含量測(cè)定方法測(cè)定(2′s)-南五味子木質(zhì)素j的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3不同提取時(shí)間的試驗(yàn)結(jié)果(n＝2)

結(jié)果表明超聲提取45分鐘的提取效果最好，長(zhǎng)時(shí)間超聲并不能提高檢測(cè)成分的提取率。因此優(yōu)選超聲時(shí)間為45分鐘。

2.4不同規(guī)格色譜柱的比較

取同一對(duì)照品溶液、供試品溶液，按含量測(cè)定方法操作，比較watersatlantist35μm4.6×250mm色譜柱(a)、agilentzorbaxeclipsexdb-c18(250×4.6mm,5μm)色譜柱(b)和phenomenexlunac18(250×4.6mm,5μm)色譜柱(c)測(cè)定得到的(2′s)-南五味子木質(zhì)素j含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4不同色譜柱的考察(n＝2)

試驗(yàn)表明，使用不同生廠商的色譜柱進(jìn)行分析，色譜峰都能達(dá)到基線分離，峰形對(duì)稱，測(cè)定結(jié)果沒(méi)有顯著性差別。因此，本方法對(duì)色譜柱的依賴性小，適用性好。十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱都可以用于本方法。(下面的各項(xiàng)方法學(xué)試驗(yàn)及含量測(cè)定，都采用agilentzorbaxeclipsexdb-c18(250×4.6mm,5μm)色譜柱。)

3.方法學(xué)驗(yàn)證

3.1專屬性:

陰性對(duì)照品溶液的制備：取不含黑老虎的陰性樣品2g，按實(shí)施例5的步驟2制備成陰性對(duì)照品溶液。

精密吸取陰性對(duì)照品溶液10μl，注入液相色譜儀，按含量測(cè)定方法測(cè)定。結(jié)果未見(jiàn)陰性對(duì)照品溶液對(duì)試驗(yàn)有干擾。見(jiàn)附圖6。

3.2線性考察

精密量取(2′s)-南五味子木質(zhì)素j對(duì)照品溶液(47.12μg/ml)1、2、4、6、8、10ml,置10ml量瓶中，加乙醇至刻度，搖勻，即得每1ml含4.712、9.424、18.848、28.272、37.696、47.12μg的梯度溶液。分別精密吸取10μl，注入液相色譜儀，按含量測(cè)定方法測(cè)定，以對(duì)照品的濃度(μg/ml)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程:y＝52103x+2600.4，r＝0.9999。結(jié)果表明，(2′s)-南五味子木質(zhì)素j對(duì)照品濃度在4.712～47.12μg/ml之間與其峰面積呈良好的線性關(guān)系，結(jié)果詳見(jiàn)表5。

表5線性關(guān)系考察結(jié)果

3.3范圍

本方法的最低限度為每1g含黑老虎以(2′s)-南五味子木質(zhì)素j計(jì)，不得少于0.25mg。故按限度的60％和300％(即0.15～0.75mg/g)考察測(cè)定范圍的準(zhǔn)確度。

范圍準(zhǔn)確度:取同一批舒筋健腰丸(批號(hào):fa1071，含量0.2847mg/g)粉末共12份，其中低限度組6份，每份0.52g，高限度組6份，每份2.6g，精密稱定；按當(dāng)前取樣含量約1:1分別精密加入(2′s)-南五味子木質(zhì)素j對(duì)照品溶液(低限度組0.1428mg/ml×1ml、高限度組0.1428mg/ml×5ml)，按含量測(cè)定方法測(cè)定，計(jì)算(2′s)-南五味子木質(zhì)素j的回收率。結(jié)果見(jiàn)表6。

表6范圍準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果

測(cè)定結(jié)果顯示：低限度組平均回收率為98.98％，rsd＝0.64％；高限度組平均回收率為99.28％,rsd＝0.83％。根據(jù)線性、精密度和準(zhǔn)確度的試驗(yàn)結(jié)果，本方法適合檢測(cè)含量在6～30μg/ml濃度范圍的供試品溶液。

3.4耐用性

3.4.1穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份供試品溶液，按含量測(cè)定方法，分別在0、2、4、6、8、12、24小時(shí)進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果供試品溶液自制備后24小時(shí)內(nèi)測(cè)定基本穩(wěn)定，詳見(jiàn)表7。

表7穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(批號(hào)：fa1071)

3.4.2重復(fù)性試驗(yàn)

舒筋健腰丸(批號(hào):fa1071)粉碎，取粉末共6份，每份約2g，精密稱定，按實(shí)施例5的步驟2所述的方法制備供試品溶液，測(cè)定，即得。結(jié)果見(jiàn)表8。

表8重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果(批號(hào):fa1071)

結(jié)論：重復(fù)性試驗(yàn)的rsd為1.14％，說(shuō)明本發(fā)明重復(fù)性良好。

3.5回收率

3.5.1加樣回收用(2′s)-南五味子木質(zhì)素j母液的制備

精密稱取(2′s)-南五味子木質(zhì)素j對(duì)照品14.28mg，置100ml量瓶，加95％乙醇適量使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，作為回收用(2′s)-南五味子木質(zhì)素j對(duì)照品母液(每1ml含(2′s)-南五味子木質(zhì)素j0.1428mg)。

3.5.2回收供試品溶液的制備:

舒筋健腰丸(批號(hào):fa1071，含(2′s)-南五味子木質(zhì)素j0.2847mg/g)粉碎，稱取粉末共6份，每份約1g，精密稱定，分別置具塞錐形瓶中，精密加入上述回收用(2′s)-南五味子木質(zhì)素j母液2ml，再精密加入95％乙醇50ml，稱定重量，超聲處理(功率250w，頻率40khz)45分鐘，放冷，再稱定重量，用95％乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

3.5.3測(cè)定

照高效液相法(《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄ⅵd)，精密吸取回收供試品溶液10μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表9。

表9回收試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

3.5.4結(jié)論

平均回收率為98.88％，rsd為1.49％。結(jié)果表明，本方法具有良好的回收率。

4.樣品含量測(cè)定

取不同生產(chǎn)批號(hào)(廣州白云山陳李濟(jì)藥廠有限公司生產(chǎn))的舒筋健腰丸，按含量測(cè)定方法操作，測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表10，其中對(duì)照品色高效液相色譜圖見(jiàn)附圖7，批號(hào)fu4901的舒筋健腰丸的高效液相色譜圖見(jiàn)附圖8。

表10十批含量測(cè)定結(jié)果

5.含量限度的確定

根據(jù)以上10批樣品的測(cè)定結(jié)果，(2′s)-南五味子木質(zhì)素j的含量在0.2791～0.4658mg之間，考慮生產(chǎn)過(guò)程中的損耗等不穩(wěn)定因素，故規(guī)定本品每1g含黑老虎以(2′s)-南五味子木質(zhì)素j計(jì)，不得少于0.25mg。

實(shí)施例6高效液相色譜法測(cè)定女貞子中特女貞苷的含量

色譜條件:

agilent1200型高效液相；waters2487dualλabsorbancedetector；

色譜柱：agilentzorbaxeclipsexdb-c18(250×4.6mm,5μm)；

柱溫：30℃；

檢測(cè)波長(zhǎng)：224nm；

流動(dòng)相：乙腈-水(17:83)；

流速：1ml/min；

理論板數(shù)按特女貞苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2500。

具體操作步驟為：

1)對(duì)照品溶液的制備：取特女貞苷對(duì)照品(批號(hào)：111926-201102，中國(guó)食品藥品檢定研究院)適量，精密稱定，加80％甲醇制成每1ml含62.34μg的溶液，即得。

2)供試品溶液的制備：取本品適量，研細(xì)，取約5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80％甲醇50ml，稱定重量，超聲處理(功率250w，頻率40khz)30分鐘，放冷，再稱定重量，用80％甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液20ml，蒸干，殘?jiān)?0％甲醇5ml使溶解，加在中性氧化鋁柱(100～200目，5g，內(nèi)徑約1.5cm)上，用80％甲醇70ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)?0％甲醇使溶解，轉(zhuǎn)移至10ml量瓶中，加80％甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

3)測(cè)定法：照高效液相法(《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄ⅵd)，分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。

本品每1g含女貞子以特女貞苷(c31h42o17)計(jì)，不得少于0.15mg。

實(shí)施例7高效液相色譜法測(cè)定女貞子中特女貞苷的含量

色譜條件:

agilent1200型高效液相；waters2487dualλabsorbancedetector；

色譜柱：agilentzorbaxeclipsexdb-c18(250×4.6mm,5μm)；

柱溫：30℃；

檢測(cè)波長(zhǎng)：224nm；

流動(dòng)相：乙腈-水(17:83)；

流速：1ml/min；

理論板數(shù)按特女貞苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2500。

具體操作步驟為：

1)對(duì)照品溶液的制備：取特女貞苷對(duì)照品(批號(hào)：111926-201102，中國(guó)食品藥品檢定研究院)適量，精密稱定，加80％甲醇制成每1ml含62.34μg的溶液，即得。

2)供試品溶液的制備：取本品適量，研細(xì)，取約2.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70％甲醇50ml，密塞，稱定重量，超聲處理45分鐘(功率250w，頻率40khz)，放冷，再稱定重量，用70％甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)。精密量取續(xù)濾液20ml，置蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，殘?jiān)眠m量甲醇溶解，拌硅膠(柱層析用，100～200目)3g，蒸干，干法上硅膠柱(柱層析用，100～200目,5g)，用1，2-二氯乙烷50ml洗脫，棄去洗脫液，繼用1，2-二氯乙烷:甲醇(3:1)的混合溶劑80ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)?0％甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至5ml量瓶中，加70％甲醇至刻度，搖勻，即得。

3)測(cè)定法：照高效液相法(《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄ⅵd)，分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。

本品每1g含女貞子以特女貞苷(c31h42o17)計(jì)，不得少于0.15mg。

實(shí)施例8高效液相法測(cè)定女貞子中特女貞苷含量的方法學(xué)考察

所用儀器為waters2695型高效液相色譜儀；waters2487dualλabsorbancedetector；sb-5200dtd超聲波處理器(寧波新芝生物科技股份有限公司)；紫外光譜儀:uv-2450(shimadzu)。

1.色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

1.1流動(dòng)相的選擇

考察了不同比例的甲醇-水和乙腈-水系統(tǒng)，結(jié)果以乙腈-水(17:83)為流動(dòng)相，供試品中特女貞苷峰達(dá)到基線分離，峰形對(duì)稱，保留時(shí)間適中(約17分鐘)，因此，選用乙腈-水(17:83)為流動(dòng)相。

1.3色譜柱

agilentzorbaxeclipsexdb-c18,5μm,4.6×250mm色譜柱。

2.色譜條件的考察

2.1提取溶劑的考察

考察五種溶劑的提取效果，分別是甲醇、80％甲醇、70％甲醇、95％乙醇、稀乙醇(其中的濃度都是體積百分比濃度)。

取同一批號(hào)的舒筋健腰丸(批號(hào):fw7851)粉末，分別稱取5份，每份5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入溶劑50ml，密塞，稱定重量，超聲處理45分鐘，放冷，再稱定重量，用溶劑補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液20ml，蒸干，殘?jiān)?0％甲醇5ml使溶解，加在中性氧化鋁柱(100～200目，5g，內(nèi)徑約1.5cm)上，用80％甲醇100ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)?0％甲醇使溶解，轉(zhuǎn)移至10ml量瓶中，加80％甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

取上述供試品溶液，分別按含量測(cè)定方法測(cè)定特女貞苷的含量。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表11。

表11不同提取溶劑的試驗(yàn)結(jié)果(n＝2)

上述不同溶劑的提取結(jié)果可以看出，甲醇和乙醇提取的效果相對(duì)較差，而80％甲醇、70％甲醇和稀乙醇提取效果基本相當(dāng)。但稀乙醇提取液不易過(guò)濾，不方便操作。80％甲醇和70％甲醇相比較，80％甲醇的提取液過(guò)柱后相對(duì)浸膏量較少，雜質(zhì)較少，因此選擇80％甲醇作為提取溶劑。

2.2超聲提取時(shí)間的選擇

同一批號(hào)的舒筋健腰丸(批號(hào):fw7851)粉末，分別稱取3份，每份5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80％甲醇50ml，密塞，稱定重量，超聲時(shí)間分別為30分鐘、45分鐘、60分鐘，放冷，再稱定重量，用溶劑補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液20ml，蒸干，殘?jiān)?0％甲醇5ml使溶解，加在中性氧化鋁柱(100～200目，5g，內(nèi)徑約1.5cm)上，用80％甲醇100ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)?0％甲醇使溶解，轉(zhuǎn)移至10ml量瓶中，加80％甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

取上述供試品溶液，分別按含量測(cè)定方法測(cè)定特女貞苷的含量，結(jié)果見(jiàn)表12。

表12不同提取時(shí)間的試驗(yàn)結(jié)果(n＝2)

結(jié)果表明超聲提取30分鐘、45分鐘、60分鐘的提取效果基本一致，長(zhǎng)時(shí)間超聲并不能提高檢測(cè)成分的提取率。因此優(yōu)選超聲時(shí)間為30分鐘。

2.3氧化鋁柱洗脫溶劑用量的選擇

同一批號(hào)的舒筋健腰丸(批號(hào):fw7851)粉末，分別稱取4份，每份5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80％甲醇50ml，密塞，稱定重量，超聲時(shí)間30分鐘，放冷，再稱定重量，用溶劑補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液20ml，蒸干，殘?jiān)?0％甲醇5ml使溶解，加在中性氧化鋁柱(100～200目，5g，內(nèi)徑約1.5cm)上，分別用80％甲醇30ml、50ml、70ml、100ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)?0％甲醇使溶解，轉(zhuǎn)移至10ml量瓶中，加80％甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

取上述供試品溶液，分別按含量測(cè)定方法測(cè)定特女貞苷的含量，結(jié)果見(jiàn)表13。

表13不同洗脫溶劑用量的試驗(yàn)結(jié)果(n＝2)

結(jié)果表明洗脫溶劑用量70ml基本可以達(dá)到洗脫要求，含量增加不明顯，因此優(yōu)選洗脫溶劑用量為70ml。

2.4不同規(guī)格色譜柱的比較

取同一對(duì)照品溶液、供試品溶液，按含量測(cè)定方法操作，比較watersatlantist35μm4.6×250mm色譜柱(a)、agilentzorbaxeclipsexdb-c18(250×4.6mm,5μm)色譜柱(b)和phenomenexlunac18(250×4.6mm,5μm)色譜柱(c)測(cè)定得到的特女貞苷含量，結(jié)果見(jiàn)表14。

表14不同色譜柱的考察(n＝2)

試驗(yàn)表明，使用不同生廠商的色譜柱進(jìn)行分析，色譜峰都能達(dá)到基線分離，峰形對(duì)稱，測(cè)定結(jié)果沒(méi)有顯著性差別。因此，本方法對(duì)色譜柱的依賴性小，適用性好。十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱都可以用于本方法。(下面的各項(xiàng)方法學(xué)試驗(yàn)及含量測(cè)定，都采用agilentzorbaxeclipsexdb-c18(250×4.6mm,5μm)色譜柱。)

3.方法學(xué)驗(yàn)證

3.1專屬性:

陰性對(duì)照品溶液的制備：取不含女貞子的陰性樣品5g，按實(shí)施例6的步驟2制備成陰性對(duì)照品溶液。

精密吸取陰性對(duì)照品溶液10μl，注入液相色譜儀，按含量測(cè)定方法測(cè)定。結(jié)果未見(jiàn)陰性對(duì)照品溶液對(duì)試驗(yàn)有干擾。見(jiàn)附圖9。

3.2線性考察

精密量取特女貞苷對(duì)照品溶液(147.8μg/ml)1、2、4、6、8、10ml,置10ml量瓶中，加80％醇至刻度，搖勻，即得每1ml含14.78、29.56、59.12、88.68、118.24、147.8μg的梯度溶液。分別精密吸取10μl，注入液相色譜儀，按含量測(cè)定方法測(cè)定，以對(duì)照品的濃度(μg/ml)為橫坐標(biāo)，吸收峰峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程:y＝10552x+686.12，r＝0.9996。結(jié)果表明，特女貞苷對(duì)照品濃度在14.78～147.8μg/ml之間與其峰面積呈良好的線性關(guān)系，結(jié)果詳見(jiàn)表15。

表15線性關(guān)系考察結(jié)果

3.3范圍

本方法的最低限度為每1g含女貞子以特女貞苷計(jì)，不得少于0.15mg。故按限度的60％和400％(即0.09～0.60mg/g)考察測(cè)定范圍的準(zhǔn)確度。

范圍準(zhǔn)確度:取同一批舒筋健腰丸(批號(hào):fw7851，含量0.3262mg/g)粉末共12份，其中低限度組6份，每份0.68g，高限度組6份，每份4.59g，精密稱定；按當(dāng)前取樣含量約1:1分別精密加入特女貞苷對(duì)照品溶液(低限度組0.3728mg/ml×0.6ml、高限度組0.3728mg/ml×4ml)，按含量測(cè)定方法測(cè)定，計(jì)算特女貞苷的回收率。結(jié)果見(jiàn)表16。

表16范圍準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果

測(cè)定結(jié)果顯示：低限度組平均回收率為97.05％，rsd＝1.58％；高限度組平均回收率為98.96％,rsd＝1.14％。根據(jù)線性、精密度和準(zhǔn)確度的試驗(yàn)結(jié)果，本方法適合檢測(cè)含量在18～120μg/ml濃度范圍的供試品溶液。

3.4耐用性

3.4.1穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份供試品溶液，按含量測(cè)定方法，分別在0、2、4、6、8、12、24小時(shí)進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果供試品溶液自制備后24小時(shí)內(nèi)測(cè)定基本穩(wěn)定，詳見(jiàn)表17。

表17穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(批號(hào):fw7851)

3.4.2重復(fù)性試驗(yàn)

舒筋健腰丸(批號(hào):fw7851)粉碎，取粉末共6份，每份約5g，精密稱 定，按實(shí)施例6的步驟2所述的方法制備供試品溶液，測(cè)定，即得。結(jié)果見(jiàn)表18。

表18重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果(批號(hào):fw7851)

結(jié)論：重復(fù)性試驗(yàn)的rsd為0.94％，說(shuō)明本發(fā)明重復(fù)性良好。

3.5回收率

3.5.1加樣回收用特女貞苷母液的制備

精密稱取特女貞苷對(duì)照品18.64mg，置50ml量瓶，加80％甲醇適量使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，作為回收用特女貞苷對(duì)照品母液(每1ml含特女貞苷0.3728mg)。

3.5.2回收供試品溶液的制備:

舒筋健腰丸(批號(hào):fw7851，含特女貞苷0.3262mg/g)粉碎，稱取粉末共6份，每份約2.5g，精密稱定，分別置具塞錐形瓶中，精密加入上述回收用特女貞苷母液2.2ml，按含量測(cè)定方法測(cè)定，計(jì)算特女貞苷的回收率。

3.5.3測(cè)定

照高效液相法(《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄ⅵd)，精密吸取回收供試品溶液10μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表19。

表19回收試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

3.5.4結(jié)論

平均回收率為97.65％，rsd為1.07％。結(jié)果表明，本方法具有良好的回收率。

4.樣品含量測(cè)定

取不同生產(chǎn)批號(hào)(廣州白云山陳李濟(jì)藥廠有限公司生產(chǎn))的舒筋健腰丸，按含量測(cè)定方法操作，測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表20，其中對(duì)照品高效液相色譜圖見(jiàn)附圖10，批號(hào)fu4901的舒筋健腰丸的高效液相色譜圖見(jiàn)附圖11

表20十批含量測(cè)定結(jié)果

5.含量限度的確定

根據(jù)以上10批樣品的測(cè)定結(jié)果，特女貞苷的含量在0.1657～0.4780mg之間，考慮生產(chǎn)過(guò)程中的損耗等不穩(wěn)定因素，故規(guī)定本品每1g含女貞子以特女貞苷計(jì)，不得少于0.15mg。

實(shí)施例9一種舒筋健腰丸的檢測(cè)方法

1.高效液相色譜法測(cè)定黑老虎中(2′s)-南五味子木質(zhì)素j的含量

按照實(shí)施例4所述方法進(jìn)行測(cè)定。

2.高效液相色譜法測(cè)定女貞子中特女貞苷的含量

按照實(shí)施例6所述方法進(jìn)行測(cè)定。

3.薄層色譜法檢測(cè)狗脊

按照實(shí)施例1所述方法進(jìn)行檢測(cè)。

4.薄層色譜法檢測(cè)黑老虎

按照實(shí)施例2所述方法進(jìn)行檢測(cè)。

5.薄層色譜法檢測(cè)桑寄生

按照實(shí)施例4所述方法進(jìn)行測(cè)定。

實(shí)施例10一種舒筋健腰丸的檢測(cè)方法

1.高效液相色譜法測(cè)定黑老虎中(2′s)-南五味子木質(zhì)素j的含量

按照實(shí)施例4所述方法進(jìn)行測(cè)定。

2.高效液相色譜法測(cè)定女貞子中特女貞苷的含量

按照實(shí)施例7所述方法進(jìn)行測(cè)定。

3.薄層色譜法檢測(cè)狗脊

按照實(shí)施例1所述方法進(jìn)行檢測(cè)。

4.薄層色譜法檢測(cè)黑老虎

按照實(shí)施例2所述方法進(jìn)行檢測(cè)。

5.薄層色譜法檢測(cè)桑寄生

按照實(shí)施例4所述方法進(jìn)行測(cè)定。

以上對(duì)本發(fā)明具體實(shí)施方式的描述并不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明做出各種改變或變形，只要不脫離本發(fā)明的精神，均應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的范圍。