本發(fā)明涉及一種蛋白含量的測(cè)定方法，具體說(shuō)是一種將二喹啉甲酸用于海藻酸鹽材料中蛋白含量的定量檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

海藻酸鹽材料因其良好的生物相容性，作為組織再生的生物材料顯示出廣闊的應(yīng)用前景。但海藻酸鹽材料中雜質(zhì)蛋白將嚴(yán)重影響其在應(yīng)用過(guò)程中的生物相容性。作為組織工程的原材料產(chǎn)品，其產(chǎn)品中的雜蛋白成分將被嚴(yán)格限制。目前，國(guó)家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中針對(duì)蛋白的定量表征方法均采用考馬斯亮藍(lán)法。但，該方法在測(cè)試過(guò)程中，需要在酸性環(huán)境下進(jìn)行，而海藻酸鹽材料在pH酸性環(huán)境下形成凝膠態(tài)，無(wú)法形成均勻溶液，使得常規(guī)考馬斯亮藍(lán)檢測(cè)蛋白的方法無(wú)法應(yīng)用到海藻酸鹽材料雜蛋白的檢測(cè)中。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)常規(guī)考馬斯亮藍(lán)檢測(cè)蛋白的方法無(wú)法應(yīng)用到海藻酸鹽材料雜蛋白的檢測(cè)中的缺陷，本發(fā)明提出，將可在堿性條件下測(cè)定蛋白含量的方法用于海藻酸鹽材料中雜質(zhì)蛋白含量的檢測(cè)。

本發(fā)明提出的具體技術(shù)方案如下：

(1)用生理鹽水配制成100.0μg/ml的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液。

(2)將步驟(1)配制的標(biāo)準(zhǔn)液用生理鹽水依此稀釋成10.0μg/ml、20.0μg/ml、30.0μg/ml、40.0μg/ml、50.0μg/ml、60.0μg/ml、70.0μg/ml、80.0μg/ml、90.0μg/ml。

(3)配制二喹啉甲酸試劑及其工作液：

試劑A：分別稱取10.0g BCA(二喹啉甲酸)(1％)，20.0g Na₂CO₃·H₂O(2％)，1.6g酒石酸鈉(Na₂C₄H₄O₆·2H₂O，0.16％)，4.0g NaOH(0.4％)，9.5g NaHCO₃(0.95％)，定容至1L，用10mol/L NaOH或固體NaHCO₃調(diào)節(jié)pH值至11.25。

試劑B：精確稱取2.0g CuSO₄·5H₂O(4％)，蒸餾水定容至50mL。

取50體積份試劑A與1體積份試劑B混合均勻，即配制成綠色的工作液。

(4)向步驟(2)獲得的梯度蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液中加入二喹啉甲酸工作液，二者質(zhì)量比為1:5-1:50均勻混合，40-70℃水浴中反應(yīng)10-60分鐘，不含蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液的生理鹽水為對(duì)照組，測(cè)定各組在562nm處的吸光度值，繪制蛋白含量-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(5)生理鹽水配制海藻酸鹽樣品溶液(1-20mg/ml)。

(6)向步驟(5)配制的海藻酸鹽溶液中加入二喹啉甲酸工作液，二者質(zhì)量比為1:5-1:50均勻混合，40-70℃水浴中反應(yīng)10-60分鐘，生理鹽水為對(duì)照組，測(cè)定對(duì)照組與海藻酸鹽樣品組在562nm處的吸光度值，根據(jù)步驟(4)獲得的蛋白含量-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算海藻酸鹽溶液中的蛋白含量，根據(jù)海藻酸鹽溶液濃度計(jì)算海藻酸鹽材料樣品中的蛋白含量。

(7)也可將海藻酸鈉樣品直接溶解在二喹啉甲酸工作液中，海藻酸鹽樣品的配制濃度在10μg/ml-10mg/ml，40-70℃水浴中反應(yīng)10-60分鐘，在562nm處測(cè)定吸光度值，根據(jù)步驟(4)獲得的蛋白含量-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算海藻酸鹽溶液中的蛋白含量。

本發(fā)明提出的測(cè)定海藻酸鹽材料中蛋白含量的定量檢測(cè)方法，適合測(cè)定分子量在10-500kDa的海藻酸鹽材料。

本發(fā)明提出的測(cè)定海藻酸鹽材料中蛋白含量的定量檢測(cè)方法，適合測(cè)定海藻酸的鈉鹽或鉀鹽。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：

(1)配制二喹啉甲酸試劑及其工作液：

試劑A：分別稱取10.0g BCA(1％)，20.0g Na₂CO₃·H₂O(2％)，1.6g酒石酸鈉(Na₂C₄H₄O₆·2H₂O，0.16％)，4.0g NaOH(0.4％)，9.5g NaHCO₃(0.95％)，定容至1L，用10mol/L NaOH或固體NaHCO₃調(diào)節(jié)pH值至11.25。

試劑B：精確稱取2.0g CuSO₄·5H₂O(4％)，蒸餾水定容至50mL。

取50體積份試劑A與1體積份試劑B混合均勻，即配制成綠色的工作液。

(2)繪制蛋白含量-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線：

配制梯度蛋白標(biāo)準(zhǔn)液：用生理鹽水配制成100.0μg/ml的牛血清白蛋白標(biāo) 準(zhǔn)液，用生理鹽水依此稀釋成10.0μg/ml、20.0μg/ml、30.0μg/ml、40.0μg/ml、50.0μg/ml、60.0μg/ml、70.0μg/ml、80.0μg/ml、90.0μg/ml。向梯度蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液中加入二喹啉甲酸工作液，二者質(zhì)量比為1:10均勻混合，60℃水浴中反應(yīng)30分鐘，不含蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液的生理鹽水為對(duì)照組，測(cè)定各組在562nm處的吸光度值，繪制蛋白含量-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(3)測(cè)定待測(cè)海藻酸鈉樣品中的蛋白含量：取海藻酸鈉樣品，用生理鹽水配制成5mg/ml的海藻酸鈉溶液，向海藻酸鈉溶液中加入二喹啉甲酸工作液，二者質(zhì)量比為1:10均勻混合，60℃水浴中反應(yīng)30分鐘，生理鹽水為對(duì)照組，測(cè)定兩組在562nm處的吸光度值，根據(jù)蛋白含量-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得海藻酸鈉溶液中蛋白含量為45.0μg/ml。根據(jù)海藻酸鈉溶液濃度，計(jì)算得待測(cè)海藻酸鈉樣品中蛋白含量為0.9％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。

實(shí)施例2：

(1)配制二喹啉甲酸試劑及其工作液：

試劑A：分別稱取10.0g BCA(1％)，20.0g Na₂CO₃·H₂O(2％)，1.6g酒石酸鈉(Na₂C₄H₄O₆·2H₂O，0.16％)，4.0g NaOH(0.4％)，9.5g NaHCO₃(0.95％)，定容至1L，用10mol/L NaOH或固體NaHCO₃調(diào)節(jié)pH值至11.25。

試劑B：精確稱取2.0g CuSO₄·5H₂O(4％)，蒸餾水定容至50mL。

取50體積份試劑A與1體積份試劑B混合均勻，即配制成綠色的工作液。

(2)繪制蛋白含量-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線：

配制梯度蛋白標(biāo)準(zhǔn)液：用生理鹽水配制成100.0μg/ml的牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液，用生理鹽水依此稀釋成10.0μg/ml、20.0μg/ml、30.0μg/ml、40.0μg/ml、50.0μg/ml、60.0μg/ml、70.0μg/ml、80.0μg/ml、90.0μg/ml。向梯度蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液中加入二喹啉甲酸工作液，二者質(zhì)量比為1:10均勻混合，60℃水浴中反應(yīng)30分鐘，不含蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液的生理鹽水為對(duì)照組，測(cè)定各組在562nm處的吸光度值，繪制蛋白含量-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(3)測(cè)定待測(cè)海藻酸鉀樣品中的蛋白含量：取海藻酸鉀樣品，用二喹啉甲酸工作液配制成1mg/ml的海藻酸鉀溶液，60℃水浴中反應(yīng)30分鐘，測(cè)定在562nm處的吸光度值，根據(jù)蛋白含量-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得海藻酸鉀溶液 中蛋白含量為28.0μg/ml。根據(jù)海藻酸鉀溶液濃度，計(jì)算得待測(cè)海藻酸鉀樣品中蛋白含量為0.28％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。