在線測(cè)定牛奶中苯甲酸δ¹³C值的方法【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種在線測(cè)定牛奶中苯甲酸δ13C值的方法。具體而言，本發(fā)明涉及應(yīng)用液相色譜?穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜在線測(cè)定牛奶中苯甲酸δ13C值的方法，屬于穩(wěn)定同位素分析
技術(shù)領(lǐng)域：
。該方法包括如下步驟：1)選用合適的液相色譜柱；2)配制酸性流動(dòng)相；3)調(diào)整液相色譜?穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜至工作狀態(tài)；4)調(diào)整樣品中苯甲酸濃度；5)采用自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)行自動(dòng)進(jìn)樣并測(cè)定苯甲酸δ13C測(cè)定值；6)使用δ13C值已知的參考物質(zhì)校正儀器的測(cè)定系統(tǒng)偏差；7)根據(jù)系統(tǒng)偏正計(jì)算苯甲酸的δ13C值。本方法具有操作簡(jiǎn)單、方便、檢測(cè)限低、結(jié)果穩(wěn)定的特點(diǎn)，避免了對(duì)手動(dòng)進(jìn)樣操作的依賴(lài)，可實(shí)現(xiàn)24h連續(xù)分析?！緦?zhuān)利說(shuō)明】在線測(cè)定牛奶中苯甲酸S13C值的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：[0001]本發(fā)明涉及在線測(cè)定牛奶中苯甲酸穩(wěn)定碳同位素比值(記作s13c)的方法，屬于穩(wěn)定同位素分析
技術(shù)領(lǐng)域：
?！?br>背景技術(shù)：
】：[0002]"民以食為天，食以安為先"，我國(guó)對(duì)食品安全的監(jiān)管已上升到了國(guó)家戰(zhàn)略，2014年兩會(huì)政府工作報(bào)告及《食品安全法》修訂草案中提及"嚴(yán)守法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)，用最嚴(yán)格的監(jiān)管、最嚴(yán)厲的處罰、最嚴(yán)肅的問(wèn)責(zé)，堅(jiān)決治理餐桌上的污染，切實(shí)保障"舌尖上的安全"。但是，一些不法商人為追逐經(jīng)濟(jì)利益，在食品生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)活動(dòng)中采用摻假、偷工減料、添加廉價(jià)原材料等行為牟取暴利，這種經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)動(dòng)型的摻假行為也會(huì)帶來(lái)食品安全問(wèn)題，然而由于摻入的組分與食品既有成分相同，給檢測(cè)帶來(lái)了技術(shù)挑戰(zhàn)，也給監(jiān)管都來(lái)了難題。[0003]近年來(lái)，穩(wěn)定同位素技術(shù)在食品摻偽鑒別中起著越來(lái)越重要的作用，其原理是同位素自然分餾作用會(huì)影響物質(zhì)的同位素分布，而即使是同一種化合物，當(dāng)來(lái)源不同時(shí)其同位素組成也是存在差異的，基于這一特點(diǎn)，穩(wěn)定同位素技術(shù)在食品摻偽鑒別中起著越來(lái)越重要的作用。[0004]牛奶是一種營(yíng)養(yǎng)均衡的全價(jià)食品，在人們的膳食結(jié)構(gòu)中有其它食品無(wú)法替代的作用，年來(lái)我國(guó)乳業(yè)和乳品加工業(yè)得到了飛速發(fā)展。然而，生鮮牛乳產(chǎn)量急劇增長(zhǎng)的同時(shí)，生鮮牛乳的質(zhì)量安全問(wèn)題突現(xiàn)出來(lái)，已成為各級(jí)政府部門(mén)和消費(fèi)者關(guān)注的焦點(diǎn)，尤其是三聚氰胺事件引起消費(fèi)者對(duì)生鮮牛乳中非法添加成分的極大恐懼，引發(fā)消費(fèi)者對(duì)國(guó)內(nèi)生鮮牛乳質(zhì)量安全的信任危機(jī)。[0005]苯甲酸(苯甲酸鈉以苯甲酸計(jì))作為GB2760-2011中允許使用的食品添加劑，被廣泛應(yīng)用于酸性食品的保鮮，作為防腐劑以延長(zhǎng)食品貨架期，然而并未將其列入生鮮牛乳的允許適用范圍之列。然而據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)告，動(dòng)植物的代謝產(chǎn)物中天然存在著苯甲酸，因此，難以通過(guò)分析產(chǎn)品中苯甲酸的含量來(lái)辨別有無(wú)外源添加。天然存在的苯甲酸來(lái)自于動(dòng)植物的生理代謝活動(dòng)，而食品添加劑苯甲酸及其鈉鹽屬于工業(yè)制品，通常由是在鈷、錳等催化劑存在下用空氣氧化甲苯制得，或由鄰苯二甲酸酐水解脫羧制得的，因此在來(lái)源途徑上與天然苯甲酸完全不同，其同位素組成也會(huì)存在較大差異，因此可以結(jié)合穩(wěn)定同位素技術(shù)檢測(cè)食品及其相關(guān)制品中苯甲酸，分析是否有外源添加的可能。[0006]然而，穩(wěn)定同位素技術(shù)在食品領(lǐng)域的研究與應(yīng)用僅有40余年的歷史，該技術(shù)的研究與應(yīng)用仍處于發(fā)展中，而針對(duì)苯甲酸的碳同位素分析（S13C值）的報(bào)道比較少：Scharschmidt等（VariationofTransition-StateStructureasaFunctionoftheNucleotideinReactionsCatalyzedbyDehydrogenases-LiverAlcoholDehydrogenasewithBenzylAlcoholandYeastAldehydeDehydrogenasewithBenzaldehyde)人通過(guò)液液萃取法提取酵母提取液中苯甲酸，離線真空條件下將苯甲酸轉(zhuǎn)化成二氧化碳，再用穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀分析，但該方法需要大量的苯甲酸樣品；Krummen等人（Anewconceptforisotoperatiomonitoringliquidchromatography/massspectrometry)和Heuer等人（Online513Canalysisofvolatilefattyacidsinsediment/porewatersystemsbyliquidchromatography-isotoperatiomassspectrometry)使用微進(jìn)樣技術(shù)結(jié)合液相色譜-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜技術(shù)測(cè)定了苯甲酸的S13C值，但是，該方法也僅適用于高純度苯甲酸樣品而且不能自動(dòng)進(jìn)樣，只能通過(guò)手動(dòng)進(jìn)樣的模式進(jìn)行樣品分析，大大增加了工作量，無(wú)疑降低了工作效率，而與此同時(shí)，該方法雖然使用了液相色譜-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀，但是該儀器僅起到了載流的作用，而不能分析混合物中的苯甲酉愛(ài)；Shexia(StablecarbonisotopiccompositionsoforganicacidsintotalsuspendedparticlesanddustsfromGuangzhou，China)等人使用氣相色譜-燃燒-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀結(jié)合衍生降解技術(shù)測(cè)定了芳香族有機(jī)酸的S13C值，但該技術(shù)只能分析所有芳香族氨基酸平均的S13c值，而不能給出苯甲酸的S13c值，此外，前處理過(guò)程中的衍生和降解步驟也可能導(dǎo)致同位素分餾，使得測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)確。有關(guān)牛奶中苯甲酸碳同位素分析的研究則未見(jiàn)報(bào)道。[0007]本發(fā)明開(kāi)發(fā)了一種使用液相色譜-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀在線測(cè)定牛奶中苯甲酸S13C的方法。【
發(fā)明內(nèi)容】：[0008](1)擬解決的問(wèn)題[0009]苯甲酸作為一種高沸點(diǎn)有機(jī)物，需要一種簡(jiǎn)單的、自動(dòng)的測(cè)定混合物中苯甲酸的s13c值的方法，為牛奶中苯甲酸的來(lái)源分析提供方法基礎(chǔ)。[0010](2)本發(fā)明的具體方案[0011]本發(fā)明結(jié)合色譜分離理論、液相色譜-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀的分析特性及穩(wěn)定同位素分析的原理和要求建立了牛奶中苯甲酸S13c值的測(cè)定。[0012]具體而言，本發(fā)明提供了測(cè)定牛奶中苯甲酸的S13c值的方法，優(yōu)選地，其中所述的牛奶需要經(jīng)過(guò)前處理后、以水為溶劑而值得制備液，如從牛奶中除去纖維素、蛋白質(zhì)、脂肪和大部分糖類(lèi)(至少50%、60%、70%或80%的糖類(lèi)，優(yōu)選90或95%的糖類(lèi)）。[0013]本發(fā)明的方法采用液相色譜-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀測(cè)定牛奶樣品中苯甲酸的S13C值，其中包括牛奶樣品的前處理步驟、自動(dòng)進(jìn)樣、液相色譜分離、在線反應(yīng)裝置將苯甲酸氧化成二氧化碳，最后用穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀測(cè)定苯甲酸轉(zhuǎn)化來(lái)的二氧化碳的S13C值的步驟。[0014]更具體而言，本發(fā)明測(cè)定牛奶中苯甲酸S13C值的方法，包括以下步驟：[0015]D牛奶除雜；[0016]2)除去除雜過(guò)程中引入的有機(jī)溶劑；[0017]3)用水稀釋牛奶除雜后得到的制備液；[0018]4)過(guò)濾后放在液相色譜儀的樣品盤(pán)上；[0019]5)配有離子交換色譜柱的液相色譜，采用自動(dòng)進(jìn)樣器自動(dòng)進(jìn)樣，在流動(dòng)相的作用下將牛奶中苯甲酸與其他有機(jī)組分分離；[0020]6)將液相色譜柱分離得到的苯甲酸直接導(dǎo)入在線反應(yīng)裝置中進(jìn)行氧化處理，得到苯甲酸轉(zhuǎn)化的二氧化碳；[0021]7)用穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀測(cè)定該二氧化碳中S13C;[0022]8)計(jì)算牛奶樣品中苯甲酸的S13C值，優(yōu)選的，該值由苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)校正而來(lái)。[0023]上述步驟中，所述的牛奶除雜是指通過(guò)除去不溶性的纖維素、脂肪和蛋白質(zhì)，以及牛奶中大部分的糖類(lèi)。[0024]所述的牛奶樣品經(jīng)處理后溶解在水中，苯甲酸的含量應(yīng)為0.1~1.2g/L，優(yōu)選為0.3g/L〇[0025]所述液相色譜條件參數(shù)如下：流動(dòng)相為pH為2的硫酸溶液;色譜柱溫度為65°C;流動(dòng)相流速為〇.3mL/min;進(jìn)樣體積20yL。[0026]優(yōu)選地，液相色譜-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜的條件如下：[0027]色譜條件:HyperREZXPCarbonhydrateH+液相色譜柱（300mm*7.7mm*8iim);流動(dòng)相為pH=2的硫酸溶液;進(jìn)樣體積20yL;[0028]調(diào)整液相色譜-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜的參數(shù):設(shè)定流動(dòng)相流速為0.3mL/min;設(shè)定色譜柱溫度為65°C;同時(shí)監(jiān)測(cè)m/z=32、33和34的離子流信號(hào)強(qiáng)度，確保m/z=32的離子流信號(hào)強(qiáng)度為l〇〇〇〇mV。[0029]任選地，確認(rèn)穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀的工作環(huán)境、氣密性、離子室的真空度均符合要求，然后檢驗(yàn)儀器測(cè)定C02中S13C的精密度和穩(wěn)定性，必要時(shí)調(diào)整離子源參數(shù)值;設(shè)置在線反應(yīng)裝置的參數(shù)，例如確保在線反應(yīng)裝置具有氧化性，溫度設(shè)置為99.8°C。[0030](3)有益效果：[0031]本發(fā)明的原理是通過(guò)除雜排除蛋白質(zhì)、脂肪和糖對(duì)牛奶樣品中苯甲酸分析的干擾，根據(jù)各有機(jī)成分在色譜柱中的保留時(shí)間差異分開(kāi)苯甲酸和其他有機(jī)組分，優(yōu)化液相色譜-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜的條件，將苯甲酸氧化生成C02進(jìn)行碳同位素比值分析。本發(fā)明首次實(shí)現(xiàn)了可以不經(jīng)過(guò)完全離線提純苯甲酸、不存在衍生和裂解反應(yīng)引發(fā)的同位素分餾風(fēng)險(xiǎn)以及自動(dòng)進(jìn)樣、自動(dòng)分離并測(cè)定牛奶中苯甲酸S13C，有利于苯甲酸穩(wěn)定同位素技術(shù)在牛奶質(zhì)量安全控制研究與應(yīng)用?！揪唧w實(shí)施方式】：[0032]下面將通過(guò)借助以下實(shí)施例來(lái)更詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明。以下實(shí)施例僅是說(shuō)明性的，應(yīng)該明白，本發(fā)明并不受下述實(shí)施例的限制。[0033]實(shí)施例一：[0034]1材料方法[0035]1.1儀器[0036]液相色譜儀（LC)，在線轉(zhuǎn)化裝置（IsoLink)，穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀（DeltaVAdvantage)，上述儀器均購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；電子分析天平(梅特勒-托利多國(guó)際股份有限公司）；過(guò)濾器。[0037]1.2試劑[0038]苯甲酸工作標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（S13CPDB=-27.37%。）；屈臣氏蒸餾水;濃硫酸;過(guò)二硫酸鈉;正磷酸。[0039]1.3前處理?xiàng)l件[0040]以苯甲酸工作標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和蒸餾水為研究對(duì)象，配制〇.3g/L的苯甲酸水溶液，置于2mL進(jìn)樣小瓶中。[0041]1.4在線反應(yīng)裝置的工作條件[0042]配制80g/L的磷酸水溶液，配制40g/L的過(guò)二硫酸鈉水溶液，設(shè)定在線反應(yīng)裝置工作溫度為65°C，磷酸水溶液和過(guò)二硫酸鈉水溶液的流速均為60yL/min。[0043]1.5液相色譜-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜的條件[0044]色譜條件:HyperREZXPCarbonhydrateH+液相色譜柱（300mm*7.7mm*8iim);流動(dòng)相為pH=2的硫酸溶液;進(jìn)樣體積20yL。[0045]調(diào)整液相色譜-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜的參數(shù):設(shè)定流動(dòng)相流速為0.3mL/min;設(shè)定色譜柱溫度為65°C;同時(shí)監(jiān)測(cè)m/z=32、33和34的離子流信號(hào)強(qiáng)度，確保m/z=32的離子流信號(hào)強(qiáng)度為l〇〇〇〇mV。[0046]1.6測(cè)定結(jié)果[0047]苯甲酸水溶液經(jīng)自動(dòng)進(jìn)樣器自動(dòng)采樣、進(jìn)樣后，在色譜柱中進(jìn)行反復(fù)吸附、解析后形成完整色譜峰，經(jīng)在線轉(zhuǎn)化裝置中轉(zhuǎn)化成C02,用穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀測(cè)定S13C，連續(xù)10次在線測(cè)定的結(jié)果如表1所示。[0048]表1苯甲酸水溶液的重復(fù)測(cè)定結(jié)果[0050]由上表可知，本發(fā)明提供的方法實(shí)現(xiàn)了苯甲酸溶液的自動(dòng)進(jìn)樣，苯甲酸的保留時(shí)間為2600s，而續(xù)10次在線測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)偏差僅為0.18%。，滿(mǎn)足國(guó)際上對(duì)有機(jī)物碳同位測(cè)定的重復(fù)性要求。[0051]實(shí)施例二[0052]2材料方法[0053]2.1儀器[0054]液相色譜儀（IX)，在線轉(zhuǎn)化裝置（IsoLink)，穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀（DeltaVAdvantage)，上述儀器均購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；電子分析天平(梅特勒-托利多國(guó)際股份有限公司）；過(guò)濾器;高速離心機(jī);超聲振蕩儀;氮吹儀。[0055]2.2試劑[0056]市售牛奶;屈臣氏蒸餾水;濃硫酸;過(guò)二硫酸鈉;正磷酸。[0057]2.3樣品除雜[0058]以市售牛奶為研究對(duì)象，按照國(guó)標(biāo)GB21703中處理牛奶樣品的方法進(jìn)行預(yù)處理，除去蛋白質(zhì)脂肪及大部分乳糖，使用氮吹儀除去上述過(guò)程中引入的有機(jī)試劑，得到樣品混合物。[0059]用蒸餾水溶解樣品混合物，保存于2mL進(jìn)樣小瓶中。[0060]2.4在線反應(yīng)裝置的工作條件[0061]配制80g/L的磷酸水溶液，配制40g/L的過(guò)二硫酸鈉水溶液，設(shè)定在線反應(yīng)裝置工作溫度為65°C，磷酸水溶液和過(guò)二硫酸鈉水溶液的流速均為60yL/min。[0062]2.5液相色譜-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜的條件[0063]色譜條件:HyperREZXPCarbonhydrateH+液相色譜柱（300mm*7.7mm*8iim);流動(dòng)相為pH=2的硫酸溶液;進(jìn)樣體積20yL。[0064]調(diào)整液相色譜-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜的參數(shù):設(shè)定流動(dòng)相流速為0.3mL/min;設(shè)定色譜柱溫度為65°C;同時(shí)監(jiān)測(cè)m/z=32、33和34的離子流信號(hào)強(qiáng)度，確保m/z=32的離子流信號(hào)強(qiáng)度為l〇〇〇〇mV。[0065]2.6測(cè)定結(jié)果[0066]牛奶樣品經(jīng)除雜后用水溶解，通過(guò)自動(dòng)進(jìn)樣器自動(dòng)采樣、進(jìn)樣后，在色譜柱中進(jìn)行反復(fù)吸附、解析后形成完整色譜峰，經(jīng)在線轉(zhuǎn)化裝置中轉(zhuǎn)化成C02,用穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀測(cè)定S13C，連續(xù)10次在線測(cè)定的結(jié)果如表2所示。[0067]表2牛奶中苯甲酸重復(fù)測(cè)定結(jié)果[0069]由質(zhì)譜圖（圖略）可知，牛奶樣品即使經(jīng)除雜步驟，剩余物中也是各有機(jī)物的混合物，而不僅僅是苯甲酸，在這種情況下，意圖通過(guò)離線的前處理方式獲得純的苯甲酸用于同位素組成分析是很困難的。使用本方法，雖然樣品瓶中是苯甲酸與其他有機(jī)物的混合物，但自動(dòng)進(jìn)樣自動(dòng)采集樣品并進(jìn)樣，提高了工作效率，并且利用液相色譜柱的分離作用實(shí)現(xiàn)了苯甲酸與其他有機(jī)物質(zhì)的有效分離。由表2可知，盡管測(cè)定結(jié)果的最大偏差為0.75%。，但10次測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)偏差僅為0.21%。，這說(shuō)明盡管樣品中成分比較復(fù)雜，但是該發(fā)明的方法能夠排除其他有機(jī)成分對(duì)樣品的苯甲酸衍生物S13C測(cè)定的干擾，該精密度也滿(mǎn)足碳同位素組成分析的重復(fù)性要求。[0070]實(shí)施例三[0071]3材料方法[0072]3.1儀器[0073]液相色譜儀（IX)，在線轉(zhuǎn)化裝置（IsoLink)，穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀（DeltaVAdvantage)，上述儀器均購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；電子分析天平(梅特勒-托利多國(guó)際股份有限公司）；過(guò)濾器;高速離心機(jī);超聲振蕩儀;氮吹儀。[0074]3.2試劑[0075]苯甲酸工作標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(S13CPDB=-27.37%Q);市售牛奶(與實(shí)施例二相同）；屈臣氏蒸餾水;濃硫酸;過(guò)二硫酸鈉;正磷酸。[0076]3.3樣品準(zhǔn)備[0077]根據(jù)市售牛奶的苯甲酸含量，按照其苯甲酸含量25%、50%、75%的比例加入苯甲酸工作標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，[0078]3.4樣品除雜[0079]以市售牛奶為研究對(duì)象，按照國(guó)標(biāo)GB21703中處理牛奶樣品的方法進(jìn)行預(yù)處理，除去蛋白質(zhì)脂肪及大部分乳糖，使用氮吹儀除去上述過(guò)程中引入的有機(jī)試劑，得到樣品混合物。[0080]用蒸餾水溶解樣品混合物，保存于2mL進(jìn)樣小瓶中。[0081]3.5在線反應(yīng)裝置的工作條件[0082]配制80g/L的磷酸水溶液，配制40g/L的過(guò)二硫酸鈉水溶液，設(shè)定在線反應(yīng)裝置工作溫度為65°C，磷酸水溶液和過(guò)二硫酸鈉水溶液的流速均為60yL/min。[0083]3.6液相色譜-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜的條件[0084]色譜條件:HyperREZXPCarbonhydrateH+液相色譜柱（300mm*7.7mm*8iim);流動(dòng)相為pH=2的硫酸溶液;進(jìn)樣體積20yL。[0085]調(diào)整液相色譜-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜的參數(shù):設(shè)定流動(dòng)相流速為0.3mL/min;設(shè)定色譜柱溫度為65°C;同時(shí)監(jiān)測(cè)m/z=32、33和34的離子流信號(hào)強(qiáng)度，確保m/z=32的離'流信號(hào)強(qiáng)度為l〇〇〇〇mV。[0086]3.7測(cè)定結(jié)果[0087]由實(shí)施例二可知，該牛奶樣品中苯甲酸S13C的平均測(cè)定結(jié)果為-14.92%。，因此可以根據(jù)加標(biāo)量以及苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的S13c值預(yù)測(cè)牛奶加標(biāo)后的苯甲酸S13〇j_(見(jiàn)表3)。牛奶加標(biāo)樣品經(jīng)除雜后用水溶解，通過(guò)自動(dòng)進(jìn)樣器自動(dòng)采樣、進(jìn)樣后，在色譜柱中進(jìn)行反復(fù)吸附、解析后形成完整色譜峰，經(jīng)在線轉(zhuǎn)化裝置中轉(zhuǎn)化成C02，用穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀測(cè)定，結(jié)果如表3所示。[0088]表3牛奶加標(biāo)樣品中苯甲酸S13C值測(cè)定結(jié)果[0090]由表3可知，加標(biāo)樣品中苯甲酸S13C的測(cè)定值與預(yù)測(cè)值存在差異，這是由于儀器的測(cè)定誤差決定的，當(dāng)然，樣品除雜過(guò)程中也可能會(huì)導(dǎo)致苯甲酸S13C發(fā)生變化，但是，對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明加標(biāo)樣品苯甲酸S13C的測(cè)定結(jié)果與加標(biāo)量呈顯著正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.99%，這說(shuō)明本方法能夠準(zhǔn)確測(cè)定混合物中苯甲酸S13C值。[0091]最后應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍內(nèi)?！局鳈?quán)項(xiàng)】1.一種應(yīng)用液相色譜-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜在線測(cè)定牛奶中苯甲酸δ13(：值的方法，包括以下步驟：1)對(duì)所測(cè)定的牛奶進(jìn)行除雜，以除去其中的纖維素、脂肪和蛋白質(zhì)，以及牛奶中大部分的糖類(lèi)；2)除去除雜過(guò)程中引入的有機(jī)溶劑；3)用水稀釋除雜后得到制備液;和4)將制備液進(jìn)樣至液相色譜-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀以測(cè)定牛奶中苯甲酸的δ13(：值。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中牛奶中苯甲酸與其他有機(jī)物經(jīng)液相色譜分離后，在反應(yīng)爐中轉(zhuǎn)化為C02后進(jìn)行穩(wěn)定同位素比值分析，得到苯甲酸的δ13〇?Μ直。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中液相色譜所使用的流動(dòng)相為硫酸和超純水配制的pH為0~6的溶液，優(yōu)選pH為2。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中液相色譜所使用的色譜柱為氫離子交換色譜柱，優(yōu)選為HyperREZXPCarbonhydrateH+液相色譜柱。5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其中稀釋后的苯甲酸含量為0.1~1.2g/L，優(yōu)選為〇.3g/L。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的進(jìn)樣是自動(dòng)進(jìn)樣。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于調(diào)整液相色譜-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜的參數(shù):設(shè)定流動(dòng)相流速為0.25~0.6mL/min，優(yōu)選為0.3mL/min;設(shè)定色譜柱溫度為20~75°C，優(yōu)選為65°C;同時(shí)監(jiān)測(cè)m/z=32、33和34的離子流信號(hào)強(qiáng)度，確保m/z=32的離子流信號(hào)強(qiáng)度為8000mV~18000mV，優(yōu)選為1OOOOmV。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中用δ13(：值已知的物質(zhì)校正儀器的系統(tǒng)偏差A(yù)13C，即，采用與牛奶測(cè)定時(shí)相同的儀器參數(shù)測(cè)定參考物質(zhì)或工作標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，得出測(cè)定值313(^，與其已知的記為S13Co的δ13(：值相比較得出儀器的系統(tǒng)偏差Δ13C:Δ9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述牛奶是市售牛奶。10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述除雜處理是按照國(guó)標(biāo)GB21703進(jìn)行的?！疚臋n編號(hào)】G01N30/02GK106053637SQ201610353980【公開(kāi)日】2016年10月26日【申請(qǐng)日】2016年5月25日【發(fā)明人】鐘其頂,王道兵【申請(qǐng)人】中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院