專(zhuān)利名稱(chēng)：檢測(cè)存在于草藥產(chǎn)品和植物藥中的馬兜鈴材料的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鑒別草藥產(chǎn)品和植物藥的方法。尤其涉及到 一個(gè)以分 子學(xué)方法鑒別馬兜鈴屬的植物材料與來(lái)自其他科的植物。這種方法是基于
葉綠體DNA的trnL - trnF片段和psbA - trnH片段的序列。
背景技術(shù)：
來(lái)自馬兜鈴屬的中草藥材料已知含有可誘發(fā)腎病和癌癥的馬兜鈴酸 及相關(guān)化合物。在傳統(tǒng)中醫(yī)藥(TCM)中，來(lái)自馬兜鈴種的材料有時(shí)被 用來(lái)作為諸如木香、木通、防己、白英、馬兜鈴和朱砂蓮之類(lèi)的其他草藥 產(chǎn)品和植物性藥物的替代品或偽品。有關(guān)資料如下
1)中藥木香可以是來(lái)自木香(Aucklandia lappa)和其他物種的菊科 (Compositae )以及青木香(Aristolochia debilis )及相關(guān)馬兜鈴種的才艮部。
2 )中藥木通可以是來(lái)自木通(Akebia quinata)、三葉木通(Aucklandia trifoliata)、三p十木通(Aucklandia trifoliata var. australis)、 川木通(Clematis armandii)、鐵線蓮(Clematis montana)、關(guān)木通(Aristolochia manshuriensis ) 及相關(guān)馬兜鈴種的根部。
3 )中草藥防己可以是來(lái)自粉防己(Stephania tetrandra)和廣防己 (Aristolochia fangchi)及相關(guān)馬兜鈴種的才艮部。
4)中藥白英應(yīng)來(lái)自白英(Solanum lyratum )，但它有時(shí)與來(lái)自綿毛 馬兜鈴(Aristolochia mollissima)和相關(guān)馬兜鈴種的另 一藥草尋骨風(fēng)相混 淆。
5)中藥馬兜鈴可以來(lái)自馬兜鈴(Aristolochia contorta )及青木香(Aristolochia debilis )的果實(shí)，或來(lái)自百合科大百合(Cardiocrinum)及 相關(guān)類(lèi)群的果實(shí)或種子。
6 )中草藥朱砂蓮可以來(lái)自馬兜鈴植物Aristolochia kaempferi及馬兜 鈴的相關(guān)物種的根部，并可能與薯蕷科的薯蕷(Dioscorea cirrhosa)和相 關(guān)的物種產(chǎn)生混淆。
自90年代初以來(lái)，在世界上許多地方有數(shù)以百計(jì)因進(jìn)食了來(lái)自或含 有馬兜鈴的草藥和植物藥而致的食物中毒個(gè)案。在馬兜鈴植物中的有毒物 質(zhì)為馬兜鈴酸及相關(guān)化合物。在許多國(guó)家和地區(qū)，植物材料源自馬兜鈴屬 的中草藥產(chǎn)品和植物藥也被禁止使用，例如香港和臺(tái)灣。但是在中國(guó)大
陸，有些馬兜鈴種仍被允許使用作為草藥產(chǎn)品和植物藥。在那些允許使用 馬兜鈴材料的地方，應(yīng)提醒說(shuō)這類(lèi)材料的真正來(lái)源身份須被確定，這可以 使部分醫(yī)生和病人用藥時(shí)特別謹(jǐn)慎。所有禁止使用馬兜鈴材料的國(guó)家，也 有機(jī)會(huì)出現(xiàn)無(wú)心之裝運(yùn)或混合來(lái)自馬兜鈴種材料的情況。因此，能測(cè)定某 一特定草藥產(chǎn)品和含有植物性原料來(lái)自馬兜鈴屬植物是重要的。準(zhǔn)確和
徹底的方法來(lái)揭露其存在的草藥產(chǎn)品和植物性藥物是需要的，以幫助保護(hù) 消費(fèi)者，以加強(qiáng)其優(yōu)良制造規(guī)范(GMP),并產(chǎn)生證據(jù)進(jìn)行法律訴訟。
現(xiàn)有確定中藥材的方法往往是基于感官的做法，是十分依賴督察或配 藥員的主觀判斷。形態(tài)特征鑒定的價(jià)值通常有限，因?yàn)檎嬲闹胁菟幬锓N 及其偽品通常是非常相似。結(jié)構(gòu)及化學(xué)鑒定(如薄層色譜法，高效液相色 謙，氣相色譜-MS)的研究會(huì)受不同因素影響，如生長(zhǎng)階段和收獲后的加 工等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種能夠判斷中草藥材料是否來(lái)源于馬兜鈴 屬植物或者草藥產(chǎn)品和植物藥中是否含有源自馬兜鈴植物的原料的方法。
本發(fā)明的上述目的和其他目的通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn)利用葉綠體DNA 的trnL - trnF片段和psbA - trnH片段的序列信息來(lái)將馬兜鈴材料與傳統(tǒng) 中草藥中常用的其他中草藥材料進(jìn)行區(qū)分。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，所述方法包括以下步驟(a)獲得一套標(biāo) 準(zhǔn)DNA序列；(b )從一個(gè)或多個(gè)中藥樣品中提取總DNA; ( c )采用聚合 酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)或其他技術(shù)擴(kuò)增trnL - tmF片段和/或psbA - tmH 片段；(d)確定已擴(kuò)增的DNA片段的核苷酸序列；(e)將所述樣品的核 苷酸序列的trnL - tmF片段和psbA - trnH片段(或部分片段)與標(biāo)準(zhǔn)DNA 序列進(jìn)行對(duì)照，以及(f)可選地根據(jù)所述樣品的核苷S吏序列的trnL-trnF 片段和psbA - trnH片段和所述的標(biāo)準(zhǔn)序列生成樹(shù)狀圖。在一種典型的實(shí) 施例中，經(jīng)DNA提取，PCR擴(kuò)增和DNA序列分析步驟，就可以將得到 的所述樣品的trnL - tmF和/或psbA - trnH序列與馬兜鈴草本植物的標(biāo)準(zhǔn) DNA序列進(jìn)行比較和匹配，如果相匹配，則所述樣品屬于馬兜鈴。
本文所用的術(shù)語(yǔ)"標(biāo)準(zhǔn)DNA序列"，是指這樣的DNA序列，該序 列是已鑒定的植物物種的草藥原料的葉綠體DNA的trnL - tmF片段或 psbA - trnH片段，或者是包含了已鑒定的植物物種的草藥原料的葉綠體 DNA的trnL - tmF片段或psbA - trnH片段，或者是已鑒定的植物物種的 草藥原料的葉綠體DNA的trnL - tmF片段或psbA - trnH片段的一部分。
適合于擴(kuò)增trnL - trnF和/或psbA - trnH片段的方法和技術(shù)是眾所周 知的，并且是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知曉的；這正如采用諸如BioEdit和 MEGA之類(lèi)的用于電腦程序進(jìn)行DNA序列對(duì)照和生成樹(shù)狀圖的方法和技 術(shù)一樣。
總之，采用本發(fā)明的方法，任何來(lái)自馬兜鈴屬的中藥材都可以從來(lái)自 其他植物物種的中藥材中被^r測(cè)和區(qū)分開(kāi)，以下將通過(guò)實(shí)施例予以具體說(shuō) 明。


圖la顯示木香和相關(guān)馬兜鈴種的trnL-tmF序列對(duì)照。 圖lb顯示根據(jù)trnL - trnF序列對(duì)照構(gòu)建的木香和相關(guān)馬兜鈴種的樹(shù) 狀圖。
圖2a顯示木香和相關(guān)馬兜鈴種的psbA-trnH序列對(duì)照。
7圖2b顯示根據(jù)psbA - trnH序列對(duì)照構(gòu)建的木香和相關(guān)馬兜鈴種的樹(shù) 狀圖。
圖3a顯示木通及相關(guān)馬兜鈴物種的trnL-trnF序列對(duì)照。 圖3b顯示根據(jù)tmL - trnF序列對(duì)照構(gòu)建的木通及相關(guān)馬兜鈴物種的 樹(shù)狀圖。
圖4a顯示木通及相關(guān)馬兜鈴物種的psbA-trnH序列對(duì)照。 圖4b顯示根據(jù)psbA - trnH序列對(duì)照構(gòu)建的木通及相關(guān)馬兜鈴物種的 樹(shù)狀圖。
圖5a顯示防己及相關(guān)馬兜鈴種的trnL-trnF序列對(duì)照。 圖5b顯示根據(jù)tmL - tmF序列對(duì)照構(gòu)建的防己及相關(guān)馬兜鈴種的樹(shù) 狀圖。
圖6a顯示防己及相關(guān)馬兜鈴種的psbA - tmH序列對(duì)照。 圖6b顯示根據(jù)psbA - tmH序列對(duì)照構(gòu)建的防己及相關(guān)馬兜鈴種的樹(shù) 狀圖。
圖7a顯示白英及相關(guān)馬兜鈴種的trnL - trnF序列對(duì)照。 圖7b顯示根據(jù)trnL - trnF序列對(duì)照構(gòu)建的白英及相關(guān)馬兜鈴種的樹(shù) 狀圖。
圖8a顯示白英及相關(guān)馬兜鈴種的psb A - trnH序列對(duì)照。
圖8b顯示根據(jù)psbA - tmH序列對(duì)照構(gòu)建白英及相關(guān)馬兜鈴種的樹(shù)狀圖。
圖9a顯示馬兜鈴和相關(guān)物種的trnL-trnF序列對(duì)照。
圖9b顯示根據(jù)trnL - trnF序列對(duì)照構(gòu)建的馬兜鈴和相關(guān)物種的樹(shù)狀圖。
圖10a顯示馬兜鈴和相關(guān)物種的psb A - trnH序列對(duì)照。 圖10b顯示根據(jù)psbA - trnH序列對(duì)照構(gòu)建的馬兜鈴和相關(guān)物種的樹(shù) 狀圖。
圖lla顯示朱砂蓮及相關(guān)物種的tniL-tmF序列對(duì)照。
圖lib顯示根據(jù)trnL - tmF序列對(duì)照構(gòu)建的朱砂蓮及相關(guān)物種的樹(shù)狀圖。
圖12a顯示朱砂蓮及相關(guān)物種的psbA-trnH序列對(duì)照。圖12b顯示根據(jù)psbA - tmH序列對(duì)照構(gòu)建的朱砂蓮及相關(guān)物種的樹(shù) 狀圖。
圖13顯示馬兜鈴摻雜品或替代品和真正的馬兜鈴物種的trnL - trnF 序列。
圖14顯示馬兜鈴摻雜品或替代品和真正的馬兜鈴物種的psbA - trnH 序列。
具體實(shí)施例方式
為了便于理解本發(fā)明，以下將結(jié)合本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作為示例進(jìn) 行詳細(xì)說(shuō)明。盡管本領(lǐng)域技術(shù)人員明白，為了清楚起見(jiàn)，對(duì)于本發(fā)明的理 解不是特別重要的某些特征可以不顯示，但是對(duì)于本發(fā)明的示例性實(shí)施方 式進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明。另一方面，有關(guān)特定實(shí)施方式的具體細(xì)節(jié)僅僅是為了 舉例說(shuō)明，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以 據(jù)此進(jìn)行各種變化和修改。
實(shí)施例1 :木香
根據(jù)中華人民共和國(guó)藥典(2005年版)中，中藥"木香"源自木香 (Aucklandia lappa)和菊科的某些物種。而且有時(shí)摻雜了青木香 (Aristolochiadebilis)的根部，后者含有致癌的馬兜鈴酸。利用trnL - trnF
序列(如圖la和lb所示)及psbA-trnH序列(如圖2a及2b所示)，
可以用來(lái)區(qū)分真正的木香與被摻雜的木香。
通過(guò)對(duì)照馬兜鈴的tniL - trnF序列與那些真正的木香物種的trnL-trnF序列(如圖la和lb所示)，很清楚地有許多分歧；更為突出的分歧 廿口下所示
(1 )在馬兜鈴品種中為'TTAAAA',但在真正木香種中為 "TTAATAAAA"(即圖la中的堿基93-101 )，被稱(chēng)為分子標(biāo)記1 ;通過(guò)對(duì)照馬兜鈴的trnL-trnF序列和那些真正的木通物種的tmL-trnF 序列(如圖3a及3b),分歧是顯而易見(jiàn)的，更為突出的分歧如下所示
(1) 在馬兜鈴品種中為'AGAGTGGGA',但在真正木通種中為 'AGAAAGGA'(即圖3a中的堿基299-307 ),被稱(chēng)為分子標(biāo)記5 ;
(2 )在馬兜鈴品種中為'GACTATCA',但在真正木通種中為'AGTCA' (即圖3a中的堿基498-505 ),被稱(chēng)為分子標(biāo)記6 。
同樣，通過(guò)對(duì)照該馬兜鈴的psbA - trnH序列與那些真正木通種的 psbA隱trnH序列(如圖4a和4b),可以看到，在眾多的分歧點(diǎn)中比4交突 出的如下所示
(1 )在馬兜鈴品種中缺失，但在真正木通種中存在'GAAAC '(即圖 4a中的堿基421-425 ),被稱(chēng)為分子標(biāo)記7;
(2) 在馬兜鈴品種中缺失，但在真正木通種中存在'TTTGAG'(即 圖4a中的堿基608-613 ),被稱(chēng)為分子標(biāo)記8 。
實(shí)施例3 :防己
根據(jù)中華人民共和國(guó)藥典(2005年版)，防己來(lái)自粉防己(Stephania tetrandra)，而且有時(shí)摻雜了廣防己(Aristolochia fhagchi)及相關(guān)馬兜鈴 種，其中含有致癌的馬兜鈴酸。防己也會(huì)與來(lái)自Cocculus trilobus及相關(guān) Cocculus物種的木防己混淆。trnL - trnF序列(如圖5a和5b所示)及psbA -tmH序列(如圖6a和6b所示)可以用來(lái)區(qū)分馬兜鈴物種與其他用作防 己的植物物種。
通過(guò)對(duì)照馬兜鈴的trnL - trnF序列和那些真正的防己種的trnL - trnF 序列(如圖5a和5b所示)，4艮清楚，有許多分歧，較為突出的分歧如下 列所述
(1 )在馬兜鈴品種中為'GTGGGA '，但在真正的防己種中為 'AAAGGA '(即圖5a中的堿基298-303 )，被稱(chēng)為分子標(biāo)記9;(2)在馬兜鈴品種中為'GTACTGAAATA '，但在真正木香種中為 'ATAATA'(即圖la中的堿基367-377 )，被稱(chēng)為分子標(biāo)記2 。
同樣地，對(duì)照馬兜鈴的psbA-tmH序列與那些真正木香物種的psbA -trnH序列(如圖2a及2b所示)，顯示有不少分歧點(diǎn)；更為突出的分歧 如下所示
(1 )在馬兜鈴品種中為'GAAGGA'，但在真正木香種中為 'GAACTAAAAAAGGA'(即圖2a中的堿基106-119 ),被稱(chēng)為分子標(biāo)記3 ; (2 )在馬兜鈴品種中為'CAGG'，但在真正木香種中為
AAAATAAAATATAGTAATAGTAGATAATACTAGATAATAGG '(即圖 2a中的堿基335-468 ),被稱(chēng)為分子標(biāo)記4 。
實(shí)施例2 :木通
根據(jù)中華人民共和國(guó)藥典(2005年版)，木通來(lái)自植物品種木通 (Akebia quinata )、三p十木通(Akebia trifoliata )、三p十木通(Akebia trifoliate var. australis)， 也可包括川木通(Clematis armandii)和鐵線蓮(Clematis montana)。木通有時(shí)摻雜了被稱(chēng)為關(guān)木通(Aristolochia manshuriensis )的 根部，其中含有致癌物質(zhì)馬兜鈴酸。trnL-trnF序列(如圖3a及3b所示) 及psbA-trnH序列(如圖4a和4b所示)可以用來(lái)區(qū)分真正的木通和摻 雜種的木通。雖然木通(Akebia quinata )的trnL - trnF片l殳的序列(GenBank 登錄AY651844; AF335297)，三葉木通(Akebia trifoliata)的trnL -加F 片段的序歹'J ( GenBank登錄AF335294 )及關(guān)木通(Aristolochia manshuriensis)的trnL - trnF片段的序列(GenBank登錄AY689184 )已 經(jīng)分別由三個(gè)獨(dú)立的研究小組(即Quandt等人于2004年；Wang等人于 2002年；Neinhuis等人于2005年)發(fā)表用于系統(tǒng)發(fā)育研究，但這些序列 從來(lái)沒(méi)有被考慮過(guò)任何用作鑒定的目的。
ii(2) 在馬兜鈴品種中為'ATCGACTATCA '，但在真正防己種中為 'ATCAGTCA'(即圖5a中的堿基479-489 ),被稱(chēng)為分子標(biāo)記10;
(3) 在馬兜鈴品種中為'TTTTTCACTTACT',但在真正防己種中為 TTTCTCGTTCACT '(即圖5a中的堿基764-776 )，被稱(chēng)為分子標(biāo)記11;
(4) 在馬兜鈴物種中為'TCCATATATGG ',但在真正防己種中為 'TCT'(即圖5a中的堿基868-878 )，被稱(chēng)為分子標(biāo)記12;
(5) 在馬兜鈴品種中為'ATT'，但在真正防己種中為'ATTCCAAGG' (即圖5a中的堿基981-988 )，被稱(chēng)為分子標(biāo)記13;
(6) 在馬兜鈴品種中為'TAGTAGGA ',但在真正防己種中為 'TATGGGGA'(即圖5a中的堿基1096-1103 )，被稱(chēng)為分子標(biāo)記14 。
同樣，通過(guò)對(duì)照馬兜鈴的psbA - trnH序列與那些真正的防己種的 psbA-tmH序列(如圖6a和6b所示)，明顯存在許多分歧，較為突出的 分歧如下列所述
(1 )在馬兜鈴品種中為'CGT'，但在真正防己種中為'CGTTGAA'(即 圖6a中的堿基102-108)，稱(chēng)為分子標(biāo)記15;
(2 )在馬兜鈴品種中缺失，但在真正防己種中存在 'GTTTCCCGACATC '(即圖6a中的堿基385-397 ),稱(chēng)為分子標(biāo)記16 。
實(shí)施例4:白英
根據(jù)中華人民共和國(guó)藥典(1977年版)，白英來(lái)自茄科植物白英 (Solanum lyratum)。 而且有時(shí)摻雜了尋骨風(fēng)(Aristolochia mollissima)， 后者含有致癌物質(zhì)馬兜鈴酸。trnL-trnF序列(如圖7a及7b所示)和psbA -trnH序列(如圖8a及8b所示)可以用來(lái)區(qū)分真正的白英與摻雜的品種。
對(duì)照馬兜鈴的trnL - trnF序列和那些真正的白英物種的trnL - trnF序 列(如圖7a及7b所示)，顯示有許多分歧，較為突出的分歧如下列所述 (1 )在馬兜鈴品種中為'TAAAAA '，但在真正白英種中為 ，TAACAAAAA '(即圖7 a中的堿基94-102 ),被稱(chēng)為分子標(biāo)記17;(2)在馬兜鈴品種中為'GAAATA ',但在真正白英種中為 'GAATACTATA '(即圖7 a中的堿基370-379 ),被稱(chēng)為分子標(biāo)記18;
(3 )在馬兜鈴品種中為'ACTGTG ',但在真正白英種中為 'ACAAGCCTTTATG '(即圖7a中的堿基827-839 )，被稱(chēng)為分子標(biāo)記19;
(4)在馬兜鈴品種中為'TTTATTTAGGTAAGTTA',但在真正白英 種中為'TTTGAGAAAATTTTTTA '(即圖7a中的堿基991-1007 )，被 稱(chēng)為分子標(biāo)記20;
(5 )在馬兜鈴品種為'GAGAAT ',但在真正白英種中為 'GAGATTGGAAT '(即圖7中的堿基1108-1119a)，被稱(chēng)為分子標(biāo)記210。
同樣，通過(guò)對(duì)照馬兜鈴的psbA - tmH序列與那些真正白英的psbA -trnH序列(如圖8a及8b)，顯然有許多分歧，較為突出的分歧如下列所 述
(1 )在馬兜鈴品種中為'GAAGGA ',但在真正的白英種中為 'GAAAAGAAAGG'(即圖8a中的堿基106-117),稱(chēng)為分子標(biāo)記22;
(2)在馬兜鈴品種中缺失，但在真正白英種中存在 TGTTCCTCTTGTTGCTAAT GTTACTATATCTTTTTTATTTCATTTC
(即圖8a中的堿基327-419),稱(chēng)為分子標(biāo)記23;
(3 )在馬兜鈴品種中缺失，但在真正白英種中存在
CTTTA '(即圖8a中的堿基434-483 )，稱(chēng)為分子標(biāo)記24 。
實(shí)施例5 :馬兜鈴
根據(jù)中華人民共和國(guó)藥典(2005年版)，馬兜鈴來(lái)自植物物種馬兜 鈴Aristolochia contorta和Aristolochia debilis ,其中含有致癌物質(zhì)馬免鈴 酸，因此必須使用得更審慎。它的替代品包括大百合(Cardiocrinum giganteum)和相關(guān)的百合科植物。tmL - tmF序歹'J (如圖9a及9b )和psbA-trnH序列(如圖10 a和10b )可以用來(lái)區(qū)分真正的馬兜鈴物種和馬兜 鈴的替代物種。
通過(guò)對(duì)照馬兜鈴的trnL - trnF序列與那些大百合物種的trnL - trnF序 列(如圖9a及9b),顯然有許多分歧，較為突出的分歧如下列所述
(1) 在馬兜鈴品種中為'TTTCACAAA ',但在大百合物種中為 'TTTAGTCTC '(即圖9 a的堿基807-815 ),稱(chēng)為分子標(biāo)記25;
(2 )在馬兜鈴種中為'TACGTACAAATGCCCATCCATATATGG '， 但在大百合物種中缺失(即圖9a中的堿基865-891 )，稱(chēng)為分子標(biāo)記26 。
同樣，通過(guò)對(duì)照馬兜鈴的psbA - tmH序列與那些大百合種的psbA -trnH序列(如圖10a和10b)，明顯地存在許多分歧，較為突出的分歧如 下列所述
(1 )在馬兜鈴品種中為'CG ',但在大百合種中為'CATTCT '(即圖 10a中的堿基82-87),被稱(chēng)為分子標(biāo)記27;
(2) 在馬兜鈴品種為'TACCCAA ',但在大百合物種中為
圖10a中的堿基120-164 )被稱(chēng)為分子標(biāo)記28;
(3 )在馬兜鈴品種中為'AAGG '，但在大百合物種中為 'AAGCTAAAATCTTTT AGCTAGA '(即圖10a中的堿基412-433 )被稱(chēng) 為分子標(biāo)記29 。
實(shí)施例6 :朱石少蓮
據(jù)"關(guān)木通腎毒性研究"，朱砂蓮來(lái)自Aristolochiakaempferi和相關(guān)的 物種。它的替代品包括來(lái)自被成為薯莨(Dioscorea cirrhosa)的根部以及 Dioscoreaceae科的相關(guān)物種。trnL - trnF序列(如圖1 la和11 b )和psbA -trnH序列(如圖12a及12b)可以用來(lái)區(qū)分真正的朱砂蓮和朱砂蓮的替 代物種。
14通過(guò)對(duì)照馬兜鈴的trnL - trnF序列和薯萊物種的trriL - trnF序列(如 圖lla和llb)，顯然有許多分歧，較為突出的分歧如下列所述
(1 )在馬兜鈴品種中為'ATCCTGTT ',但在薯莨中為 'ATCTTTATTTGTT TTGTT '(即圖lla中的堿基118-135 )，被稱(chēng)為分子 標(biāo)記30;
(2)在馬兜鈴品種中為'TCAGAAGCAGA '，但在薯萊中為 TCAACCGAAGTTGA'(即圖1 la中的堿基471-484 )，被稱(chēng)為分子標(biāo)記 31;
(3 )在馬兜鈴品種中為'ATCGACTATCACACCAGA '，但在薯策中 為'ATCATTGATTCTAGA '(即圖lla中的堿基512-529 )，被稱(chēng)為分子 標(biāo)記32;
(4)在馬兜鈴品種中為'TGCATCGAGAATGGTCGG'，但在薯萊中 為'TGCGAGAAAAGAAAATGGTTGGG '(即圖lla中的堿基1074-1098) , ^皮稱(chēng)為分子標(biāo)記33 。
同樣，通過(guò)對(duì)照馬兜鈴的psbA - trnH序列與那些薯莨的psbA - trnH 序列(如圖12a及12b),顯然有許多分歧，較為突出的分歧如下列所述
(1 )在馬兜鈴品種中為'ACCTGGC '，但在薯莨中為'ACTTAGC '(即 圖12a中的堿基38-44)，稱(chēng)為分子標(biāo)記34;
(2 )在馬兜鈴品種中為'ATACCCAAT ',但在薯萊中為 'ATATCAATA'(即圖12 a中的堿基115-123 ),稱(chēng)為分子標(biāo)記35 。
當(dāng)把上述6個(gè)中草藥例子中的所有序列排在一起，可以發(fā)現(xiàn)，在一般 情況，當(dāng)與木香、木通、防己、白英、大百合和朱砂蓮的其他植物種比較 時(shí)，馬兜鈴的trnL - trnF片段具有表征馬兜鈴屬的特定的序列片段(如圖 13)。特征片段的一些例子如下
(1 )馬兜鈴種的'AGTGGGATG'(即圖11中的堿基313-321 )，稱(chēng) 為分子標(biāo)記36;
(2)馬兜鈴種的'AATTTCAGAAG'(即圖11中的堿基472-482), 稱(chēng)為分子標(biāo)記37;(3)馬兜鈴種的'ACTATCACACC'(即圖11中的堿基525-535 )， 稱(chēng)為分子標(biāo)記38 。
同樣，當(dāng)與木香、木通、防己、白英、大百合和朱砂蓮的其他植物種 比較時(shí)，馬兜鈴的psbA - trnH片段具有表征馬兜鈴屬的特定的序列片段 (圖14)。其中一個(gè)例子是
(1 )馬兜鈴種的'CTCAATTCACTA '(即圖12中的堿基172-183 ), 稱(chēng)為分子標(biāo)記39 。
在上述情況中，每個(gè)分子標(biāo)記(即分子標(biāo)記1-39 )包含許多序列， 每一個(gè)序列用于在相應(yīng)的附圖中所定義和對(duì)照的特定物種。每一個(gè)分子標(biāo) 記的各序列具有相同或不同的長(zhǎng)度，還在相應(yīng)的圖有詳細(xì)說(shuō)明。
前述實(shí)施例所舉例的本發(fā)明的方法在很多情況下可用于確定在植物 藥或草藥產(chǎn)品中是否存在馬兜鈴，該方法通過(guò)以下步驟從所關(guān)注的樣品
中提取總DNA，然后利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增trnL - trnF片段 和/或psbA - tmH片段，然后進(jìn)行DNA序列測(cè)定。通過(guò)將所獲得的trnL -trnF序列和/或psbA - tmH序列與馬兜鈴材料的tmL - trnF和psbA -trnH序列進(jìn)行比較和匹配，便知道相匹配的樣品屬于馬兜鈴。如前述的例 子示范，在trnL-trnF片段及psbA-trnH的片段內(nèi)有許多表征馬兜鈴屬 植物的序列片段。在特定情況下，可不必?cái)U(kuò)增整個(gè)trnL-trnF片段和/或整 個(gè)psbA - trnH片段，而只需要擴(kuò)增和測(cè)序trnL - trnF片段和/或psbA - trnH 片段中的部分片段就足以在特定情況下達(dá)到某一特定目的。
對(duì)于trnL - trnF片段的PCR和DNA序列測(cè)定而言，正向引物是Tab C ( 5 '畫(huà)CGAAATCGGTAGACGCTACG -3 '),反向引物是Tab F ( 5'-ATTTGAACTGGTGACACGAG -3 ')。對(duì)于psbA - tmH片革殳的PCR和 DNA序列測(cè)定而言，正向引物是(5 ' - GGTATGCATGAACGTAATGCTC -3'),反向引物是(5 ' - CGCGCATGGTGGATTCACAAATC-3 ')。盡管本發(fā)明僅描述和指出了用于優(yōu)選實(shí)施方式的基本的新特征，但 是，可以理解，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在不偏離本發(fā)明的精神的前提下，可 以對(duì)所舉例說(shuō)明的工藝和方法的形式和細(xì)節(jié)進(jìn)行各種省略、替換或者變 化。對(duì)于以實(shí)質(zhì)上相同的方式執(zhí)行實(shí)質(zhì)上相同的功能從而取得實(shí)質(zhì)上相同
本發(fā)明不僅限于僅用作示例的上述實(shí)施方式，在所附的權(quán)利要求書(shū)所 限定的保護(hù)范圍之內(nèi)可以通過(guò)各種方式對(duì)上述實(shí)施方式進(jìn)行變化。
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〈150〉 US 11/738,754
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〈210〉 1 〈210 : 1031 〈212〉 DNA 〈213〉植物
〈223〉青木香(Jn'Wo/oc/z/a flfe&fo)的/r"L-fr"F片段 〈400〉 1
<formula>formula see original document page 20</formula>GTCAATACTGACMCMTGAAATITCTAGTAAGAGGAAAATCCGTCGACnTAGAAATCG TCAGGGTrCMGTCCCTCTATCCCCAATAAAATAAAAATCCCCAATAAAATAAAAGGCCT ArnTACTCCCTMGCATTTATCCTCrmTmTCATCAGTGGTTCAAAATrAGATTAG ATATGrmTCACnACTCTACTCnTCACAMTGGATCCAACCTGAAATCTTTCTCTCT TCTCACTGTGATAGATATGATCTACGTACAAATGCCCATCCATATATGGATGGGCAAAGA ATCTCTATrACGGAACCCTrCGCAGnCATATCATTACTCTTACACITCCATITACAAAG TCTCCCTnTGAAGATCCAAGAAATTACCGACnTAnTAGGTMGITMTGCnnTGA GTACrnTCATTGACATAGACCCMGCCmTCTTTTAGTAGGATCATGCATGGAGMTG GTCGGGATAGCTCAGCTGGTAGAGCAGAGGACTGAMATCaCGTGTCACCAGTTCAAAT
〈210> :3 〈211〉 986 〈212〉 DNA 〈213〉植物
〈223〉廣防己G4n'Wo/oc/ z'a/a"gcW)的/r"L-fr"F片段 〈400〉 3
CGAMTCGGTAGACGCTACGGACTTGATTGGATTGAGCCTrGGTATGGAAACCTACTAAG
TGGTAACTrCCAAAnCAGAGAGACCCTGGAATTAAAAATGGGCMTCCTGAGCCAAATC
CTGTnTCAGAAAMAAAAGGATAGGTGCAGAGACTCAACGGAAGCTGTTCTAACGAATG
GGGTrGACnTACTACAlTGGTAGAAGMTCCITCTATCGAAACTCCAGAGTGGGATGAC
CCTAGATATGTACGTATACGTACTGMATATCAAAGATTAATCACGACCCGMTCCATAT ,rnTm.nTCTAAAMrrrCAGMGCAGMGGMGMTCGMTAGTCAGTGATCAMTC
GACTATCACACCAGAGTCTGATAGATCnTnMGGATTGATTAATCGAGTGAGACGAGA AT嵐GATAGAGTCCCATrCTACATGTCAATACTGACAACMTGAAATTTATAGTMGAG GAAAATCCGTCGACnTAGAAATCGTGAGGGTTCAAGTCCCTCTATCCCCMTAAAATAA AAATCCCCAATAAAATAAAAGGCCTArnTACTCCCTAAGCATTTATCCTa'lTiTlT丄T TCATCTGTGGrrCAAMTTAGATrAGATATGrnTTCAOTACTCTACTCnTCACAAAA GGATCCMCCTGAAATCnTCTCTCTTCTCACTGTGATAGATATGATCTACGTACAAATG CCCATCCATATATGGATGGGCAMGAATCTCTATTACGGAACCCTTCGCAGTrCATATCA TrACTaTACACTTCCATTrAC嵐GTCTCCCTnTGMGATACAAGAAATTAACGACTT TATITAGGTAAGTrAATGCTnTTGAGTACrnTCATrGACATAGACCCAAGCCrnTCT TITAGTAGGATCATGCATCGAGMTGGTCGGGATAGCTCAGCTGGTAGAGCAGAGGACTG AAAATCCTCGTGTCACCAGTTC嵐T
〈210〉 4 〈211〉 957 〈212〉 DNA 〈213〉植物
〈223〉:馬兜鈴C4n'加/oc/n'"麵; /e"')的亂-加F片段 〈400〉 4
CGAMTCGGTAGACGCTACGGACnGATTGGATTGAGCCTTGGTATGGAMCCTACTAAG TGGTAAdTCCAAATrCAGAGAAACCCTGGAATTGAAAATGGGCMTCCTGAGCCAAATC CTGTnTCAGAAAAAAAAAAGGATAGGTGCAGAGACTCMCGGMGCTGTTCTMCGAAT GGGGTTGACnTACTACATTGGTAGAAGAATCaTCTATCGAAACTCCAGAGTGGGATGA CCCTACGTATGTACGTATACGTACTGAAATATCAAAGATTAATCACGACCCGAATCCATA Tl'iTi'ri'i'i'CTAAAAATITCAGAAGCAGAAGGAAGAATCGMTAGTCAGTGATC嵐TCG ACTATCACACCAGAGTCTGATAGATCnTTTMGGATTGATTAATCGAGTGAGACGAGAA TAAAGATAGAGTCCCATTCTACATGTCAATACTGACAACMTG嵐TTTATAGTAAGAGG AAAATCCGTCGACTTTAGAAATCGTGAGGGTTCMGTCCCTCTATCCCCAATAAAAGGCC TATnTACTCCCTMGCAnTATCCTCn'i'n'iTnT丄'ATCCGTGGTTCAAAAlTAGATA TGTTnTCACTTACTCTACTCnTCACAAATGGATCCGGCCAGAAATCnTCTCTCITCT CACTGTGATAGATATGATATACGTACAMTGCCCATCCATATATGGATGGGCAAAGAATC TCCATTACGGAACCnTCACAGTrCATATCATTACTCnACAOTACATTTACAAAGCCT CCTTnTGAAGATCCAACAAATTACCGACnTAnTAGGTAAGTrAATGOTnTAAGTC
21CCnTCATrGACATAGACCCAAGCTmTCmTAGTAGGATCATGCATCGAGAATGGTC GGGATAGCTCAGCTGGTAGAGCTGAGGACTGAAAATCCTCGTGTCACCAGTTCAMT
〈210〉 5 〈211〉 984 〈212〉 DNA 〈213〉植物、
〈223〉關(guān)木通(/4W加/oC附a"sAw/"/era/j)的,a""L-,a"mF片段 〈400〉 5
CGAAATCGGTAGACGCTACGGAOTGATTGGATTGAGCaTGGTATGGMACCTACTMG TGGTAAaTCCAAATTCAGAGAMCCCTGGMTTAMAATGGGCAATCCTGAGCCAAATC CTGrnTCAGAMAAAAAMGGATAGGTGCAGAGACTCAACGGAAGCTGTTCTAACGTCT AACGAGMGCTGTTCTMCGAATGGGGTTGACnTACTACATrGGTAGMGMTCaTCT ATCGAAACTCCAGAGTGGGATGACCCTAGATATGTACGTATACGTACTGAAATATCAMG ATrAATCATGACCCGAATCCATA'i'iT丄Ti'i'lTCTATGATAAAAAnTCAGAAGCAGMGG AAGAATCGAATAGTCAGTGATC嵐TCGACTATCACACCAGAGTCTGATAGATCnnTA AGGATTGATTMTCGAGTGAGACGAGAAAAAAGATAGAGTCCCATTCTACATGTCAATAC TGACAACAATGAAAnTATAGTMGAGGAAAATCOGTCGACnTAG嵐TCGTGAGGGTT CAAGTCCCTCTATCCCCMTAAAAGGCCTATnTACTCCCTMGCATrTATCCTCnnT TTnTATCAGTGGTTCMAATrAGATATGTmTCACnACTCTACTCTITCACAAATGG ATCCGGCCAGAAATCnTCTCTCTTATCACTGTGATAGATATGATATACGTACAAATGCC CATCCATATATGGATGGGCAAAGMTCCTCATTACGGAACCnTCACAGTTCATATCATT ACTCTTACACTTACAnTACAAAGTCTCCnnTGAAGATCCAACAAATTACCGACnTA nTAGGTAAGTTMTGCTnTTGAGTCCCnTCATrGACATAGACCCAAGaTnTCnT TAGTAGGATCATGCATCGAGMTGGTCGGGATAGCTCAGCTGGTAGAGCAGAGGACTGAA MTCCTCGTGTCACCAGTTC嵐T
〈210〉 6 〈211〉 956 〈212〉 DNA 〈213> :植物
〈223〉:尋骨風(fēng)(Jn'Wo/oc/n'a wo/fos/附a)的fr"L-fr"F片段 〈400〉 6
CGAAATCGGTAGACGCTACGGAClTGATTGGATrcAGCaTGGTATGGAAACCTACTAAG TGGTAACTrCCAAATTCAGAGAMCCCTGGAATTAAAAATGGGCAATCCTGAGCCAMTC CTGTnTCAGAMAAAAAAAGGAT八GGTGCAGAGGCTCAACGGAAGCTGTTCTAACGAAT GGGGTTGACnTACTACATTGGTAGAAGAATCCnCTATCGAAACTCCAGAGTGGGATGA CCCTAGATATCTACGTATACGTACTGAAATATCAAAGATTAATCACGACCCGMTCCATA Ti'丄TlTlTi'CTAAAAATTTCAGAAGCAGAAGGAAGAATCGAATAGTCAGTGATC嵐TCG ACTATCACACCAGAGTCTGATAGATCTmTAAGGATTGATTAATCGAGTCAGACGAGAA TAAAGATAGAGTCCCATTCTACATGTCAATACTGACAACMTGAAAnTATAGTAAGAGG AAAATCCGTCGACnTAGAAATCGTGAGGGTTCMGTCCCTCTATCCCCMTAAAAGGCC TATnTACTCCCTAAGCAnTATCCTCn'n'n'n'n'ATCAGTGGTTCAAAATTAGATAT GrmrCACnACTCTACTCnTCACAAATGGATCCGGCCAGAAATCnTCTCTCTTCTC ACTGTGATAGATATGATATACGTACAAATGCCCATCCATATATGGATGGGCAMGAATCT CCATrACGGMCCnTCACAGTTCATATCATTACTCTTACACTrACATITACAAAGTCTC CTTnTGMGATCCAACAAATTACCGACnTATITAGGTAAGTr嵐GaTnTAAGTCC CnTCATTGACATAGACCCAAGCrnTTCmTAGTAGGATCATGCATCGAGAATGGTCG GGATAGCTCAGCTGGTAGAGCAGAGGACTGAAAATCCTCGTGTCACCAGTTCAAAT
〈210〉 7 〈211〉 964 〈212〉 DNA〈213〉植物
〈223> :木香(Jz/cWa"Jz'a/appa)的^"L- r"F片段 〈400> :7
CGAMTCGGTAGACGCTACGGACTrAATrGGATTCAGCCITGGTATGGAAACTTACTAAG TGATAACnTCAAATTCAGAGAAACCCTGGMlTAATAAAAATGGGCMTCCTGAGCCM ATCACGTnTCCGAAAAC雄CAAAGGlTCAG嵐GCGAAAATAAMAAGGATAGGTGCA GAGACTCGATGGAAGCTGlTCTAACGAATGGAGnGAlTGTaTACGTrGGTAGAGGAAT CCTTCTATCGAAACTTCATAMAGATGAAGGATAAACCTGTATACATAATATAGAAGAAT TGTTGTGAATCGATTCCG嵐GAATCGMTATTCATTGATCAAACAAnCACTCCATAAT CTGATAGATCTnTGAAGAACnATTMTCGGACGAGAATAMGATAGAGTCCCGTrCTA CATGTCMTACCGGCAACAATGAAAnTATAGTAAGAGGAAMTCCGTCGATTTAAAAM TCGTGAGGGTTCAAGTCCaCTATCCCCMTAAAATAAAMTCCCCAATAAAATAAAAGG CCTATnTACTCCCTMGCATITATCaa'丄Ti'iTr丄'丄'l'CATCAGTGGTrCAAAATTAGA TTAGATATGTTnTCACTTACTCTACTCnTCACAAAAGGATCCAACCTGMATCnTCT CTCITCTCACTGTGATAGATATGATCTACGTACAAATGCCCATCCATATATGGATGGGCA MGMTCTCTATTACGGAACCaTCGCAGTrCATATCAnACTCTTACACTTCCATITAC AAAGTCTCCCTnTGMGATACAAGAAATTMCGACTTTAnTAGGTMGTTAATGCnT TTGAGTACnnTATTGACATAGACCCAAGCCrnTCrnTAGTAGGATCATGCATCGAG AATGGTCGGGATAGCTCAGCTGGTAGAGCAGAGGACTGAAAATCCTCGTGTCACCAGTTC 嵐T
〈210〉 8 〈211〉 963 〈212〉 DNA 〈213〉植物
〈223〉灰毛川木香(K/WmzWa var./m'ra6/fc)的化"L-加F片段
〈400〉 8
CGAAATCGGTAGACGCTACGGACITAATrGGATTGAGCCTTGGTATGGAAACnACTAAG TGATMCTTTCAAAnCAGAGAAACCCTGGAATTMTAAAMTGGGCAATCCTGAGCCM ATCACGrnTCCGAAAACAAACAMGGTTCAGAAAGCGAAMTCAAAAAGGATAGGTGCA GAGACTCGATGGMGCTGTTCTMCGAATGGAGTTGATrGTOTACGTTGGTAGAGGAAT CCTTCTATCG嵐CITCATAAAAGATGAAGGAT嵐CCTGTATACATMTATAGMGMT TGTTGTGAATCGATrCCATATTGAAGAAAGAATCGAATATrCATrGATCAAACMTrCAC TCCATAATCTGATAGATCTnTGMGAAOTATrMTCGGACGAGMTAMGATAGAGTC CCGTTCTACATGTCMTACCGGCMCAATGAAAnTATAGTMGAGGAAMTCCGTCGAT TrAAAAAATrGTGAGGGTrCAAGTCCCTCTATCCCCAAAAATACCATITGACTCCCTMT TATrraCGTATCCTmTAnTATnTATCC'nTlT丄'CCTrAGCGGTTCAAAATTCCTr ATCmTCnTCTCATrCACTACTCnTATACATCATTCTCTGCTCnTATACAAATGGA TCTGAGCGGAAATGCTGTTCTOTATCACATGTGATATATATGATACATGTAC嵐TGAA CATCnTGAGCAAGGAATCCCCATITGAATGATrCACGATCGATATTnTATrCATACTG AAACTTACAAAGTTGTTCTnTGACAAATTATAGGACCTGGATGAGGCnTGTAATACCC TITCAA1TGACATAGACCCAAGTTATCTAGTAAAATGAAAGTGAGGATGAGACATCAGGA ATAGTCGGGATAGCTCAGTTGGTAGAGCAGAGGACTGAAAATCCTCGTGTCACCAGTTCA AAT
〈210〉 9 〈211〉 1010 〈212〉 DNA 〈213〉植物
〈223〉木通(i6—w'M她)的fr"L-fr"F片段 〈400〉 9
CGMATCGGTAGACGCTACGGACTTGAATGGATTGAGCCTTGGTATGGAAACCTACTAGG TGATMCnTCAAATTCAGAGAAACCCTGGMTGAAAMTGGGCAATCCTGAGCCAAATCCTGTnrCAGAAAAAAAAAGGTTCAGAAAGCGAGATTAAAAAAATAAAGGAAGGATAGGT GCAGAGACTCMTGGAAGCTGnCTMTGMTGGAGTTGGCTGCGTTGCGTrCGTAGAGG AATCCTTCTATTGAAACTCCAGAAAGGATGAAGGATGAACCTATATACGTACGTATACGT ACTGAAATATCAAAAGAnMTGACGATCAAAATArnTmTATATGAAAAACGGMGA ATTATTGTGAATCAATTTCAAGTrGMGGAAAAATCGAATATrCACTGATCAAATCAGTC ATTCCATAGTCTGATAGATCTnTGAAGMCTGACTMTCGGACGAGAATAAAGATAGAG TCCCATTCTACATGTCAATACCGACAATAATG磁nTATAGTAAGAGGAAAATCCGTCG ACnTAGAAATCGTGAGGGTTCAAGTCCaCTATCCCCAAGAAAAAGGCCCGTnTACTC aTAACTATACTATGTrATCC'丄Tn.iT丄'GTCAGCGGTTCCAAATTCGCTAAGnTCTCAT TCACTCCACTCTTTCACAAATGGATCGGAGCATAMTGTITCTaaTATCACAAGTCAA GTCITGTGATATATACGTACAAATGCACACCTATGAGCAAGGAATCCCCATrrGMTCAT TTAAnTACAGTCCATATGAnTACTrAAAaTACAAAGTTACAMGTCnUnTTTGM GATGCAAG組TTCCCGGGCCTGGGTACGACnTGTAATGCrn'lT丄GAATCTCnTAAT TCACAT嵐CTCMGCCCTCTAGTGGTATAGAGATGATGCATCGGGAAAGGTCGGGATAG CTCAGCTGGTAGAGCAGAGGACTGAAAATCCTCGTGTCACCAGTTCAAAT
〈210〉10
〈211〉1010
〈212〉DNA
〈213〉植物
〈223〉三葉木通
〈400〉10
的^T7L-^"F片段
CGAAATCGGTAGACGCTACGGAOTGATTGGATTGAGCaTGGTATGGAAACCTACTAAG TGATAACnTCAAATTCAGAG嵐CCCTGGAATGAAAMTGGGCMTCCTGAGCCAAATC CTGTnTCAGAAAAMAAAGGTrCAGAAAGCGAGATTAAAAAAATAAAGGATGGATAGGT GCAGAGACTCMTGGAAGCTGITCTAACGAATGGAGlTGGCTGCGrrGCGITCGTAGAGG MTCOTCTATTGAAACTCCAGAAAGGATGAAGGATGAACCTATATACGTACGTATACGT ACTGAAATATCAAAAGATTAATGACGATCAAAATATnTTnTATATGAAMACGGMGA AnAlTGTGAATCMTTrCAAGCTGMGGAMAATCGAATATTCACTGATCAAATCAGTC ATTCCATAGTCTGATAGATCTnTGMGAACTGACTMTCGGACGAGMTAAAGATAGAG TCCCATTCTACATGTCAATACCGACMTAATGAAATITATAGTAAGAGGAAAATCCGTCG ACnTAGMATCGTGAGGGTrCMGTCCCTCTATCCCCAAGAAMAGGCCCGTnTACTC CTTAACTATAaATGTTATCCnTn'iTGTCAGCGGlTCCAAArrCGCTAAGnTCTCAT TCACTCCACTCnTCACAAATGGATCGGAGCATAAATGnTCTCTOTATCACMGTCM GTCTTGTGATATATACGTACAAATGCACACCTATGAGCAAGGAATCCCCAnTGAATCAT TTAAnTACAGTCCATATGATTTACTr嵐OTACAAAGTTACAAAGTCTTCnnTGAA GATGCAAGAMITCCCGGGCCTGGGTACGACnTGTMTGCnTnTGAATCTCTTTAAT TGACATAAACTCAAGCCCTCTAGTAGTATAGAGATGATGCATCGGGAAAGGTCGGGATAG CTCAGCTGGTAGAGCAGAGGACTGAAAATCCTCGTGTCACCAGTTCAAAT
〈210〉 11 〈211〉聽(tīng) 〈212〉 DNA 〈213〉竺物
〈223> :三葉木通(Jfe6Za的/o/z'ato var. awWrafo)的fr"L々"F片段 〈400> :11
GG嵐TCGGTAGACGCTACGGAOTGATTGGAITGAGCCTTGGTATGGAAACCTACTMG TGATMCnTCAAATTCAGAGAAACCCTGGMTGAAAAATGGGCAATCCTGAGCCAAATC CTGTnTCAGAAAAAAAAAGGTrCAGAAAGCGAGATTAAAAAMTAAAGGAAGGATAGGT GCAGAGAaCAATGGAAGCTGTrCTMCGAATGGAGTTGGCTGCGTTGCGTTCGTAGAGG MTCCTTCTATTG嵐CTCCAG嵐GGATGAAGGATGAACCTATATACGTACGTATACGT ACTGAAATATCAAAAGATTAATGACGATCAAAATAITCTnTATATGAAAAACGGAAGAA TTATrGTGAATCAAnTCAAGTTGAAGGAAAAATCGAATATTCACTGATCAMTCAGTCA TTCCATAGTCTGATAGATCTnTGMGAACTGACTAATCGGACGAGAATAAAGATAGAGTCCCATTCTACATGTCMTACCGACAATAATGAAATTTATAGTMGAGGAAAATCCGTCGA CnTGGAMTCGTCAGGGnCAAGTCCCTCTATCCCCAAGAAMAGGCCCGTnTACTCC nAACTATACTATGnATCCrnTnTGTCAGCGGTTCCAAATTCGCTAAGTITCTCArr CACTCCACTCnTCACAAATGGATCGGAGCATAAATGnTCTCTCTTATCACAAGTCAAG TCrTGTGATATATACGTAC嵐TGCACACCTATGAGCAAGGAATCCCCATITGAATCAIT TMnTACAGTCCATATGAnTAOTAAAaTACAAAGmCAAAGTaTCnnTGATG ATGCAAGAMTTCCCGGGCCTGGGTACGACnTGTAATGCnTnTGMTCTCnTAATT GACATAAACTCAAGCCCTCTAGTAGTATAGAGATGATGCATCGGGAAAGGTCGGGATAGC TCAGCTGGTAGAGCAGAGGACTGAAAATCCTCGTGTCACCAGnCAAAT
〈210〉12
〈211〉779
〈212〉DNA
〈213〉植物
〈223〉鐵線蓮
〈400〉12
的/mL-fr"F片段
CGAAATCGGTAGACGCTACGGAOTGGlTGGATTGCAGCdTGCATATGGCAAACATACT AAGGTGATAACTTTCAAATTCAGAGAAACCCCGGMTAAAMATGGGCMTCCTGAGCCA MTCCTnTTTCAGAAAACAAAAGGGOTCAGAAAGCMGAATAAAMMAAAGGATAGG TGCAG織CTAAATGGAAGCTGTTCTAACGMTAGAGTTGACTGCGlTGATCGAGGArrC ClTCTAnT嵐CTACAGAAAGGATGAACCCGTATACATATAAAAATATMAAGATrAAT GACAATCAAAATArnTnTOTATATGATATGCAAAATGTAAGAArraTGTGATGTGA ATTCATTCAAAGnTAAGTAAGAATCGAATAlTCACTGATCAAATAAGTCACTCTATAAT CTGATAGATCrnTAAAGAACTMTTGGACGAGMTAAAGATAGAGTCCCATTATACATG TCAACATCMTACTGACAAAAATG嵐TITATAGTAAGAGGAAAATCCGTCGACnnTA AATCGTGAGGGnCAAGTCCCTCTATCCCCAAAAAAMGnTACTGTACCCCCCMCTAT
rrAGTrAArrMTTcn'n'n'n'no'n'nTCTMGACTrnTAATGcn'rnTAGTCT
ArnMrrGATATACCCAACMGCACTCTAAATAGAGTGGGGATGCCGCATCGAGMGAG TCGGGATAGCTCAGTTGGTAGAGCAGAGGACTGAAAATCCTCGTGTCACCAGTTCAAAT
〈210〉 13 〈211〉 776 〈212〉 DNA 〈213〉植物
〈223〉川木通(C/emafe wjo"ta"a)的fr"L-fr"F片段 〈400〉 13
CGAAATCGGTAGACGCTACGGAOTGGTTGGATrGAGCaTGATATGGAAACATACTAAG TGATAAOTTCAAATrCAGAG嵐CCCCGGMTAAAAAATGGGCMTCCTGAGCCMATC CnTnTCAGAAAACAAAAGGGOTCAGAAAGCAAGAATAAAAAAAAAGGATAGGTGCAG AGACTAAATGGAAGCTGTTCTMCGAATAGAGTTGACTACGTrGATCGAGGArrCCTrCT ATITAMCTACAGAMGGATGAACCCGTATACATATAAAAATATAAMGATrAATCACAA TCAAAATATTTTnTCTTATATGATATGCAAAATGTAAGAATTCTrGTCATGTGAATCGA TTCAAAGnTAAGTAAGAATCAAATA7TCACTGATCAAATAAGTCACTCTATAATCTGAT AGATCTnTAAAGMCTAATTGGACGAGAATAAAGATAGAGTCCCATTATACATGTCAAC ATCAATACTGACAAAAATGAAATTTATAGTAAGAGGAAAATCCGTCGACrnTTAAATCG TCAGGGTTCMGTCCCTCTATCCCCAAAAAAAAGTITACTGTACCCCCCAACTATrTAGT
TAATTMTTa'n'n'rrn'm'cnTn'rcTMGAcnTTTMTGcn'n'n'AGTCTAiT
TAAnGATATACCCAACAAGCACTCTAMTAGAGTGGGGATGCCGCATCGGGAAGAGTCG GGATAGCTCAGTTGGTAGAGCAGAGGACTGAAAATCCTCGTGTCACCAGTTCAAAT
〈210〉 14 〈211〉 1034 〈212〉 DNA
25〈213〉植物
〈223〉木防己(Coccm/us or6Zcw/aftw)的^"L-Zr"F片段 〈400〉 14
CGAAATCGGTAGACGCTACGGACTTGATTCGATrcAGCaTGGTATGGAMCCTACTAAG TGAAAACTTTCAAATTCAGAGAAACCCTGGAATTAAAAATGGGCMTCCTGAGCC嵐TC CTGrnTCAGAMACAAAAAAGAGrrCAGAAAGCGAGACTCAAAMTGGATAGGTGCAGA GACTCMTGGAAGCTGTTCTAACAAATGGAGTTGATrGCGlTGCGTrAGTAGAGTAATCC TTCTATTG嵐CTCCAGAAAGGATGAACTTATCTATATACATACGTCTACGTACTG嵐T ATCAAAGATrCATGATGATCCGAATCTGTAnTATGMAMTGGAAGAATTnTGTGAAT CMCTCCMGrTAAAGGMGAGTCGMCATTCACTGATCAMTCAGTCACTCCATAGTCT GATAGATCTnTGMGMCTGACTAATCGGACGAGMTAAAGATAGAGTCCCAlTCTACA TGTCMTACCGACAACAATG嵐nTATAGTAAGAGGAAAATCCGTCGACnTAGAAATC GTGAGGGTTCAAGTCCCTCTATCCCCAATAAAMTAAAAGGCCCACnTACTCCCTAATr AGTTATCCITGTATrcnTCTnTCGGCAGCAATrCAAAAmGCTATGnTCTCGrrCA CTCTACTCnTCACMATGGATCGGMGGGMG丁GTTTCTCTOTATCACMGTATTGTG ATATATACACTATACGTACAAATGAGCATCTATGGGCMGGMTCCCMnTGMTCATT CACAGTCCGTATCATrArnTAAACGTCMAAGTATTCTGnTGAAGATCCMGAMTTC CMGGACTGGGTAAAACnTGTTTrcTAATGCn'n'iTAGCCTCTTTATl'nT歸CTC nTMTCGACATAGGCCCMGAATTGACATAGGCCCMGCCCTCTAGTAGTATGGGGATG ATGCATCGAGAGGGGCCGGGATAGCTCAGTTGGTAGAGCAGAGGACTGMAATCCTCGTG TCACCAGTTCAAAT
〈210〉 15 〈211〉 1022 〈212〉 DNA 〈213〉植物
〈223〉防己OSte/^a"Za fe/ra"flfra)的&ml-fr"F片段 〈400〉 15
CGAAATCGGTAGACGCTACGGACTrGATrGGATTGAGCCTTGGT八TGG八TACCTACTAAG TGMAACnTCAAAlTCAGAGMCCCCTGGAATTAMAATGGGCAATCCTGAGCCAAATC CTGrnTCAGAAAACAMAAAGGGTTTAGMTAGGAGACTCAAAMTGGATAGGTGCAGA GACTCAATGGAAGCTGTTCTAAGAAATGGAGTTCAnGanTGCGlTAGTGGAGGAATCC TTCTATTG嵐CTCCAGTAAAGGATGAAOTATCTATATACATACGTCTACGTACTG嵐 TATCAMGAnCATGATGATCCGAATCTGTATTTATGAAAAATGGAAGAATITGTGTTTT TGTAAATCAATTCCAAGTrGAAGGAAGMTCGMCATrCACTGATCAAATCAGTCACTCC ATAGTCTGATAGGTCnTTGAAGAACTGACTMTCGGACGAGAATAAAGATAGAGTCCCA TTCTACGTGTCMTACCGACAACAATGAAAnTATAGTAAGAGGAAMTCCGTCGACnT AG嵐TCGTGAGGGTTCAAGTCCCTCTATCCCCMGAAAAATAAAAGGCCAATnTACTC
CCTAACGAGrrATa'rn'rn'n'n'n'n'cnTCTnTCGGCAGCAGTTCCAAATTCGCT
ATGTTTCTCGrrCACTCTACTCnTCCCAAACCAAATGGATGGGAAGAGAAATGTTTCTC TnTATCACAATACTTGTGATATATACGTACAAATGAGCATCTATGGGCAAGGAATCCCA AnTGMTCAnCACAGTCCGTATTATATTCTAATnTGAACGCCAAAAGTATTCTGTIT GATGMGATCCMGAAATTCCAAGMCTGGGTMGATnTGTnTGCMTGCrnnTAG TCTCTnMITGACATAGGTCCAAGCCCTCTAGCAGTATGGGGATGACGCATCGAGAGAG GGGCCGGGATAGCTCAGTTGGTAGAGCAGAGGACTGAAMTACTCGTGTCACCAGTTCM AT
〈210〉 16
〈211> :
〈212〉 DNA 〈213〉植物
〈223〉歐白英(So/a"ww t/w/ca附ara)的？r"L-fr"F片段
〈400〉 16CGAAATCGGTAGACGCTACGGACITAATTGGATrGAGCCrrcGTATGGAAACTrACTAAG TGATCACTTTC嵐rrCAGAGAAACCCTGGAATTMCAAAAATGGGCAATCCTGAGCCAA ATCCTGTnTCTGAAAACAMCAAAGGTTCAGAAAAAAAGGATAGGTGCAGAGACTCAAT GGMGCTATrCTAACAAATGGAAlTAAATGCGTrGGTAGAGGACTCnTACATCGAAACT TCAGAAAGAAAAAGMTGMGTGAAGGATAAACGTATATACATACGTATTGAATACTATA TCAAATGATTAATGACGACCCGAATCCGTAGTmTCTATAAAAAATCGMGAAnGGTG TGAATCCATTCTACAnGAAGAAAGAATCGAATAnCAlTGATCAAATCAnCACTCCAT AGTCTGATAGATCrnTGAAGAACTGAnMTCGGACGAGAATAAAGATAGAGTCCCGTT CTACATCTCMTACCGGCAACMTGAMnTCTAGTAMAGGAAAATCCGTCGACTTTM AAATCGTGAGGGTTCMGTCCCTCTATCCCCAAAAAGACTAnTAACTCCCCAACTATIT ATCCGACCCCCnTCCTrAGCGGTTGCAAATrCCTTATCnTATCATrCACTCTATTCTT TTAGAMTGGA'nT丄'丄TiTCTAAGCGTAAATGGrnTCTOTATAACAAGCCnTATGAT ATCTATGATACACATAAAAATGAACATCnTGAGCAAGGMTCCCTAGTTGAATGAnCC CGATCAATACAATATCATTACTCATACTGAAACTTACAAAGTCATCnTTTGAAGATCGA AGAAATTACCCGGnTGAGAAAA'n'lTn'AATCTACnTGTGTCCmTAArrGACATAG CCCCCAGnCTATGATAMATGAGGATACCACGC嵐GGACTAAAMTCCTCAGGTTAGC GGTTCCAATCGAGATrGGGMTAGCCGGGATAGCTCAGTTGGTAGAGCAGAGGACTGAM ATCCTCGTGTCACCAG1TCAAAT
〈210〉 17 〈211〉 1041 〈212〉 DNA 〈213〉植物
〈223〉白英(Soto"Mw/yra仏w)的/r"L-ZmF片段 〈400〉 17
CGAMTCGGTAGACGCTACGGACTrMTrGGArrGAGCClTGGTATGG嵐CTTACTAAG TGATCACnTC嵐TTCAGAGAAACCCTGGAATTMCAAAMTGGGCAATCCTGAGCCAA ATCCTGrnTCTGAMACAAACAAAGGTTCAGAAAAAMGGATAGGTGCAGAGACTCAAT GGMGCTATTCTAACAAATGGAGTTAAATGCGITGGTAGAGGACTCnTACATCAAAACT TCAGAAAGAAAAAGAATGMGTGMGGATAAACGTATATACATACGTAnGAATACTATA TCAMTGATTAATGACGACCCGMTCCGTAGrmTCTATMMAATCGAAGMTTGGTG TGAATCCATTCTACAnGAAGAAAGAATCGAATArrCArrGATCAAATCATrCACTCCAT AGTCTGATAGATCTnTGAAGAACTGATTMTCGGACGAGAATAAAGATAGAGTCCCGlT CTACATGTCAATACCGGCAACAATGAMTITATAGTAAMGGAAAATCCGTCGACnTAA AAATCGTGAGanTCAAGTCCCTCTATCCCCAAAAAGACTATITAACTCCCCAACTAnT ATCCGACCCCCnTCCTTAGCGGTTCCAAATTCCITATCnTaCATTCACTCTATTCTT TTAGAAATGGATiTiTn'CTMGCGTAAATGGrnTCTCTTATCACAAGCCnTATGATA TCTATGATACACATAGAAATGAACATCnTGAGCAAGGAATCCCTAGTTGAAAGATTCCC GATCAATACAATATCATrAOTATACTGAAAaTACMAGTCATCnnTGMGATCGAA GAAATrCCCCGGnTGAGAAAA'l'i'i'riTAATCTAmTAGTCCTnTAATrGACATAGAC CCCAGTTCTATGATAAAATGAGGATACCATGCAAAGGACTAAAAATCaCAGGTrAGCGG nCCAATCGAGATTGGGMTAGCCGGGATAGCTCAGTTGGTAGAGCAGAGGACTGAAAAT CCTCGTCTCACCAGTTCAMT
〈210〉 18 〈211〉 847 〈212〉 DNA 〈213〉植物
〈223〉:大百合(Cardiocrinum giganteum)的trnL-trnF片段 〈400〉 18
CGAAATCGGTAGACGCTACGGACITGArrAAATrGAGCCTrGGTATGGAAACCTGCTMG TGATAACCTCCAAATTCAGAGAAACCCCGGAATTAAAMTGGGCAATCCTGAGCCAAATC TITATnTGAGAAAAAGGGTnMnTATAGTnTTATAATATAAAACTACMTAAAAAA AGATAGGTGCAGAGACTCAATGGMGCTGrrCTAACGAATGAAGTTGATTACGTrGCGCTGGTAGCCGGAATCC1TCTATCAMATTACGGAGAGGATGCCCGCCCTATATACGTATATA TACATACTGACATAGTMACGATTGATTAATCACGGCCCGAATCCA1TATATAATATATA TATATATGAAAAATITMGAGlTATrGTAAATCCATrCCATATrcCAATCAAAGTITMG GMGAATCAAATATrCAGTGATCAMTrATTCGnCCAGAGTCTGTATAGATCTnTTAA AAACTGATTATTCGGACGAGAATAAAGAGAGAGTCCCATnTACGTCTCAATACCGACAA CAATGAAAnTATAGTAAAAGGAAMTCCGTCGACnTATAAGTCGTGAGGGTTCAAGTC CCTCTATCCCCAATAAAAGCCCATnTAAGTACTMaTAACTATACTTCCTAACTACIT TTTATCTTATCrnTnTAATCTAAGAAAITCAGGGGCTGGGTAAGATn.iTl'AGTACTr TCnMnTnTAGTaCTTTMTTGACATAGGTAMGTGCTCTACTAGGATAATGCGCG AGAAMGGTCGGGATAGCTCAGTTGGTAGAGCAGAGGACTGAAAATCCTCGTGTCACCAG TTCAAAT
〈210〉 19 〈211〉 847 〈212〉 DNA 〈213〉寧物
〈223〉云南大百合(Cardiocrinum yunanense)的trnL-trnF片段 〈400〉 19
CG嵐TCGGTAGACGCTACGGAOTGATTAAATTGAGCaTGGTATGGAAACCTGCTMG TGATAAaTCCAAAlTCAGAGAAACCCCGGMITAAAAATGGGCMTCCTGAGCCAMTC TITArnTGAGAAAAAGGGrnMnTATAGTmTATMTATAAAACTACAATAAAMA AGATAGGTGCAGAGACTCAATGGAAGCTGTTCTMCGAATGAAGlTGATrACGTrGCGCT GGTAGCCGGMTCOTCTATCAAAATTACGGAGAGGATGCCCGCCCTATATACGTATATA TACATACTGACATAGTAAACGATTGAnAATCGCGGCCCGAATCCATTATATAATATATA TATATATGAAAAATITMGAGTrATTGTAAATCCAITCCATArrCCAATCAAAGTTrAAG GMGAATCAAATATrCAGTGATCAAArrArrCAlTCCAGAGTCTGTATAGATCrmTM AMCTGATTATrCGGACGAGAATAAAGAGAGAGTCCCATTCTACGTGTCAATACCGACAA CAATGAAAnTATAGTAMAGGAAAATCCGTCGACnTATAAGTCGTGAGGGTTCAAGTC CCTCTATCCCCAATAAAAGCCCATnTAAGTACTMOTAACTATACrrCCTMCTACTT nTATOTATCTnmTMTCTAAGAAATTCAGGGGCTGGGTAAGATnnTAATACn TOTMTnTTTAGTCTCnTMTrGACATAGATAAAGTGCTCTACTAGGATAATGCGCG AGAAMGGTCGGGATAGCTCAGTTGGTAGAGCAGAGGACTGAAAATCCTCGTGTCACCAG TTCAAAT
〈210> :20 〈211〉 819 〈212〉 DNA 〈213〉植物
〈223〉薯蕷(Dioscorea cirrhosa)的trnL-trnF片段 〈400〉 20
CGAAATCGGTAGACGCTACGGAOTGATTGAATTCAG(nTGGTATGGAAACCTGCTAAG TGATMOTCCAAATrCAGAGAAACCCTGGAAnTGAMTGGGCAATCCTGAGCCAAATC TTTATITGTnTG'iTlTlTATAAACCCnTGGnTATAAAAAAACAAAACAAACTAGAAT CAAAMTCAAAAAGGATAGGTGCAGAGACTCAATGGAAGCTGTTCTAACGAATGGAATTG ACTACGnATGnGGTAGTTGGAAAACCTACATrGAAATTATGAMAGGGGAGTTCTATA TACCCAATACGTACGTATACATACTMCATATTAAAGGATTMTCACGACCCGAATCCAT TATnTAnTATATATAnATGAAAAAATGGAAAGTTATATrGTGAATCTAnTCAACCG MGTKMGGAAGAATCAAATATnMTGATCAAATCATTGAnCTAGAGTCTGATAGAT CmTGAAAAACGAATTAATCGGACGAGAATAAAGAGAGAGTCCTGCTCTACATGTCAAT ACTGACAACAATGAAATTTATAGTAAGAAGAAAATCCGTCGACTTTAGAAATCGTGAGGG TTCAAGTCCCTCTATCCCCAAAAAAGTCCArnTAnTCCTAATTATITATACTCTnTT TTTGMGATCGAAGGACTGGATAAGATnnTMGAGTCCCCTTAATrGAGATAGATAGA TATAAGTACTCTAGCAGGATGATGCGAGAAAAGAAAATGGTTGGGATAGCTCAGTTGGTA GAGCAGAGGACTGAAAATCCTCGTGTCACCAGTTCAAAT
28〈210〉 21 〈211〉 343 〈212> :DNA 〈213〉植物
〈223〉馬兜鈴(Aristolochia contorta)的psbA-tmH片段 〈400〉 21
GGTATGCATGMCGTAATGCTCACAACTrCCCTCTAGACCTGGCTGCTOTGAAGCTCCA TCTACAAATGGATAATACATCGTTAnTGTGTATACGAGTCGTTGAAGGAGCAATACCCA ATCCTnTGrraTATCMGAGGTGGGTATrGTrcCGCTCAATrCACTATCMCTCATTA GAGTnTACTCATATnTACTCATTnTACTCATATCGCATATATATTATATGTATATGC ATnTATCCATAGnTAAAGnAAAAAAMAAMAAAGGAAAGGCCAGGGGCGGATGTAG CCMGTGGATCAAGGCAGTGGATITGTGAATCCACCATGCGCG
〈210〉 22 〈211〉 349 〈212〉 DNA 〈213〉植物
〈223〉:青木香(Aristolochia debilis)的psbA-tmH片段 〈400〉 22
GGTATGCATGAACGTAATGCTCACMC1TCCCTCTAGACCTGGCTGCTCTTGMGCTCCA TCTACAAATGGATMTACATCGlTATrAGTGTATACGAGTCGTrGMGGAGCAATACCCA ATCCTnTGTraTATCAAGAGGTGGGTATTGTTCCGCTCAATrCACTAGAGrnTACTC ATATnTACTCATATCGCATATATMTATATTATATGCTATGCATnTATCCA'n'iT丄Ti' AGTITAAAGTTAAAAAAAAAAATGAAAAAGGAAAGGTrAAAAAGGAAAGGCCAGGGGCGG ATGTAGCCAAGTGGATCMGGCAGTGGATTTGTGMTCCACCATGCGCG
〈210〉 23 〈211〉 276 〈212〉 DNA 〈213〉植物
〈223〉:廣防己(Aristolochia fangchi)的psbA-trnH片段 〈400〉 23
GGTATGCATGAACGTAATGCTCACAACITCCCTCTAGACCTGGCTGCTCnGAAGCCCCA TCCACAAATGGATAATAOTCGGTATTAGTGTATACGAATCGTTGAAGGAGCAATACCCA ATraTGrnTTATCAAGAGGTGGGTATTGTrCTGCTCAAlTCACTAGTGTnTACTCAT TACAGCGGATTACTCCnTnTGMGTTAAAG嵐GGGCAGGGGCGGATGTAGCCMGTG GATCAAGGCAGTGGATTTGTGAATCCACCATGCGCG
〈210〉 24 〈211〉 261 〈212〉 DNA 〈213〉植物
〈223〉:馬兜鈴(Aristolochia kaempferi)的psbA-trnH片段 〈400〉 24
GGTATGCATGMCGTAATGCTCACAAaTCCCTCTAGACCTGGCTGCTaTGAAGCTCCA TCCAC嵐TGGATAATACTTCGGTAnAGTGTATACGAATCGTTGAAGGAGCMTACCCA ArrCTTGTmTATCAAGAGGTGGGTATrGTTCTGCTCAATTCACTAGTGTnTACTCCT nnTnTAAGTTAAAGAAAGGGCAGGGGCGGATCTAGCCMGTGGATCMGGCAGTGGA TTTGTGAATCCACCATGCGCG〈210〉 25 〈211〉 274 〈212〉 DNA 〈213〉植物
〈223〉關(guān)木通(Aristolochia manshuriensis)的psbA-trnH片段 〈400〉 25
GGTATGCATGAACGTAATGCTCACMaTCCCTCTATACCTGGCTGCTOTGAAGCTCCA TCCACAAATGGATAATACATTCGGTATTAGTGTATACGAATCGTTGAAGGAGCAATACCC AATrCTTGrmTATCAAGAGGCGGGTAITGTrCTGCTCAATrcACTAGTGTnTACTCG CGGATTACTCCnnnTnTAAGlTAAAGAAAGGGCAGGGGCGGATGTAGCCAAGTGGA TCAAGGCAGTGGATTTGTGMTCCACCATGCGCG
〈210〉 26 〈211〉 260 〈212〉 DNA 〈213〉植物
〈223〉尋骨風(fēng)(Aristolochia mollissima)的psbA-trnH片段 〈400〉 26
GGTATGCATGAACGTAATGCTCACAAOTCCCTCTAGACaGGCTGCTCTrGMGCTCCA TCCACAAATGGATAATACTTCGGTATTAGTGTATACGMTCGTTGMGGAGCMTACCCA ATTCTTGrmTATCAAGAGGTGGGTATrerrCTGCTCMnCACTAGTGrnTACTCCT TTnTmTAGTTAAAGAAAGGGCAGGGGCGGATGTAGCAAGTGGATCAAGGCAGTGGAT TTGTGAATCCACCATGCGCG
〈210〉 27 〈211〉 517 〈212〉 DNA 〈213〉植物
〈223〉:木香(Aucklandia lappa)的psbA-trnH片段 〈400〉 27
GGTATGCATGAACGTMTGCTCATAAnTCCCTCTAGACITAGCTGCTATCGAAGCTCCA TCTACAAATGGATAAGACnTGGTCTCATTGTATAGGAGTmTGMCTAAAAAAGGAGC AATAGCTrCCacrrGTTTTATCMGAGGGCGTTATTGCTCCn'n'n'rATITAGTAGTA TTTACCTrACATAGTTTCnTAAAAATAACAAGGGGGTnTATAGnTGGTrCGATTAGC ATGTTTTATCnTGTATrAATITCTATrATAGGTITATATATCCTnTCCCMTCGTITA TCAAGTnTArrTCCAACTCMTITCAATCTAAAATAGATAAAAATrATMTnTGATrA TITATrGCTnTATITCAGAAATAAGAAAGAAATAATATGCTCnTnnTATGTrMTG GAAAAATAAMTATAGTAATAGTAGATMTACTAGATAATAGGGGCGGATGTAGCCMGT GGATCAAGGCAGTGGATTTGTGAATCCACCATGCGCG
〈210〉 28 〈211〉 518 〈212〉 DNA 〈213〉植物
〈223〉灰毛川木香(Vladimiria souliei var. mirabilis)的psbA-trnH片段 〈400〉 28
GGTATGCATGAACGTAATGCTCATAATITCCaCTAGACTTAGCTGCTATCGAAGCTCCA TCTACAAATGGATAAGACnTGGTCTGATTGTATAGGAGTnTTGMCTAAAAAAGGAGC AATAGCTTCCCTCTTGTnTATCAAGAGGGCGTTATTGCTCCnTTTTTAnTAGTAGTA TITACaTACATAGnTCnTAAAAATMCAAGGGGGGTnTATAGnTGGrrCGArrAG CGTGTnTATCnTGTArrMTITCTATrATAGGTTTATATATCCrnTCCCMTCGTTrATGAAGTnTAnTCCAACKMnrCMTATAMATAGATAAAAATTATAATnTGAn ATITATrGCrnTAnTCAG嵐TAAGAAAGAAATAATATGCTCrriTlTn'ATGTrMT GGAAAAATAAAATATAGTMTAGTAGATAATACTAGATMTAGGGGCGGATGTAGCCAAG TGGATCAAGGCAGTGGATITGTGAATCCACCATGCGCG
〈210〉 〈211〉 〈212〉 〈213> 〈223〉 〈400〉
29
617
DNA
植物
木通(Akebia quinata)的psbA-tmH片段 29
GGTATGCATGAACGTMTGCTCACAACrrCCCTCTAG八CCTAGCrGCTGTCGAAGCTCCA GCGACAAATGGATMGATrrCCGTOTAGTGTATCCGAGTrATTGMGGTCAAGGAGTAA TACCCAATTTCITGTrCTATCAAGAGGACGGGTAlTGTrCCTTCATrTAGTnTAGTAGT TTTTACTCGCAGAATCTGCTCTiT丄'i,riTr丄'丄'AnTATnTAACTAAAATAAAAATGAAT ATAGGnTATrCATrAlTGAGTATCATACTnTGrrCTGTATAAAATATATAATITATGA AnTATATATGTTATATGrrCCTCG纖'丄'丄T丄TGAOTGAaT丄'rri'CATAAATrATGG AMTrATGAAACTAAAGCTACTTmTATAMGGATrGGTCTTGCATGCCCAATATCTGT ATOTAGTATATaTAGTATCMGAAMGTAAGAACTACTCMTTAAAAAACTCAATTAA AAMTGAAAAATAACAAAAAAAGAAATrCAAnTCTACCATATGGTi'i'丄Ti.iT丄'ArmT TTGTGAGTTTGAGGGAGTAGGGGGGCGGATGTAGCCAAGTGGCTCAAGGCAGTGGATITG TGAATCCACCATGCGCG
〈210〉30
〈211〉617
〈212〉DNA
〈213〉植物
〈223〉三葉木通
〈400〉30
(Akebia trifoliate)
的psbA-trnH片段
GGTATGCATGAACGTAATGCTCACAACTTCCCTCTAGACCTAGCTGCTGTCGMGCTCCA GCGACAAATGGACAAGAnTCCGTCTTAGTGTATCCGAG!TATTGMGGTGAAGGAGTAA TACCCAATTTaTGTrCTATCMGAGGACGGGTATTGTrCOTCATITAGTnTAGTAGT rnTACTCGCAGAATCTGCTCnTn'n'n'rAnTATnTMCTAAAATAAAAATGMTA TAGGnTATTCATrATTGAGTATCATACTmmTCTGTATAAAATATATMHTATGM nTATATATGTTATATGTTCCTCGAAATlTnTGAOTGACnTrn'CATAAATrATGGA AATTATGAAACTAAAGCTACTiTiTi'ATAAAGGATrGGTOTGCATGCCCMTATCTGTA TaTAGTATATOTAGTATCAAGAMAGTMGAACTACTCAATTAMAAATAAAAAATGA AAMTMCAAAAAAAGAAATTCAATTTCTACCATATGG'n'n'n'nTn'n'nTATrnT TTGTGAGnTGAGGGAGTAGGGGGGCGGATGTAGCCAAGTGGCTCAAGGCAGTGGAnTG TGAATCCACCATGCGCG
〈210〉 〈211〉 〈212〉 〈213〉 〈223〉 〈400〉
31
608
DNA
a物
三葉木通(Akebia trifoliata var. australis)的psbA-tmH片段 31
GGTATGCATGAACGTAATGCTCACAACnCCCTCTAGACCTAGCTGCTGTCGMGCTCCA GCGACAAATGGATAAGAmCCGTCTTAGTGTATCCGAGTTMTGAAGGTGAAGGAGTAA TACCCAAnTdTGITCTATCAAGAGGACGGGTATrGnCCTTCATTTAGTnTAGTAGT TnTACTCGCAGMTCTGCTCnTiTnTiTiTATITArnTAACTAMATAAAAATGM TATAGGnTATrCATTATTGAGTATCATACTnTGTTCTGTATAAAATATATAAnTATG
31AATnATATATGTrATATGrrCCTCGAAA'nTn'rGAOTGACn'n'n'CATAMTrATG GAMTTATGAAACTAAAGCTACnTnTATAAAGGAnGGTCTTGCATGCCCAATATCTG TATCTTAGTATATCTTAGTATCMGAMAGTAAGAACTACTCAAITAAMAATGAAAAAT AACAAAAAAAGAAATTCAATTrCTACaTATGGlTi.n.i,i'i'iTn'ATi'n'iTi'GTGAGTT TGAGGGAGTAGGGGGGCGGATGTAGCCAAGTGGCTCMGGCAGTGGATITGTGAATCCAC CATGCGCG
〈210〉32
〈211〉456
〈212〉DNA
〈213〉植物
〈223〉鐵線蓮
〈400〉32
(Clematis armandii)
的psbA-tmH片段
GGTATGCATGAACGTAATGCTCACAACTCCCCTCTAGATCTAGCGGCTGTTGMGITCCA TCTACMATGGCTAAGACrrAGGTCTTAGTGTATGCTAGTOTAGTGTATATGAGTCGlT GMGTTGCAGGAGTMTACCCCMlTCrrGCTCTGTCAAGAGGCCGGGCArrGCTCCTGC GTnTGTnTAATAGTGTnTAnTGCArmTCATMTGATl,nTl'A'lTi.i'丄TriTGM GTCAnTCATmTGMTrTGAAGTAAAAAAAAAAAATGACTCGAATGGGGGAlTGGTTG TTGMTTC1TGATTATCATACTCTCGTTCTGTACGTATATAAACCMTCCMTATAATAT GlTCCTAAAMrnTGAAACMTTTAnTGAGAAAGCGGAGGGGCGGATGTAGCCAAGTG GATCMGGCAGTGGATTTGTGMTCCACCATGCGCG
〈210〉 33 〈211〉 447 〈212〉 DNA 〈213〉植物
〈223〉川木通(Clematis montana)的psbA-tmH片段 〈400〉 33
GGTATGCATGAACGTAATGCTCACAAC1TCCCTCTAGATCTAGCGGCTGTTGAAGTTCCA TCTACAAATGGCTAAGACTTAGGTClTAGTGTAGGCTAGTCTrAGTGTATATGAGTCGTr GAAGrrGCAGGAGCAATACCTCAATTaTGTTCTGTCAAGAGGCCGGGCATTGCTCCTGC GTnTGTnTAATAGTGTnTATTTGCATnTGCATAATGATiTiT丄'Cn'i'lTlTi'iTGA AGTAAnTMnTGAAGTAAAAAAAAAATGACTCGAATGGAGGATTGGTTGGTGAAlTa TGATrATCATACTCTCGTrCTGTACATATATAMCCAATCCMTATAATATGTTCCTAAA AATTrGGAAACAATTTAnTGAGAAAGOGGAGGGGCGGATGTAGCCAAGTGGATCAAGGC AGTGGATTTGTGAATCCACCATGCGCG
〈210〉 34 〈211〉 643 〈212〉 DNA 〈213〉植物
〈223〉木P方己(Cocculus orbiculatus)的psbA-tmH片段 〈400〉 34
GGTATGCATGMCGTAATGCTCACMOTCCCTCTAGATCTAGCAGCTGTreAAGCTCCA TCTACAAATGGCTMGATrrCGGTOTAGTGTATACGAGTCGTrGAAGTrGAAAGAGCAA TACCCMTl'n'丄'丄'GTTCTGTCMGGGGGCGGGTATrGCTCaTCAAnAGGGTTAGTATT GTnTGTnTACTCACATAAGCA'n'n'nTCATnTCTAnTATTTAnTCAAOTATAA AATTCAGAMAAAGCATrCAATTAATAAGGArmnTGAGTArnTATTATGCCnGAT TCTGCACTAACGAATTTGTAAnTCTATATGTTATTrAGGTGATAGGTITCCCGACATCT TnTOTCCTAAAGTTCTnTATrATrCnTGAnnTnTCATATnTATITCTATTAG TITAGTnTAACTAAACTAGAAAAATAAAATAAAAGATrCCCTnTAGGTACAATATCTr TATnCAGTATATrCTAAAGAGATGCGTAAGTTAGG雄GACTTAACTTAAACATGTAAA<formula>formula see original document page 33</formula>ATCAITGAAATAAGAAAGMGAGAAATATTCGMCnTACTCTnTGTnTCGMTITAA ATAATGTAAAAATGGACTGTAAGTAGTCGAGGGGGCGGATGTAGCCAAGTGGATCAAGGC AGTGGATTTGTGAATCCACCATGCGCG
〈210〉 38 〈211〉 489 〈212〉 DNA 〈213〉植物
〈223〉大百合(Cardiocrinum giganteum)的psbA-trnH片段 〈400> :38
GGTATGCATGAACGTAATGCTCACMTITCCCTCTAGACTAGCTGCTGTTGAAGrrCCAT CTACAAATGGATAAGACnCCATTCTGTOTAGTGTATACGMTCArrGATGGAGCAATA TCnTGTATaTGCTMAGATArrGCTCCCn'n'rn'GGCCMTCAITGTGGGTATMTG GTAGATGCCCTAGACCAAGTGACTATTATTTCnTCTCCTCCCTTATGnTAGTnTrCA ATTnTGCCGATAMTGAlTAGCTACAAAAGGA'rrn丁i'm'ATrGAACGTGTCACAGGG GArrACTCCnTATTACATTACArmTAMAlTGGCATTCTATGCCCMTATATCGATC TAAGTATGMGGTMGAATAMTACAATMTGATGMTGGAAAAAGAAMAAGCTAAAAT CnTTAGCTAGATAAGGGGCGGATGTAGCCAAGTGATCAGGCAGTGGAnTGTGAATCCA CCATGCGCG
〈210〉 39 〈211〉 492 〈212〉 DNA 〈213〉粵物
〈223〉云南大百合(Cardiocrinum yunanense)的psbA-trnH片段 〈400〉 39
GGTATGCATGAACGTAATGCTCACAATrrCCCTCTAGACCTAGCTGCTGTrGAAGTTCa TCTACAAATGGATAAGACTTCCATTCTGTOTAGTCTATACGAATCATrGATGGAGCAAT ATCnTGTATCTrGCTAAAGATATTGCTCCCnTnTTGGCCAATCATTGTGGGTATAAT GGTAGATGCCaAGACCMGTGACTArrAnTCnTCTCCTCCOTATGnTAGTmTC AATTnTGCCGATAAATGATTAGCTACAAMGGATnTn'n'iAnGAACGTGTaCAGG GGATTACTCCnTATTACATTACArmTAAAATrGGCATTCTATGCCCMTATATCGAT CTMGTATGAAGGTAAGMTAMTACAATAATGATGAATGGAAAAAGAAAAMGCTAAAA TCmTAGCTAGATMGGGGCGGATGCAGCCAAGTGGATCMGGCAGTGGATITGTGAAT CCACCATGCGCG
〈210〉 40 〈211〉 401 〈212〉 DNA 〈213〉植物
〈223〉薯蕷(Dioscorea cirrhosa)的psbA-trnH片段 〈400〉 40
GGTATGCATGAACGTAATGCTCACAACnTCCnTAGAOTAGCTGCTGrrGAAGTTCCA TCTACAAATGGATAAGACrnTGTOTAATGTATATGMTCGnGAAGGAGCAATATCAA TATCTTGTrCGAGCAAGMGnTGGTATTGCTCCCCTnTCAArnTrCCCGATAAATGA TCAACTACAAAAGGA'rnTlTlTrAGTGAACGTGTCACAGCGGAlTACTCCnTATTnT TACArmTMGATTGGCAlTCTATGlTCAATATCTCGATCTAATMGGTMGAATAAAT TTAAATACAATAATGATGMTGGAAAAAGAGAMATCCnTAGCTAGGGCGGATGTAGCC AAGTGGATCAAGGCAGTGGATTTGTGAATCCACCATGCGCG
權(quán)利要求
1. 一種用于判斷未經(jīng)鑒定的植物材料是否源于馬兜鈴屬植物的方法，包括下述步驟(a)從所述未經(jīng)鑒定的植物材料中獲得DNA樣品，所述DNA包括葉綠體DNA的片段，該片斷位于葉綠體DNA的trnL-trnF區(qū)間或位于psbA-trnH區(qū)間；(b)確定所述片段的DNA序列；以及(c)將所述DNA序列進(jìn)行分析并判斷其是否包括馬兜鈴屬的表征片段，以評(píng)估所述未經(jīng)鑒定的植物材料是否屬于馬兜鈴屬物種。
2. 如權(quán)利要求1的方法，其中步驟(c)通過(guò)比較上述DNA序列與 含有馬兜鈴屬的表征片段的標(biāo)準(zhǔn)DNA序列而實(shí)現(xiàn)。
3. 如權(quán)利要求2的方法，其中標(biāo)準(zhǔn)DNA序列是葉綠體DNA的tmL -trnF片段或psbA - tmH片段，或者包含了葉綠體DNA的trnL - tmF片段 或psbA - tmH片段，或者屬于葉綠體DNA的trnL - tmF片段或psbA - tmH片段的一部分。
4. 如權(quán)利要求2的方法，其中所述未經(jīng)鑒定的植物材料源于木香、木 通、防己、白英、馬兜鈴或朱砂蓮。
5. 如權(quán)利要求2的方法，其中，所述片段包括選自分子標(biāo)記1至分子 標(biāo)記39的分子標(biāo)記序列。
6. 如權(quán)利要求4的方法，其中，所述片段包括選自分子標(biāo)記1至分子 標(biāo)記39的分子標(biāo)記序列。
7. 如權(quán)利要求2的方法，其中，所述標(biāo)準(zhǔn)DNA序列選自SEQIDNO:l 至SEQ ID NO:40的序列，或者包含選自SEQ ID NO:l至SEQ ID NO:40 的序列，或者是選自SEQIDNO:l至SEQIDNO:40的序列的一部分。
8. 如權(quán)利要求7的方法，其中，所述標(biāo)準(zhǔn)DNA序列包含選自分子標(biāo) 記1至分子標(biāo)記39的分子標(biāo)記序列。
9. 如權(quán)利要求2的方法，其中，所述標(biāo)準(zhǔn)DNA序列選自SEQIDNO:l 至SEQ IDNO:40序列。
10. 如權(quán)利要求7的方法，其中，所述標(biāo)準(zhǔn)DNA序列是選自SEQID NO:l至SEQIDNO:40序列的一個(gè)序列的全部或一部分，并且所述部分至 少占所選序列長(zhǎng)度的80%。
11. 如權(quán)利要求1的方法，其中，所述馬兜鈴屬的表征片段位于trnL-trnF 片^殳之內(nèi)。
12. 如權(quán)利要求l的方法，其中，所述馬兜鈴屬的表征片段位于psbA 一trnH片萃殳之內(nèi)。
13. 如權(quán)利要求3的方法，所述標(biāo)準(zhǔn)DNA序列是葉綠體DNA的trnL -trnF片段，或者包含葉綠體DNA的trnL - trnF片段，或者是葉綠體DNA 中的trnL — trnF片段的一部分。
14. 如權(quán)利要求3的方法，所述標(biāo)準(zhǔn)DNA序列是葉綠體DNA中的 psbA - trnH片段，或者包含葉綠體DNA中的psbA - trnH片段，或者是 葉綠體DNA中的psbA - trnH片段的一部分。
15. —種用于如權(quán)利要求1的方法的基因序列，選自SEQ ID NO:l至 SEQ ID NO:40的序列，或者包含選自SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO:40的序 列，或者是選自SEQ ID NO:l至SEQ ID NO:40的序列的一部分。
16. 如權(quán)利要求15中所述的基因序列，選自SEQIDNO:l至SEQIDNO:40中的一個(gè)序列的全部或一部分，并且所述部分至少占所選序列長(zhǎng)度 的80 % 。
全文摘要
一種用于檢測(cè)在草藥產(chǎn)品和植物藥中的馬兜鈴屬草藥或植物的方法，可基于trnL-trnF片段和/或psbA-trnH片段的序列信息。葉綠體DNA的trnL-trnF片段和/或psbA-trnH片段包含了一些可高度表征馬兜鈴屬植物的片段。通過(guò)這種方法，比較材料不明的草藥或植物與已知材料的標(biāo)準(zhǔn)DNA序列在上述片段中的一個(gè)片段或者多個(gè)片段的相近似度可用于鑒別未知的材料。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101440398SQ20081009421
公開(kāi)日2009年5月27日 申請(qǐng)日期2008年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月23日
發(fā)明者明 李, 林曉嵐, 畢培曦, 畢穎騫, 邵鵬柱 申請(qǐng)人:香港賽馬會(huì)中藥研究院有限公司