背景技術(shù)：
馬兜鈴酸類化合物具有明顯的腎毒性，是當(dāng)前市售含馬兜鈴中藥及復(fù)方的重點(diǎn)監(jiān)測(cè)指標(biāo)成分，例如2015版中國(guó)藥典中規(guī)定天仙藤藥材中馬兜鈴酸I的含量不得超過0.01％，細(xì)辛藥材中馬兜鈴酸I的含量不得超過0.001％，而對(duì)于含馬兜鈴酸復(fù)方中該類成分的檢測(cè)尚未有法定標(biāo)準(zhǔn)，推測(cè)原因可能為該類復(fù)方藥味眾多、基質(zhì)復(fù)雜且存在諸多輔料的干擾，檢測(cè)難度較大。發(fā)展一種高效的預(yù)處理方法，能夠有效富集尤其是從復(fù)雜的復(fù)方基質(zhì)中富集馬兜鈴酸類化合物，組合現(xiàn)有的分析技術(shù)，有望是解決該問題的有效途徑。
目前，富集該類化合物的方法主要包括液液萃取(Zhang,J.,et al.,J.Pharmceut.Biomed.,2010,52(4):446-451)、雙水相萃取(L.Vaclavik,et al.,Food Addit.Contam.A-Chemistry Analysis Control Exposure&Risk Assessment,2014,31:784-791)、商品陰離子交換樹脂柱(K.Yamasaki,et al.,J.Nat.Med.,2009,63:451-458)等預(yù)處理方法，上述各種方法均能較好地解決馬兜鈴酸的富集問題，但存在預(yù)處理流程繁瑣，通量不足或價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)。為建立一種更方便且價(jià)廉的預(yù)處理方法，我們采用自制大孔吸附樹脂萃取柱富集馬兜鈴酸，通過與以上各方法平行對(duì)比試驗(yàn)，研究結(jié)果表明，我們自制的萃取柱回收率更高、穩(wěn)定性更好，可作為一種新的預(yù)處理方法，用于馬兜鈴藥材及含馬兜鈴復(fù)方中馬兜鈴酸的高靈敏測(cè)定。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供了一種用于富集馬兜鈴酸的預(yù)處理新方法，該方法采用自制價(jià)廉的大孔吸附樹脂萃取柱，可高效富集馬兜鈴酸類化合物，相較傳統(tǒng)液液萃取、雙水相萃取及商品陰離子交換樹脂柱萃取技術(shù)，本發(fā)明報(bào)道的富集方法，回收率更高，穩(wěn)定性更好，可作為一種新的預(yù)處理方法，用于馬兜鈴藥材及含馬兜鈴復(fù)方中馬兜鈴酸的高靈敏測(cè)定。
具體內(nèi)容為：采用自制價(jià)廉的大孔吸附樹脂萃取柱，大孔吸附樹脂填料為HPD-100,Diaion及AB-8中的任意一種，填料裝填體積保持為上樣溶液體積的2～5倍。以不高于40％的甲醇或乙醇溶液除去雜質(zhì)，以70％-100％的甲醇或乙醇溶液洗脫富集馬兜鈴酸類化合物。其中除去雜質(zhì)的醇洗脫液濃度優(yōu)選為10％-30％；而富集馬兜鈴的洗脫醇溶液優(yōu)選為80％-90％。
以本發(fā)明所報(bào)道的采用自制大孔吸附樹脂柱萃取馬兜鈴酸，相較文獻(xiàn)具有如下優(yōu)點(diǎn)和進(jìn)步：
1)本發(fā)明報(bào)道的預(yù)處理方法，相較文獻(xiàn)報(bào)道的液液萃取、雙水相萃取及C18固相萃取，回收率更高，穩(wěn)定性更好，更適宜微量馬兜鈴酸的富集和高靈敏測(cè)定。
2)本發(fā)明報(bào)道的預(yù)處理方法，采用大孔吸附樹脂作為萃取柱的填料，具有價(jià)格低廉、可重復(fù)利用等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)自制萃取柱不受商品萃取小柱規(guī)格所限，可按需裝填任意尺寸，具有較大的靈活性。
附圖說明
圖1幾種萃取方法的相對(duì)回收率比較。
具體實(shí)施方式
現(xiàn)結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明，實(shí)施例僅限于說明本發(fā)明，而非對(duì)本發(fā)明的限定。
實(shí)施例1幾種預(yù)處理方法相對(duì)回收率的比較
提?。厚R兜鈴果皮10g,加水200mL，浸泡30min后，水浴回流提取2次，第一次20min，第二次15min。合并兩次提取液，保溫過濾，濾液減壓濃縮后定容于25mL容量瓶備用。
四種預(yù)處理方法比較：取上述提取液各1mL，用水1:1稀釋后，分別采用以下4種預(yù)處理方法進(jìn)行處理，收集目標(biāo)流份后，N2吹干后用1.5mL甲醇溶解，過膜后UPLC-TOF/MS分析，以馬兜鈴酸I的含量為指標(biāo)，比較幾種預(yù)處理方法的相對(duì)回收率。幾種預(yù)處理流程如下：
1)乙酸乙酯液液萃?。阂宜嵋阴ポ腿?次，1mL*3次，合并3次提取液，N2吹干。
2)乙腈-MgSO4-NaCl雙水相萃取：加入2mL乙腈及0.8g MgSO4和0.2g NaCl后，搖勻后超聲使完全溶解，靜置分層，取上清液，N2吹干。
3)C18SPE：200g C18，先用1.2mL甲醇活化，1.2mL水平衡，上樣，先用2.4mL水洗脫除雜，之后采用2.4mL甲醇洗脫，收集甲醇洗脫流份，N2吹干。
4)自制HPD-100SPE：HPD-100填料約2mL，上樣，先用3mL水洗脫除雜，之后采用3mL 80％甲醇洗脫，收集80％甲醇洗脫流份，N2吹干。
結(jié)果如圖1所示，從相對(duì)回收率來看，自制HPD-SPE相對(duì)回收率最高。
實(shí)施例2幾種預(yù)處理方法相對(duì)回收率的比較
提?。和瑢?shí)施例1。
四種預(yù)處理方法比較：取上述提取液各1.5mL，用水1:4稀釋后，分別采用以下4種預(yù)處理方法進(jìn)行處理，收集目標(biāo)流份后，N2吹干后用1.5mL甲醇溶解，過膜后UPLC-TOF/MS分析，以馬兜鈴酸I的含量為指標(biāo)，比較幾種預(yù)處理方法的相對(duì)回收率。幾種預(yù)處理流程如下：
2)乙酸乙酯液液萃?。阂宜嵋阴ポ腿?次，1mL*3次，合并3次提取液，N2吹干。
2)乙腈-MgSO4-NaCl雙水相萃?。杭尤?mL乙腈及0.8g MgSO4和0.2g NaCl后，搖勻后超聲使完全溶解，靜置分層，取上清液，N2吹干。
3)C18SPE：200g C18，先用2mL甲醇活化，2mL水平衡，上樣，先用2.4mL水洗脫除雜，之后采用2.4mL甲醇洗脫，收集甲醇洗脫流份，N2吹干。
4)自制AB-8SPE：AB-8填料約2mL，上樣，先用6mL水洗脫除雜，之后采用6mL甲醇洗脫，收集甲醇洗脫流份，N2吹干。
結(jié)果如圖1所示，從相對(duì)回收率來看，自制SPE相對(duì)回收率最高，而其它3種預(yù)處理方法相對(duì)回收率較低，且不太穩(wěn)定。
實(shí)施例3幾種預(yù)處理方法相對(duì)回收率的比較
提?。和瑢?shí)施例1。
四種預(yù)處理方法比較：取上述提取液各1.5mL，用水1:4稀釋后，分別采用以下4種預(yù)處理方法進(jìn)行處理，收集目標(biāo)流份后，N2吹干后用1.5mL甲醇溶解，過膜后UPLC-TOF/MS分析，以馬兜鈴酸I的含量為指標(biāo)，比較幾種預(yù)處理方法的相對(duì)回收率。幾種預(yù)處理流程如下：
3)乙酸乙酯液液萃?。阂宜嵋阴ポ腿?次，1mL*3次，合并3次提取液，N2吹干。
2)乙腈-MgSO4-NaCl雙水相萃?。杭尤?mL乙腈及0.8g MgSO4和0.2g NaCl后，搖勻后超聲使完全溶解，靜置分層，取上清液，N2吹干。
3)C18SPE：200g C18，先用2mL甲醇活化，2mL水平衡，上樣，先用2.4mL水洗脫除雜，之后采用2.4mL甲醇洗脫，收集甲醇洗脫流份，N2吹干。
4)自制Diaion SPE：Diaion填料約2mL，上樣，先用6mL水洗脫除雜，之后采用6mL甲醇洗脫，收集甲醇洗脫流份，N2吹干。
結(jié)果如圖1所示，從相對(duì)回收率來看，自制SPE相對(duì)回收率最高，而其它3種預(yù)處理方法相對(duì)回收率較低，且不太穩(wěn)定。