專利名稱：：一種去除中藥中馬兜鈴酸的方法及其限量標(biāo)準(zhǔn)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于中藥研究領(lǐng)域，具體涉及一種去除中藥中馬兜鈴酸的方法及其限量標(biāo)準(zhǔn)。技術(shù)背景馬兜鈴酸類成分是一系列硝基菲類化合物，普遍存在于馬兜鈴屬(^7'sto/oc;'a印p.)、細(xì)辛屬植物中，長(zhǎng)期或超量不規(guī)范的服用含馬兜鈴酸的中藥可導(dǎo)致馬兜鈴酸腎病。國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局取消關(guān)木通、廣防己、青木香的藥用標(biāo)準(zhǔn)，并規(guī)定以木通、粉防己、土木香代替入藥或臨床配方。然而含馬兜鈴酸的中藥材尚有很多應(yīng)用于臨床，如馬兜鈴、天仙藤、朱砂蓮、尋骨風(fēng)、細(xì)辛等，所涉及的中成藥近300種，僅靠替代品代替原來的藥材使用或者簡(jiǎn)單禁用并不能有效解決所有含馬兜鈴酸中藥的問題，應(yīng)該充分發(fā)揮中醫(yī)藥的優(yōu)勢(shì)，采用炮制手段達(dá)到減毒、去毒的目的，保證臨床安全合理用藥。為此，根據(jù)馬兜鈴酸類成分的性質(zhì)，設(shè)計(jì)了一種去除馬兜鈴酸類毒性成分的方法。馬兜鈴酸難溶于水，或較少被水煎出，分子結(jié)構(gòu)中具有羧基，可以與強(qiáng)堿弱酸鹽發(fā)生置換反應(yīng)而溶于水，用清水洗去殘余的鹽溶液及飲片中殘余的馬兜鈴酸鈉；并且碳酸氫鈉不和藥材中的其它酚類成分結(jié)合，可以使飲片中的酚類化合物得到保留而不流失；醋制的方法可使飲片中的痕量馬兜鈴酸鹽(易于被水煎出)還原為馬兜鈴酸(難溶于水)，臨床水煎時(shí)，才不易被煎出，同時(shí)醋制還能增強(qiáng)藥材的止痛作用。有關(guān)馬兜鈴酸的專利只有一個(gè)含馬兜鈴酸及其內(nèi)酰胺類成分血液樣品預(yù)處理方法(申請(qǐng)?zhí)?00410033845)，該專利涉及含馬兜鈴酸及其內(nèi)酰胺類成分血漿或血清樣品預(yù)處理方法，其特點(diǎn)為含馬兜鈴酸及其內(nèi)酰胺類成分的血漿或血清樣品用鹽酸酸化后釆用乙酸乙酯進(jìn)行萃取處理，所述的血漿或血清包括人、大鼠、小鼠、家兔等，釆用該方法制備得到的血漿或血清樣品中馬兜鈴酸及其內(nèi)酰胺類成分的提取回收率均大于95%。該專利與本申請(qǐng)的內(nèi)容無關(guān)。糊贈(zèng)本發(fā)明的目的在于提供一種去除含馬兜鈴酸類成分的中藥中馬兜鈴酸的方法及其限量標(biāo)準(zhǔn)，以保證臨床用藥安全。具體實(shí)施方式為達(dá)到上述目的，本發(fā)明通過下述技術(shù)方案予以實(shí)施。1、本發(fā)明通過以下步驟去除藥材中的馬兜鈴酸類成分(1)藥材采用濃度為0.01N-0.2N的鹽浸泡12h48h，鹽水用量為510倍(V/W)，優(yōu)選0.05NaHC036倍量浸泡24h;清水淋洗35次，洗去藥材中殘余的鹽溶液及殘余的馬充鈴酸鈉；切片212mm，優(yōu)選56mm;清水浸泡2~6h，優(yōu)選3h;重復(fù)上述鹽泡一淋洗一清水浸泡一淋洗過程3~12次，優(yōu)選67次；瀝干，再用米醋進(jìn)行浸泡或淋灑，悶制3h，文火炒干，米醋用量為原藥材量10%~40%(V/W)，優(yōu)選20%。表1鹽制工藝參數(shù)的優(yōu)選\^號(hào)實(shí)^\A(NaHC03濃度)B(水用量)C(切片厚度)D馬兜鈴酸A去除率(％)11(0.2NNaHCO3)1(IO倍量)1(1(M2m)186.4021(0.2NNaHCO3)2(8倍量)2(5~6mm)287.8931(0.2NNaHCO3)3(5倍量)3(2~3mm)388.5942(0.1NNaHCO3)1(IO倍量)2(5~6mm)391.992(0.1NNaHCO3)2(8倍量)3(2~3mm)191.1562(0.1NNaHCO3)3(5倍量)1(1(M2m)28謹(jǐn)73(0.05NNaHCO3)1(IO倍量)3(2~3mm)296.5583(0.05NNaHCO3)2(8倍量)1U(M2m)392.1693(0.05NNaHCO3)3(5倍量)2(5~6mm)193.82EI262.88274.94267.16271.37EII271.74271.20273.70273.04￡111282.53271.01276.29272,74￡Y=817.15I均值87.6391.6589.0590.46CT=74192.68II均值90.5890.4091.2391.01III均值94.1890.3492.10卯.91方差分析結(jié)果表明，A因素對(duì)藥材中馬兜鈴酸去除率有極其顯著影響；C因素對(duì)去除率有顯著的影響，直觀分析中水平2和3的差距很小；B因素對(duì)去除率無顯著的影響。因此，綜合考慮工業(yè)生產(chǎn)的要求，實(shí)現(xiàn)卯％以上的馬兜鈴酸A的去除工藝優(yōu)選NaHCO3濃度為0.05N，水用量為6倍量，切片厚度為56咖。為得到馬兜鈴酸A殘留量在lOppm的飲片，我們繼續(xù)重復(fù)上述工藝，結(jié)果見表2，在第6天以后，馬兜鈴酸A(簡(jiǎn)稱AA)的殘留量逐步降低，均在10ppm以下。表2不同炮制時(shí)間青木香中馬兜鈴酸A去除率比較第6天第1批第6天第2批第6天第3批第7天第l批第7天第2批第7天第3批第9天第l批第9天第2批第9天第3批AA含量5.287.516.232.803.172.771.051.140.97AA去除率/%99.4999.2799.4099.7399,6999.7399.9099.8999.91平均值/%99.3899.7299.90注青木香生品中AA含量為1033.89嗎'g—1。(2)醋制藥材經(jīng)鹽泡、清水浸泡、淋洗過程，飲片中尚含有痕量的馬兜鈴酸鹽，煎煮時(shí)易于被水煎出，考慮采用醋酸(弱酸)將馬兜鈴酸鹽還原為難溶于水的馬兜鈴酸，同時(shí)醋制還能增強(qiáng)藥材的止痛作用。表3醋制工藝參數(shù)優(yōu)選醋用量水煎液中馬兜鈴酸A水煎液中馬兜鈴酸AMean(kg/100kg原藥材)含量(pg/g)煎出率(％)(o/o)4.9714.2204.1911.914.25.8216.68.0622.9156.5818.720.36.7919.35.9917.0106.7519.218.46.6819.02、本發(fā)明所得飲片中馬兜鈴酸含量的限量標(biāo)準(zhǔn)色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-水-乙酸(68:32:1)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為390nm。理論塔板數(shù)按馬兜鈴酸A峰計(jì)算應(yīng)不低于2000。對(duì)照品溶液的制備精密稱取馬兜鈴酸A對(duì)照品11.83mg，用無水乙醇溶于10mL容量中，搖勻、定容。精密稱取lmL至10mL容量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得(每lmL中含馬兜鈴酸A0.lmg)。供試品溶液的制備取本品粉末(過40目篩)約1.5g，精密稱定，置于50mL具塞三角瓶中，精密加入甲醇10%甲酸水(4:1)25mL，浸泡1小時(shí)后，稱重。超聲處理3次，每次15分鐘，補(bǔ)足重量，從中吸取約13mL，離心GOOO轉(zhuǎn)'min—1，lOmin)，精密吸取10mL至蒸發(fā)皿中，蒸干，用甲醇10%甲酸水(4:1)溶解，定容至2mL容量瓶中，濾過，取續(xù)濾液，即得。測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各20wL，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。本品按干燥品計(jì)算，含馬兜鈴酸A不得超過10ppm(mg/kg)。實(shí)例l關(guān)木通炮制稱取關(guān)木通生品500g，用濃度為0.1NNaHC03溶液10倍量浸泡24h，以清水洗3次，每次約10倍量水，洗至無色后再浸泡下一次，重復(fù)浸泡一淋洗5次，瀝干，醋制，悶透，炒干，得去除馬兜鈴酸的關(guān)木通制品，米醋用量為原藥材量20%(V/W)。HPLC進(jìn)行分析，制品中馬兜鈴酸的去除率在93%以上。實(shí)例2青木香炮制河北安國(guó)青木香生品10kg，用濃度為0.05NNaHCO3溶液6倍(V/W)浸泡24h，清水淋洗3次，切片56mm，清水浸泡3h,重復(fù)上述堿泡一淋洗一清水浸泡一淋洗過程6次，瀝千，醋制，悶制3h，文火炒干，即得去除馬兜鈴酸的青木香飲片，米醋用量為原藥材量20%(V/W)。HPLC進(jìn)行分析，制青木香中馬兜鈴酸的去除率達(dá)99%以上，馬兜鈴酸A殘留量為5ppm。實(shí)例3青木香炮制河北安國(guó)青木香生品10kg,用濃度為0.05NNaHCO3溶液6倍(V/W)浸泡24h，清水淋洗3次，切片56mm，清水浸泡3h，重復(fù)上述堿泡一淋洗一清水浸泡一淋洗過程8次，瀝干，醋制，悶制3h，文火炒干，即得去除馬兜鈴酸的青木香飲片，米醋用量為原藥材量20%(V/W)。HPLC進(jìn)行分析，制青木香中馬兜鈴酸的去除率達(dá)99.9%以上，馬兜鈴酸A殘留量為lppm。實(shí)例4細(xì)辛炮制稱取細(xì)辛生品3kg，用濃度為0.05NNaHCO3溶液6倍(V/W)浸泡24h,清水淋洗3次，清水浸泡3h,重復(fù)上述堿泡一淋洗一清水浸泡一淋洗過程5次，瀝干，醋制，悶制3h，文火炒干，即得去除馬兜鈴酸的青木香飲片，米醋用量為原藥材量20%(V/W)。HPLC進(jìn)行分析，制青木香中馬兜鈴酸的去除率達(dá)99.99%以上，馬兜鈴酸A殘留量為100ppb。實(shí)例5炮制前后青木香的解痙作用比較采用新斯的明負(fù)荷小鼠模型比較青木香炮制前后的解痙作用，結(jié)果表明新斯的明在0.11mg/kg,b.w劑量下可引起小鼠腸運(yùn)動(dòng)加快(pO.Ol)，造成腸痙攣模型。青木香生品和炮制品在小、中劑量(10、20g飲片/kg)—次性灌胃給藥均能夠明顯抑制新斯的明誘導(dǎo)的胃腸運(yùn)動(dòng)加快(P<0.05、PO.Ol，P<0.01、PO.01);青木香生品、炮制品40g飲片/kg—次性灌胃給藥更加明顯的抑制新斯的明誘導(dǎo)的胃腸運(yùn)動(dòng)加快(PO.Ol、PO.01);抑制的作用強(qiáng)度為47.98、49.84%;但青木香生品和炮制品的水煎液對(duì)新斯的明誘導(dǎo)的胃腸運(yùn)動(dòng)加快與對(duì)照組比較無明顯的抑制作用。青木香炮制品/生品對(duì)新斯的明引起的腸運(yùn)動(dòng)加快的抑制作用呈現(xiàn)出劑量-效應(yīng)關(guān)系，且在同等劑量下，炮品對(duì)腸蠕動(dòng)的抑制率高于生品。表4青木香炮制前后醇提物對(duì)新斯的明負(fù)荷小鼠腸運(yùn)動(dòng)的影響(n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注與模型組比較*P<0.05**P<0.01實(shí)例6青木香炮制前后鎮(zhèn)痛作用比較采用熱刺激甩尾試驗(yàn)和化學(xué)刺激冰醋酸扭體試驗(yàn)比較青木香炮制前后的鎮(zhèn)痛作用，結(jié)果表明小鼠一次性灌胃給予青木香生品、炮制品的水煎液和青木香生品醇提物7.5、15.0g飲片/kg，青木香炮制品醇提物7.5g飲片/kg后，對(duì)小鼠lh、2h熱刺激甩尾的痛閾值無明顯的影響，陽性對(duì)照藥安乃近和青木香炮制品醇提物15.0g飲片/kg分別可使小鼠lh的熱刺激甩尾的痛閾值明顯提高(P<0.05、P<0.01)。給小鼠一次性灌胃給予青木香生品水煎液7.5g飲片/kg和青木香生品醇提物7.5、15.0g飲片/kg，炮制品醇提物7.5g飲片/kg后，對(duì)冰醋酸誘導(dǎo)的扭體反應(yīng)出現(xiàn)時(shí)間(潛伏期)無明顯的延長(zhǎng)作用；青木香生品水煎液7.5g飲片/kg，炮品醇提物7.5g飲片/kg對(duì)冰醋酸誘導(dǎo)的小鼠扭體次數(shù)無明顯的減少作用，但青木香生品水煎液15g飲片/kg、炮制品水煎液7.5、15.0g飲片/kg、生品醇提物7.5、15.0g飲片/kg，炮制品醇提物15.0g飲片/kg均能顯著抑制冰醋酸誘導(dǎo)的小鼠扭體次數(shù)(P0.05、P<0.05、PO.Ol、P<0.05、PO.Ol、PO.05)。青木香生品水煎液15.0g飲片/kg，炮制品水煎液7.5、15.0g飲片/kg，炮制品醇提物15.0g飲片/kg均可明顯延長(zhǎng)冰醋酸誘導(dǎo)的小鼠出現(xiàn)扭體反應(yīng)的潛伏期(PO.Ol，P<0.05、P<0.01，PO.05),并可顯著抑制冰醋酸誘導(dǎo)的小鼠扭體次數(shù)P<0.01。表5青木香炮制前后醇提物對(duì)小鼠甩尾時(shí)間的影響(11=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表6青木香炮制前后醇提物抑制冰醋酸扭體實(shí)驗(yàn)(11=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注與對(duì)照組比較*P<0.05**P<0.01實(shí)例7青木香炮制前后抗炎作用比較采用二甲苯致小鼠耳殼腫脹法比較青木香炮制前后抗炎作用，結(jié)果表明一定量的二甲苯涂抹于小鼠耳廓內(nèi)外兩側(cè)可造成小鼠的耳廓炎癥模型。對(duì)二甲苯所致的小鼠耳廓炎癥模型，青木香生藥的水煎液要達(dá)到20g/kg.b.w的劑量，才有抗炎作用，而青木香炮品在5，lOgZkg.b.w劑量下就具有顯著的抗炎作用。青木香藥材的抗炎作用可能存在一個(gè)有效的劑量范圍，低于或高于這一有效劑量范圍內(nèi)，其抗炎作用都不顯著。表7青木香炮制前后抗炎作用<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注與對(duì)照組比較*P<0.05**P<0.019實(shí)例8炮制前后青木香的急性毒性比較小鼠飼養(yǎng)兩天無異常后，實(shí)驗(yàn)前給小鼠禁食(不禁水)14h，然后隨機(jī)分組，每組10只，雌雄各半。受試藥物分兩次灌胃給藥，0.4ml/10gb.w.，組間劑量比1:0.75，觀察藥后7天內(nèi)動(dòng)物的狀態(tài)，死亡情況及死亡時(shí)間的分布趨勢(shì)。死亡動(dòng)物立即尸解，肉眼觀察主要臟器病理改變情況，以機(jī)率單位法計(jì)算半數(shù)致死量(LD50)。表8青木香生品對(duì)小鼠LD5o的測(cè)定結(jié)果劑量(g/kg)對(duì)數(shù)劑量動(dòng)物數(shù)死亡數(shù)死亡率(%)機(jī)率單位267.002.42651010100—200.302.3017108805.84150.232.1768106605.25112.702.0519102204.1684.531.92701000—表9青木香炮品對(duì)小鼠LDso的測(cè)定結(jié)果劑量(g/kg)對(duì)數(shù)劑量動(dòng)物數(shù)死亡數(shù)死亡率(％)機(jī)率單位1500.001125.00843.75632.81474.60356.003.17613,05122.92622.80132.67632.551510101010101010643201006040302005.254.754.484.16從表8、9可知，青木香生品的急性毒性高于青木香炮制品的5.78倍，由此證明青木香本發(fā)明方法處理后，已經(jīng)達(dá)到了減毒的目的。權(quán)利要求1.一種去除中藥中馬兜鈴酸的方法及其限量標(biāo)準(zhǔn)，其特征在于該方法多次重復(fù)用鹽泡-淋洗-清水浸泡-淋洗過程，再瀝干、醋制，獲得去除率達(dá)99％以上的炮制品飲片。2.權(quán)利要求1中的弱酸鹽，其特征在于馬兜鈴酸分子結(jié)構(gòu)中的羧基與弱酸強(qiáng)堿鹽發(fā)生置換反應(yīng)，使馬兜鈴酸鹽溶于水而從藥材中除去，弱酸強(qiáng)堿鹽包括碳酸根、碳酸氫根的鈉、鉀鹽，優(yōu)選NaHC03;NaHC03的濃度為0.01N0.2N，優(yōu)選0.05N;鹽水的用量為510倍，優(yōu)選68倍；浸泡時(shí)間12h48h，優(yōu)選1224h。3.權(quán)利要求l中的淋洗，其特征在于用純凈水洗去按照權(quán)利要求2中制備的鹽泡飲片中殘余的鹽及殘余的馬兜鈴酸鹽，淋洗次數(shù)為36次，優(yōu)選23次。4.權(quán)利要求l中的清水浸泡，其特征在于按照權(quán)利要求3制備的飲片繼續(xù)用清水浸泡26h，優(yōu)選3h。5.權(quán)利要求l中的多次重復(fù)，其特征在于將權(quán)利要求2~4制備的飲片繼續(xù)重復(fù)鹽泡一淋洗一清水浸泡一淋洗過程312次，優(yōu)選57次。6.權(quán)利要求l中的瀝干，其特征在于將權(quán)利要求5制備的飲片干燥，包括曬干、瀝干、晾干、烘干，優(yōu)選瀝干。7.權(quán)利要求l中的醋制，其特征在于將權(quán)利要求26制備的飲片用酸使飲片中的痕量馬兜鈴酸鹽還原為馬兜鈴酸。弱酸選擇可供藥用和食用的有機(jī)酸，優(yōu)選醋酸、米醋；醋制方法采用醋泡或醋淋，悶制3h，再用文火炒干；醋的用量為原藥材量(V/W)10%~40%，優(yōu)選20%。8.根據(jù)權(quán)利要求17所制備的藥材飲片，其馬兜鈴酸含量應(yīng)小于10mg/kg。全文摘要本發(fā)明涉及一種去除中藥中馬兜鈴酸類有毒成分的方法及其限量標(biāo)準(zhǔn)。該方法針對(duì)含馬兜鈴酸的中藥材，多次重復(fù)弱酸強(qiáng)堿鹽水浸泡-淋洗-清水浸泡-淋洗過程，再瀝干、醋制，獲得馬兜鈴酸去除率達(dá)到99％以上的炮制品飲片。本發(fā)明的特點(diǎn)在于通過獨(dú)特的炮制方法，能夠?qū)崿F(xiàn)選擇性去除含馬兜鈴酸中藥中有毒成分馬兜鈴酸的目的，同時(shí)通過系統(tǒng)的評(píng)價(jià)，制定了馬兜鈴酸的限量標(biāo)準(zhǔn)。文檔編號(hào)A61K36/185GK101264116SQ20071006439公開日2008年9月17日申請(qǐng)日期2007年3月14日優(yōu)先權(quán)日2007年3月14日發(fā)明者劉鳳山,李建榮,王智民,王維皓,王金華,高慧敏申請(qǐng)人:中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所