本發(fā)明屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法。在發(fā)酵過(guò)程中外源添加微生物的代謝產(chǎn)物，刺激微生物生產(chǎn)透明質(zhì)酸，從而提高透明質(zhì)酸產(chǎn)量的方法。

背景技術(shù)：

透明質(zhì)酸(簡(jiǎn)稱HA)，又稱玻璃酸。是一種以N-乙酰氨基葡萄糖和β-D-葡萄糖醛酸作為雙糖單位聚合而成的，呈酸性的高分子粘多糖。透明質(zhì)酸的分子量在幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)之間。透明質(zhì)酸一般是白色的無(wú)定型固體，無(wú)色無(wú)味，有強(qiáng)吸濕性，極易溶于水，不溶于有機(jī)溶劑。透明質(zhì)酸在空間上形成200nm的剛性螺旋柱形，柱的內(nèi)側(cè)由于羥基產(chǎn)生強(qiáng)烈親水性；同時(shí)，由于羥基的連續(xù)定向排列，在透明質(zhì)酸分子鏈上形成高度憎水區(qū)。所以即使在濃度很低時(shí)，透明質(zhì)酸也可形成三維蜂窩網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。透明質(zhì)酸吸水能力非常強(qiáng)，水溶液的滲透壓和黏彈性較好，親和吸附的水分約為本身質(zhì)量的1000倍，所以它是公認(rèn)的天然保濕因子，在醫(yī)藥、化妝品、食品等領(lǐng)域都有獨(dú)特的應(yīng)用價(jià)值。

在自然界中，HA廣泛分布于高等動(dòng)物的的各種組織中?，F(xiàn)在人們已經(jīng)從臍帶、皮膚、人血清、雞冠、關(guān)節(jié)液、腦軟骨、眼玻璃體、雞胚、人尿、動(dòng)靜脈壁中分離到HA。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，以玻璃體、關(guān)節(jié)液、臍帶中的透明質(zhì)酸含量最高，雞冠中的HA含量和關(guān)節(jié)滑液中相似。通常，HA與蛋白質(zhì)結(jié)合后同其他粘多糖共存；在眼玻璃體和關(guān)節(jié)滑液中，以溶解形式存在；在雞冠和臍帶中，以凝膠形式存在。

目前，制備透明質(zhì)酸主要有兩種途徑：一種是從動(dòng)物組織中提??；一種是從微生物發(fā)酵液中提取。從動(dòng)物組織中提取HA常用的原料有雞冠、臍帶、豬皮等，主要工藝過(guò)程包括脫水、磨碎、浸泡、提取、除雜、沉淀和分離。原料不同，HA的提取有一定的差異。

上世紀(jì)70年代，有人開始利用微生物發(fā)酵來(lái)生產(chǎn)透明質(zhì)酸，日本資生堂于1985年首次報(bào)道了用鏈球菌生產(chǎn)HA的方法。已報(bào)道的常用的產(chǎn)透明質(zhì)酸菌主要為伯杰氏手冊(cè)中鏈球菌屬的A組與C組，其中A組鏈球菌主要是化膿鏈球菌等，系人體致病菌，不宜作為生產(chǎn)菌種。C群鏈球菌為非人體致病菌，比較適合于工業(yè)生產(chǎn)。目前，國(guó)外利用C群鏈球菌生產(chǎn)透明質(zhì)酸早已達(dá)到產(chǎn)業(yè)化階段。利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)HA的質(zhì)量和數(shù)量主要取決于以下幾個(gè)方面：高產(chǎn)菌種的選育、培養(yǎng)基的選配、發(fā)酵工藝優(yōu)化及發(fā)酵過(guò)程的控制、分離提純。發(fā)酵法生產(chǎn)透明質(zhì)酸因成本低、原料豐富、易規(guī)?；a(chǎn)、所得透明質(zhì)酸的分子質(zhì)量高，正逐漸取代組織提取法。

隨著人民生活水平的逐步提高，透明質(zhì)酸在高級(jí)化妝品、食品、藥物等諸多方面的應(yīng)用將更加廣泛，透明質(zhì)酸產(chǎn)品需求量也將持續(xù)增長(zhǎng)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種在發(fā)酵過(guò)程中外源添加代謝產(chǎn)物提高透明質(zhì)酸產(chǎn)量的方法。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種在發(fā)酵過(guò)程中外源添加代謝產(chǎn)物提高透明質(zhì)酸產(chǎn)量的方法，利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸過(guò)程中，額外添加乳酸和/或乙酸。

其中，所述的微生物優(yōu)選為獸疫鏈球菌，最優(yōu)選獸疫鏈球菌ATCC 39920。

其中，微生物發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸的發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)選為：葡萄糖40g/L、酵母粉5g/L、蛋白胨17g/L、牛肉粉5g/L、MgSO₄·7H₂O 2.0g/L、NaCl 2.0g/L、KH₂PO₄ 10mmol/L，pH7.0。

其中，微生物發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸的溫度優(yōu)選為30-40℃(優(yōu)選36℃)，通氣率優(yōu)選為0.5-4vvm，優(yōu)選4vvm。

其中，微生物發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸的總反應(yīng)時(shí)間(僅指發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間，不包含種子液培養(yǎng)時(shí)間)優(yōu)選為10-20h。

其中，在微生物發(fā)酵過(guò)程中的前期，額外添加乳酸和/或乙酸。優(yōu)選的是，在微生物開始發(fā)酵5-6h后，額外添加乳酸和/或乙酸。

其中，所述的乳酸外源添加量?jī)?yōu)選為10-40g/L，最優(yōu)選40g/L。

其中，所述的乙酸外源添加量?jī)?yōu)選為0.5-6g/L，最優(yōu)選0.5g/L。

作為本發(fā)明最優(yōu)選的方式，是乳酸和乙酸作為外源添加物共同添加。

微生物發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸的過(guò)程中，微生物利用碳源時(shí)，除合成菌莢膜透明質(zhì)酸外，主要碳源被利用來(lái)生產(chǎn)代謝產(chǎn)物(主要為乳酸和乙酸)，抑制了透明質(zhì)酸的合成和菌體生物量的生長(zhǎng)。外源添加代謝產(chǎn)物(乳酸、乙酸的一種或兩種的混合物)在發(fā)酵過(guò)程中改變碳源分布，刺激微生物重新定向碳源分布，使得碳源在生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中更多的是朝向透明質(zhì)酸的合成。

有益效果：本發(fā)明可有效提高微生物生產(chǎn)透明質(zhì)酸的產(chǎn)量，通過(guò)在微生物發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸的過(guò)程中，外源添加代謝產(chǎn)物(乳酸、乙酸的一種或兩種的混合物)，刺激微生物生產(chǎn)更多的菌莢膜透明質(zhì)酸，改變碳源分布，使得碳源在生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中更多朝向透明質(zhì)酸合成的方向。按照本發(fā)明的方法，可有效提高透明質(zhì)酸的產(chǎn)量。

具體實(shí)施方式

根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的內(nèi)容僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。

以下實(shí)施例所用的獸疫鏈球菌為ATCC 39920。

以下實(shí)施例所用的種子培養(yǎng)基的配制：所述種子培養(yǎng)基組成：葡萄糖10g/L、酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、牛肉粉5g/L、MgSO₄·7H₂O 1.0g/L、NaCl 2.0g/L、NaH₂PO₄ 2.0g/L，種子培養(yǎng)基預(yù)先用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至7.0后滅菌；

以下實(shí)施例所用的發(fā)酵培養(yǎng)基的配制，所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成：葡萄糖40g/L、酵母粉5g/L、蛋白胨17g/L、牛肉粉5g/L、MgSO₄·7H₂O 2.0g/L、NaCl 2.0g/L、KH₂PO₄ 10mmol/L，發(fā)酵培養(yǎng)基預(yù)先用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至7.0后滅菌。

對(duì)照實(shí)施例1：

用獸疫鏈球菌發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸，包括如下步驟：

(1)將-80℃冰箱保存的甘油菌獸疫鏈球菌ATCC 39920接種至固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，得到獸疫鏈球菌ATCC 39920菌體；

(2)將得到的菌體接入裝有100mL的種子培養(yǎng)基的搖瓶中，接種量為5％v/v。在搖床上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：轉(zhuǎn)速150rpm，初始pH為7.0，發(fā)酵溫度為36℃，培養(yǎng)時(shí)間為9-10小時(shí)；

(3)將步驟(2)得到的種子液接入裝有400mL發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，接種量為10％v/v，培養(yǎng)的條件為：轉(zhuǎn)速800r/min，初始pH值為7.0，發(fā)酵溫度為36℃，通氣率為4vvm，培養(yǎng)時(shí)間為10h，透明質(zhì)酸產(chǎn)量為3.0g/L。

實(shí)施例2：

同實(shí)施例1的方法，所不同的是，發(fā)酵罐發(fā)酵采用乳酸外源添加策略，培養(yǎng)時(shí)間為12h。步驟(3)發(fā)酵5h時(shí)添加乳酸(5g/L)。結(jié)果：透明質(zhì)酸產(chǎn)量由3.0g/L降低為2.1g/L。

實(shí)施例3：

同實(shí)施例1的方法，所不同的是，發(fā)酵罐發(fā)酵采用乳酸外源添加策略，培養(yǎng)時(shí)間為12h。步驟(3)發(fā)酵5h后添加乳酸(10g/L)。結(jié)果：透明質(zhì)酸產(chǎn)量由3.0g/L提高到3.6g/L。

實(shí)施例4：

同實(shí)施例1的方法，所不同的是，發(fā)酵罐發(fā)酵采用乳酸外源添加策略，培養(yǎng)時(shí)間為14h。步驟(3)發(fā)酵5h后添加乳酸(20g/L)。結(jié)果：透明質(zhì)酸產(chǎn)量由3.0g/L提高到4.3g/L。

實(shí)施例5：

同實(shí)施例1的方法，所不同的是，發(fā)酵罐發(fā)酵采用乳酸外源添加策略，培養(yǎng)時(shí)間為18h。步驟(3)發(fā)酵5h后添加乳酸(30g/L)。結(jié)果：透明質(zhì)酸產(chǎn)量由3.0g/L提高到5.2g/L。

實(shí)施例6：

同實(shí)施例1的方法，所不同的是，發(fā)酵罐發(fā)酵采用乳酸外源添加策略，培養(yǎng)時(shí)間為20h。步驟(3)發(fā)酵5h后添加乳酸(40g/L)。結(jié)果：透明質(zhì)酸產(chǎn)量由3.0g/L提高到6.0g/L。

實(shí)施例7：

同實(shí)施例1的方法，所不同的是，發(fā)酵罐發(fā)酵采用乳酸外源添加策略，培養(yǎng)時(shí)間為20h。步驟(3)發(fā)酵5h時(shí)添加乳酸(50g/L)。結(jié)果：透明質(zhì)酸產(chǎn)量由3g/L降到2.3g/L。

實(shí)施例8：

同實(shí)施例1的方法，所不同的是，發(fā)酵罐發(fā)酵采用乙酸外源添加策略，培養(yǎng)時(shí)間為16h。步驟(3)發(fā)酵5h后添加乙酸(0.5g/L)。結(jié)果：透明質(zhì)酸產(chǎn)量由3.0g/L提高到4.7g/L。

實(shí)施例9：

同實(shí)施例1的方法，所不同的是，發(fā)酵罐發(fā)酵采用乙酸外源添加策略，培養(yǎng)時(shí)間為18h。步驟(3)發(fā)酵5h后添加乙酸(1g/L)。結(jié)果：透明質(zhì)酸產(chǎn)量由3.0g/L提高到3.8g/L。

實(shí)施例10：

同實(shí)施例1的方法，所不同的是，發(fā)酵罐發(fā)酵采用乙酸外源添加策略，培養(yǎng)時(shí)間為16h。步驟(3)發(fā)酵5h后添加乙酸(2g/L)。結(jié)果：透明質(zhì)酸產(chǎn)量由3.0g/L提高到3.6g/L。

實(shí)施例11：

同實(shí)施例1的方法，所不同的是，發(fā)酵罐發(fā)酵采用乙酸外源添加策略，發(fā)酵溫度為34℃，通氣率為2vvm，培養(yǎng)時(shí)間為14h。步驟(3)發(fā)酵5h后添加乙酸(6g/L)。結(jié)果：透明質(zhì)酸產(chǎn)量由3.0g/L提高到3.2g/L。

實(shí)施例12：

同實(shí)施例1的方法，所不同的是，發(fā)酵罐發(fā)酵采用乙酸外源添加策略，發(fā)酵溫度為36℃，通氣率為4vvm，培養(yǎng)時(shí)間為18h。步驟(3)發(fā)酵5h后添加乙酸(8g/L)。結(jié)果：透明質(zhì)酸產(chǎn)量由3.0g/L降到2.6g/L。

實(shí)施例13：

同實(shí)施例1的方法，所不同的是，發(fā)酵罐發(fā)酵采用乙酸外源添加策略，發(fā)酵溫度為36℃，通氣率為3.5vvm，培養(yǎng)時(shí)間為20h。步驟(3)發(fā)酵5h后添加乙酸(10g/L)。結(jié)果：透明質(zhì)酸產(chǎn)量由3.0g/L降到1.6g/L。

實(shí)施例14：

同實(shí)施例1的方法，所不同的是，發(fā)酵罐發(fā)酵采用乳酸和乙酸共外源添加策略，發(fā)酵溫度為36℃，通氣率為4vvm，培養(yǎng)時(shí)間為20h。步驟(3)發(fā)酵5h后添加乳酸(40g/L)和乙酸(6g/L)。結(jié)果：透明質(zhì)酸產(chǎn)量由3.0g/L提高到3.2g/L。

實(shí)施例15：

同實(shí)施例1的方法，所不同的是，發(fā)酵罐發(fā)酵采用乳酸和乙酸共外源添加策略，發(fā)酵溫度為36℃，通氣率為4vvm，培養(yǎng)時(shí)間為20h。步驟(3)發(fā)酵5h后添加乳酸(40g/L)和乙酸(0.5g/L)。結(jié)果：透明質(zhì)酸產(chǎn)量由3.0g/L提高到7.8g/L。

實(shí)施例16：

同實(shí)施例1的方法，所不同的是，發(fā)酵罐發(fā)酵采用乳酸和乙酸共外源添加策略，發(fā)酵溫度為36℃，通氣率為4vvm，培養(yǎng)時(shí)間為20h。步驟(3)發(fā)酵5h后添加乳酸(10g/L)和乙酸(6g/L)。結(jié)果：透明質(zhì)酸產(chǎn)量由3.0g/L提高到3.8g/L。

實(shí)施例17：

同實(shí)施例1的方法，所不同的是，發(fā)酵罐發(fā)酵采用乳酸和乙酸共外源添加策略，發(fā)酵溫度為36℃，通氣率為4vvm，培養(yǎng)時(shí)間為20h。步驟(3)發(fā)酵5h后添加乳酸(20g/L)和乙酸(1g/L)。結(jié)果：透明質(zhì)酸產(chǎn)量由3.0g/L提高到4.7g/L。

實(shí)施例18：

同實(shí)施例1的方法，所不同的是，發(fā)酵罐發(fā)酵采用乳酸和乙酸共外源添加策略，發(fā)酵溫度為36℃，通氣率為4vvm，培養(yǎng)時(shí)間為20h。步驟(3)發(fā)酵5h后添加乳酸(30g/L)和乙酸(2g/L)。結(jié)果：透明質(zhì)酸產(chǎn)量由3.0g/L提高到4.1g/L。

實(shí)施例19：

同實(shí)施例1的方法，所不同的是，發(fā)酵罐發(fā)酵采用乳酸和乙酸共外源添加策略，發(fā)酵溫度為36℃，通氣率為4vvm，培養(yǎng)時(shí)間為20h。步驟(3)發(fā)酵5h后添加乳酸(10g/L)和乙酸(0.5g/L)。結(jié)果：透明質(zhì)酸產(chǎn)量由3.0g/L提高到5.0g/L。

實(shí)施例20：

同實(shí)施例1的方法，所不同的是，發(fā)酵罐發(fā)酵采用乳酸和乙酸共外源添加策略，發(fā)酵溫度為36℃，通氣率為4vvm，培養(yǎng)時(shí)間為20h。步驟(3)發(fā)酵5h后添加乳酸(40g/L)和乙酸(6g/L)。結(jié)果：透明質(zhì)酸產(chǎn)量由3.0g/L降到1.8g/L。