本發(fā)明屬于利用生物催化制備脂類(lèi)的領(lǐng)域，具體涉及以生物酶制劑作為催化劑，以大豆磷脂、EPA或其酯化衍生物和/或DHA或其酯化衍生物為原料，制備PLA1型n-3多不飽和脂肪酸磷脂的方法。

背景技術(shù)：

多不飽和脂肪酸(PUFA)是指碳原子數(shù)不少于18且含有兩個(gè)以上雙鍵的一類(lèi)脂肪酸；其中，第一個(gè)雙鍵出現(xiàn)在碳鏈甲基端第3位的PUFA稱(chēng)為n-3多不飽和脂肪酸。n-3多不飽和脂肪酸的典型實(shí)例包括二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)。大量藥理及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，DHA為視網(wǎng)膜正常發(fā)育和神經(jīng)系統(tǒng)正常功能的行使所必需。在大腦和視網(wǎng)膜中，DHA分別占該處脂肪酸總量的約20％及約35％，并主要以磷脂形式存在。數(shù)據(jù)表明，DHA從妊娠26-40周開(kāi)始在胎兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)細(xì)胞中積累；與妊娠26周相比，妊娠最后3個(gè)月胎兒大腦和小腦中DHA含量增加了三至五倍。提高嬰兒時(shí)期DHA的攝入量明顯促進(jìn)大腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和樹(shù)突的形成，因此有助于提高學(xué)習(xí)記憶能力。不僅如此，DHA還有利于預(yù)防老年癡呆的發(fā)生。研究表明，與健康老年人相比，老年癡呆患者大腦海馬細(xì)胞的DHA含量降低近10％；給予DHA則有助于病癥的減緩。此外，脂肪酸鏈長(zhǎng)及不飽和度與視網(wǎng)膜中的光感受膜的液態(tài)性、流動(dòng)性、屈折性、透過(guò)性密切相關(guān)。DHA供給不足時(shí)，眼睛的感光能力及視力都會(huì)出現(xiàn)明顯的下降。另一方面，EPA作為一種多不飽和脂肪酸化學(xué)信使，在免疫和炎癥反應(yīng)中起到重要作用。具體而言，EPA可通過(guò)調(diào)控血小板和血管壁處磷脂酰甘油(PG)的產(chǎn)生而發(fā)揮抗血栓作用；還通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制使得經(jīng)由花生四烯酸路徑合成的PGE2降低，從而減輕急性炎癥反應(yīng)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，EPA能夠顯著降低血甘油三酯水平。

DHA及EPA的上述生理功效為全球研究人員及消費(fèi)者公認(rèn)。然而，制備商業(yè)化的DHA或EPA膳食補(bǔ)充劑仍存在許多問(wèn)題。特別地，商業(yè) 化的DHA及EPA主要以乙酯或甘油三酯形式存在，在吸收效率及氧化穩(wěn)定性方面仍不合期望。小鼠實(shí)驗(yàn)表明，與磷脂形式的DHA或EPA相比，大腦、肝臟及腎臟等器官吸收乙酯或甘油三酯形式的DHA或EPA的速率降低了兩倍以上。此外，甘油三酯作為能量源，通常經(jīng)過(guò)體內(nèi)消化吸收后直接進(jìn)入能量代謝途徑用于產(chǎn)生ATP，或者被輸運(yùn)至脂肪細(xì)胞作為能量?jī)?chǔ)備。因此，甘油三酯形式的DHA或EPA僅被用作燃料，并未發(fā)揮其功能優(yōu)勢(shì)。與此相反地，磷脂形式的多不飽和脂肪酸天然存在于體內(nèi)的膜結(jié)構(gòu)中，磷脂形式的DHA或EPA更易發(fā)揮其生物活性。

磷脂是一類(lèi)含有磷酸基的脂類(lèi)，一般地具有親水性的頭部和疏水性的尾部；所述親水性頭部由磷酸基及與磷酸基相連的取代基(例如含氨堿或醇類(lèi))構(gòu)成，所述疏水性尾部由脂肪酸鏈構(gòu)成。機(jī)體內(nèi)的磷脂主要分為兩類(lèi)，以甘油作為骨架的磷脂稱(chēng)為甘油磷脂，以神經(jīng)鞘氨醇作為骨架的磷脂稱(chēng)為鞘磷脂。

甘油磷脂結(jié)構(gòu)通式

甘油磷脂是甘油、磷脂和脂肪酸的衍生物。根據(jù)X基團(tuán)的不同，可將甘油磷脂分為磷脂酸(PA)、磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)等。如果甘油磷脂的甘油基1位與2位的兩個(gè)羥基中僅有一個(gè)被脂肪酸酯化，則稱(chēng)為溶血磷脂(LPL)。相應(yīng)地，根據(jù)X基團(tuán)的不同，可將溶血磷脂分為溶血磷脂酸(LPA)、溶血磷脂酰膽堿(LPC)、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)、溶血磷脂酰肌醇(LPI)等。

如上所述，脂肪酸鏈殘基可位于磷酸甘油基的1位或2位(分別如結(jié)構(gòu)通式中的R₁和R₂所示)。特異性催化磷酸甘油基1位和2位酯鍵水解、生成游離脂肪酸的可逆反應(yīng)的酶分別被稱(chēng)為PLA1酶和PLA2酶。人體小腸內(nèi)存在的磷脂酶即屬于PLA2酶。被攝入體內(nèi)的磷脂分子在小腸內(nèi)被水解為2-溶血甘油基磷脂(2-Lyso-PL)和對(duì)應(yīng)于R₂的游離脂肪酸。 研究表明，經(jīng)小腸消化吸收后，此類(lèi)游離脂肪酸大部分將與單甘油酯結(jié)合生成甘油三酯，并以甘油三酯的形式參與體內(nèi)代謝。因此，存在于脂甘油基2位的多不飽和脂肪酸(稱(chēng)為PLA2型多不飽和脂肪酸)在體內(nèi)并不能完全發(fā)揮其調(diào)節(jié)生理功能的作用。基于這種考慮，近年來(lái)，越來(lái)越多的研究關(guān)注PLA1型多不飽和脂肪酸的代謝機(jī)理及生物活性。研究證明，PLA1型DHA或EPA磷脂使得DHA或EPA不但以高生物活性的磷脂形式進(jìn)入體內(nèi)，而且以該形式參與肝內(nèi)的脂蛋白的合成，進(jìn)而有可能最終進(jìn)入大腦?？梢?jiàn)，PLA1型多不飽和脂肪酸磷脂為具有生物活性的形式。

本領(lǐng)域已開(kāi)發(fā)了多種將DHA和/或EPA接入磷脂PLA1位的方法。特別地，如參考文獻(xiàn)1-9所示出的，隨著酶工程的快速發(fā)展，已將具有PLA1位催化作用的磷脂酶用在催化n-3多不飽和脂肪酸接入的反應(yīng)中。

[參考文獻(xiàn)1]孫兆敏等，酶法制備n-3多不飽和脂肪酸型磷脂的工藝，《中國(guó)油脂》。

[參考文獻(xiàn)2]Xiang Li等，Production of Structured Phosphatidylcholine with High Content of DHA/EPA by Immobilized Phospholipase A1-Catalyzed Transesterification，Int.J.Mol.Sci.。

[參考文獻(xiàn)3]In-Hwan Kim等，Synthesis of Structured Phosphatidylcholine Containing n-3 PUFA Residues via Acidolysis Mediated by Immobilized Phospholipase A1，J.Am.Oil.Chem.Soc.。

[參考文獻(xiàn)4]In-Hwan Kim等，Phospholipase A1-catalyzed synthesis of phospholipids enriched in n-3 polyunsaturated fatty acid residues，Enzyme and Microbial Technology。

[參考文獻(xiàn)5]Hugo S.Garcia等，Enrichment of lecithin with n-3 fatty acids by acidolysis using immobilized phospholipase A1，GRASAS Y ACEITES。

[參考文獻(xiàn)6]TingTing Zhao，Immobilized phospholipase A1-catalyzed modification of phosphatidylcholine with n3 polyunsaturated fatty acid，F(xiàn)ood Chemistry。

[參考文獻(xiàn)7]Gudmundur G.Haraldsson等，Preparation of Phospholipids Highly Enriched with n-3 Polyunsaturated Fatty Acids by Lipase，J.Am.Oil.Chem.Soc.。

[參考文獻(xiàn)8]Masashi Hosokawa等，Application of Water Mimics on Preparation of Eicosapentaenoic and Docosahexaenoic Acids Containing Glycerolipids，J.Am.Oil.Chem.Soc.。

[參考文獻(xiàn)9]馬彥慶等，固定化磷脂酶A1催化制備DHA型磷脂，《中國(guó)糧油學(xué)報(bào)》。

然而，上述文獻(xiàn)報(bào)道的方法均存在缺陷。具體而言，參考文獻(xiàn)1-6和9均采用由諾維信公司商業(yè)化的PLA1酶催化DHA和EPA與磷脂的酯交換反應(yīng)。如本發(fā)明比較例所示出的，常用的多種PLA1酶對(duì)PLA1位的選擇并不強(qiáng)，PLA1位DHA或EPA的最高接入率也僅有總接入率的66wt％左右，無(wú)法滿(mǎn)足合成需求。此外，商業(yè)化上述酶制劑均為液態(tài)，目前尚無(wú)固定化產(chǎn)品，因此上述工藝并不具備工業(yè)實(shí)施性。

進(jìn)而，參考文獻(xiàn)1和2采用乙酯型n-3多不飽和脂肪酸在無(wú)溶劑條件下與磷脂進(jìn)行酯交換反應(yīng)，然而，由于脂肪酸乙酯和磷脂的互溶性和反應(yīng)體系均一性的局限，僅在脂肪酸乙酯與磷脂的重量比高達(dá)6:1(重量比近14:1)以上時(shí)方能實(shí)現(xiàn)該反應(yīng)，最佳總接入率也僅為25wt％左右。這樣的設(shè)置不但使得制備成本提高，獲得的PLA1型DHA和EPA磷脂的濃度也較低。參考文獻(xiàn)3-8和10以游離型DHA和EPA為原料，與磷脂進(jìn)行酯交換反應(yīng)。這樣的設(shè)置提高了DHA和EPA與磷脂的互溶性以及體系的均一性，因此大大降低了DHA和EPA的用量。然而，眾所周知的是，相比酯類(lèi)底物，游離型底物將大幅度降低固定化酶的使用壽命，從而提高了加工成本。更為重要的是，由于游離型脂肪酸不適宜人體直接服用，上述工藝均需進(jìn)行進(jìn)一步的純化步驟以除去產(chǎn)物中大量的游離脂肪酸，再次提高了制備成本。

另外，參考文獻(xiàn)9的工藝涉及乙二醇的添加，該物質(zhì)尚不屬于國(guó)家允許使用的食品添加劑，因此，工業(yè)可行性較差。

因此，還需探索位點(diǎn)選擇性更高、適應(yīng)性更好、工業(yè)可行性更好的PLA1型n-3多不飽和脂肪酸磷脂的制備方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

一方面，本發(fā)明提供了一種制備PLA1型n-3多不飽和脂肪酸磷脂的方法，所述方法包括如下步驟：

(1)在室溫下，將n-3多不飽和脂肪酸或其酯類(lèi)衍生物與大豆磷脂混合，獲得油脂混合物；

(2)將步驟(1)獲得的所述油脂混合物預(yù)熱至30℃-90℃，加入蒸餾水并混合，所述蒸餾水的加入量為步驟(3)中酶制劑加入量的0-6wt％；

(3)將固定化的RM IM脂肪酶加入至步驟(2)獲得的反應(yīng)混合物中，在30℃-90℃的溫度下進(jìn)行反應(yīng)，獲得PLA1型n-3多不飽和脂肪酸磷脂。

另一方面，本發(fā)明提供了根據(jù)第一方面所述的方法制得的PLA1型n-3多不飽和脂肪酸磷脂。

具體而言，本發(fā)明是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

1.一種制備PLA1型n-3多不飽和脂肪酸磷脂的方法，所述方法包括如下步驟：

(1)在室溫下，將n-3多不飽和脂肪酸或其酯類(lèi)衍生物與大豆磷脂混合，獲得油脂混合物；

(2)將步驟(1)獲得的所述油脂混合物預(yù)熱至30℃-90℃，加入蒸餾水并混合，所述蒸餾水的加入量為步驟(3)中酶制劑加入量的0-6wt％；

(3)將固定化的RM IM脂肪酶加入至步驟(2)獲得的反應(yīng)混合物中，在30℃-90℃的溫度下進(jìn)行反應(yīng)，獲得PLA1型n-3多不飽和脂肪酸磷脂。

2.如段落1所述的方法，其中，所述n-3多不飽和脂肪酸為DHA、EPA或二者的組合。

3.如段落2所述的方法，其中，所述DHA或其酯類(lèi)衍生物中，DHA的含量不低于50wt％、優(yōu)選不低于75wt％；所述EPA或其酯類(lèi)衍生物中，EPA的含量不低于50wt％、優(yōu)選不低于75wt％。

4.如段落3所述的方法，其中，所述DHA或其酯類(lèi)衍生物來(lái)自于魚(yú)油、海藻油、微生物油脂中的任一種，或上述油脂的任意組合；所述EPA或其酯類(lèi)衍生物來(lái)自于魚(yú)油、海藻油、微生物油脂中的任一種，或 上述油脂的任意組合。

5.如段落3-4中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述DHA或其酯類(lèi)衍生物選自于DHA的甲酯型衍生物、乙酯型衍生物、甘油酯型衍生物或游離型DHA，或者上述DHA或其酯類(lèi)衍生物的任意組合；所述EPA或其酯類(lèi)衍生物選自于EPA的甲酯型衍生物、乙酯型衍生物、甘油酯型衍生物或游離型EPA，或者上述EPA或其酯類(lèi)衍生物的任意組合；優(yōu)選地，所述DHA或其酯類(lèi)衍生物為DHA乙酯型衍生物；優(yōu)選地，所述EPA或其酯類(lèi)衍生物為EPA乙酯型衍生物。

6.如段落1-5中任一項(xiàng)所述的方法，其中，步驟(1)中，所述大豆磷脂中，磷脂的含量不低于75wt％、優(yōu)選不低于85wt％。

7.如段落1-6中任一項(xiàng)所述的方法，其中，步驟(1)中，所述n-3多不飽和脂肪酸甘油酯與所述大豆磷脂的重量比為(2-10):1、優(yōu)選(3-4):1。

8.如段落1-7中任一項(xiàng)所述的方法，其中，步驟(1)中，所述混合在無(wú)溶劑體系下進(jìn)行。

9.如段落1-7中任一項(xiàng)所述的方法，其中，步驟(1)中，所述混合在有機(jī)溶劑中進(jìn)行，所述有機(jī)溶劑選自于由正己烷、異己烷、丙酮所組成的組中的任一種或任意組合；優(yōu)選地，所述有機(jī)溶劑為正己烷。

10.如段落9所述的方法，其中，所述正己烷的加入量為：每100mg磷脂添加1ml正己烷。

11.如段落1-10中任一項(xiàng)所述的方法，其中，步驟(2)中，將步驟(1)獲得的所述油脂混合物預(yù)熱至45℃-65℃。

12.如段落1-11中任一項(xiàng)所述的方法，其中，步驟(2)中，所述蒸餾水的加入量為步驟(3)中酶制劑加入量的1.5-3.5wt％。

13.如段落1-11中任一項(xiàng)所述的方法，其中，步驟(3)中，所述固定化的RM IM脂肪酶的加入量為步驟(1)中所述油脂混合物的5wt％-35wt％，優(yōu)選10wt％-30wt％。

14.如段落1-12中任一項(xiàng)所述的方法，其中，步驟(3)中，所述反應(yīng)溫度為45℃-65℃。

15.如段落1-14中任一項(xiàng)所述的方法，其中，步驟(3)中，所述反 應(yīng)進(jìn)行1-48小時(shí)，優(yōu)選4-24小時(shí)。

16.根據(jù)段落1-15中任一項(xiàng)所述的方法制得的PLA1型n-3多不飽和脂肪酸磷脂。

17.如段落16所述的PLA1型n-3多不飽和脂肪酸磷脂，其中，所述PLA1型n-3多不飽和脂肪酸磷脂的接入率不低于20wt％、優(yōu)選不低于25wt％。

18.如段落16或17所述的PLA1型n-3多不飽和脂肪酸磷脂，其中，所述n-3多不飽和脂肪酸為DHA、EPA或二者的組合。

19.如段落16-18中任一項(xiàng)所述的PLA1型n-3多不飽和脂肪酸磷脂，其中，所述PLA1型n-3多不飽和脂肪酸磷脂中，磷脂型與溶血磷脂型產(chǎn)物的重量比為70:30至30:70、優(yōu)選80:20至40:60。

本發(fā)明所述的“室溫”是指環(huán)境溫度在16-26℃的溫度范圍。

有益效果

本發(fā)明首次提出在制備PLA1型n-3多不飽和脂肪酸磷脂的反應(yīng)中使用固定化的RM IM脂肪酶，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物中PLA1型n-3多不飽和脂肪酸磷脂占總n-3多不飽和脂肪酸磷脂的85wt％以上、甚至90wt％以上。相比于現(xiàn)有技術(shù)中使用商品化的Lecitase Ultra、TL IM、SP435等酶所實(shí)現(xiàn)的PLA1位催化反應(yīng)占比不超過(guò)66％的效果，本發(fā)明的方法大大提高了PLA1型功能性磷脂的產(chǎn)率。如上所述，對(duì)人體而言，與甘油三酯型及乙酯型n-3多不飽和脂肪酸相比，磷脂型、特別是PLA1磷脂型n-3多不飽和脂肪酸具有顯著更高的吸收利用率，因此更適于有促進(jìn)大腦發(fā)育、改善心血管健康需求的消費(fèi)者服用。另一方面，由于吸收利用率高，以本發(fā)明的產(chǎn)品作為膳食補(bǔ)充劑可在實(shí)現(xiàn)與現(xiàn)有技術(shù)等同的生物活性的同時(shí)減少脂類(lèi)攝入總量，更符合健康理念。

RM IM脂肪酶為來(lái)自米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)的脂肪酶?，F(xiàn)有技術(shù)大多將其用于催化甘油三酯的定向酯交換反應(yīng)。這是首次將固定化的RM IM脂肪酶用于制備PLA1型n-3多不飽和脂肪酸磷脂的反應(yīng)中。由于使用此類(lèi)商購(gòu)的固定化酶制劑，在大規(guī)模制備時(shí)不需要經(jīng)過(guò)復(fù)雜的固定過(guò)程。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，在步驟(1)的油脂混合物中加入正己烷(《GB2760—2014》中加工助劑)，增加了大豆磷脂與含EPA或DHA的酯類(lèi)混溶，實(shí)現(xiàn)了DHA和EPA用量的大幅度降低。在其它優(yōu)選的實(shí)施方式中，采用DHA或EPA的乙酯型衍生物作為原料，產(chǎn)率較高且無(wú)需在反應(yīng)結(jié)束后分離游離脂肪酸。然而，RM IM脂肪酶催化EPA或DHA酯化反應(yīng)的效率受到EPA或DHA自身存在多個(gè)雙鍵所造成的空間位阻的影響。特別是當(dāng)使用乙酯型的EPA或DHA時(shí)，該空間位阻的影響更加明顯，從而造成接入率的降低。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，正己烷的加入使得反應(yīng)體系的粘度降低，因此提高反應(yīng)物的流動(dòng)性，并使得乙酯型底物與脂肪酶的反應(yīng)更易進(jìn)行，從而降低了反應(yīng)時(shí)間。因此，在使用乙酯型EPA或DHA的同時(shí)在體系中加入正己烷，不但節(jié)約了原料，降低了反應(yīng)時(shí)間，還提高了產(chǎn)率，具有更高的工業(yè)可行性。

具體實(shí)施方式

下文將詳細(xì)闡述本發(fā)明。

本文所使用的術(shù)語(yǔ)“PLA1型n-3多不飽和脂肪酸磷脂”指的是甘油基1位接入有n-3多不飽和脂肪酸的甘油磷脂，包括PLA1型n-3多不飽和脂肪酸磷脂酸、PLA1型n-3多不飽和脂肪酸磷脂酰、PLA1型n-3多不飽和脂肪酸磷脂酰膽堿、PLA1型n-3多不飽和脂肪酸磷脂酰乙醇胺、PLA1型n-3多不飽和脂肪酸磷脂酰甘油、PLA1型n-3多不飽和脂肪酸磷脂酰肌醇等。該類(lèi)型的磷脂能夠被PLA1型磷脂酶或者PLA1型脂肪酶水解。本文中也將“PLA1型n-3多不飽和脂肪酸磷脂”簡(jiǎn)稱(chēng)為PLA1型功能性磷脂。需要注意的是，PLA1型功能性磷酸甘油基2位的脂肪酸殘基沒(méi)有限制，可為飽和脂肪酸或不飽和脂肪酸。類(lèi)似地，術(shù)語(yǔ)“PLA2型n-3多不飽和脂肪酸磷脂”指的是甘油基2位接入有n-3多不飽和脂肪酸的甘油磷脂，該類(lèi)型的磷脂不能被PLA1型磷脂酶或者PLA1型脂肪酶水解。

本文使用的術(shù)語(yǔ)“n-3多不飽和脂肪酸”具有本領(lǐng)域所公認(rèn)的含義，即第一個(gè)雙鍵出現(xiàn)在碳鏈甲基端第3位的PUFA。本文所述的n-3多不飽和脂肪酸優(yōu)選為二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(EPA)或者DHA和EPA的組合。

在第一方面，本發(fā)明涉及制備PLA1型n-3多不飽和脂肪酸磷脂的方法。

在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明方法的步驟(1)所使用的n-3多不飽和脂肪酸或其酯類(lèi)衍生物可為DHA或其酯類(lèi)衍生物、EPA或其酯類(lèi)衍生物或者二者的組合。優(yōu)選地，所述DHA或其酯類(lèi)衍生物中，DHA的含量不低于50wt％、優(yōu)選不低于75wt％；所述EPA或其酯類(lèi)衍生物中，EPA的含量不低于50wt％、優(yōu)選不低于75wt％。DHA或其酯類(lèi)衍生物以及EPA或其酯類(lèi)衍生物可為任何來(lái)源，例如自于魚(yú)油、海藻油、微生物油脂中的任一種，或上述油脂的任意組合。所述DHA或其酯類(lèi)衍生物可為DHA的甲酯型衍生物、乙酯型衍生物、甘油酯型衍生物，或者游離型DHA，或者上述DHA或其酯類(lèi)衍生物的任意組合。所述EPA或其酯類(lèi)衍生物可選自于EPA的甲酯型衍生物、乙酯型衍生物、甘油酯型衍生物，或者游離型EPA，或者上述EPA或其酯類(lèi)衍生物的任意組合。優(yōu)選地，所述DHA或其酯類(lèi)衍生物為DHA乙酯型衍生物。優(yōu)選地，所述EPA或其酯類(lèi)衍生物為EPA乙酯型衍生物。

大豆磷脂為本領(lǐng)域常用的工業(yè)原料，主要含有磷脂酸、磷脂酰膽堿(也稱(chēng)為卵磷脂)、磷脂酰乙醇胺與磷脂酰肌醇，其中磷脂酰膽堿含量最高。本發(fā)明方法的步驟(1)所使用的大豆磷脂中磷脂的含量?jī)?yōu)選不低于75wt％、更優(yōu)選不低于85wt％。

本發(fā)明方法步驟(1)中n-3多不飽和脂肪酸或其酯類(lèi)衍生物原料與大豆磷脂原料的混合在室溫(一般地為16-26℃)下進(jìn)行。優(yōu)選地，n-3多不飽和脂肪酸甘油酯與大豆磷脂的重量比為(2-10):1、優(yōu)選(3-4):1。所述混合在無(wú)溶劑體系或存在有機(jī)溶劑的條件下進(jìn)行。所述有機(jī)溶劑選自于由正己烷、異己烷、丙酮所組成的組中的任一種或任意組合；優(yōu)選地，所述有機(jī)溶劑為正己烷。所述正己烷的加入量應(yīng)根據(jù)反應(yīng)混合物中磷脂的含量確定。優(yōu)選地，所述正己烷的加入量為：每100mg磷脂添加1ml正己烷。

本發(fā)明方法步驟(2)中油脂混合物的預(yù)熱溫度為30℃-90℃，優(yōu)選45℃-65℃。所加入的蒸餾水的量需要精確控制，優(yōu)選為步驟(3)中酶制劑加入量的0-6wt％、更優(yōu)選為1.5-3.5wt％。

本發(fā)明方法的步驟(3)中，所述固定化的RM IM脂肪酶的加入量為步驟(1)中所述油脂混合物的5wt％-35wt％，優(yōu)選10wt％-30wt％。反應(yīng)溫度控制在30℃-90℃，優(yōu)選45℃-65℃。所述反應(yīng)進(jìn)行1-48小時(shí)，優(yōu)選4-24小時(shí)。

在第二方面，本發(fā)明涉及根據(jù)第一方面所述的方法制得的PLA1型n-3多不飽和脂肪酸磷脂。優(yōu)選地，本發(fā)明產(chǎn)品中PLA1型n-3多不飽和脂肪酸磷脂占全部n-3多不飽和脂肪酸磷脂的不低于80wt％、優(yōu)選不低于90wt％，該參數(shù)由核磁共振磷譜分析測(cè)得。優(yōu)選地，所述PLA1型n-3多不飽和脂肪酸磷脂中n-3多不飽和脂肪酸的接入率不低于20wt％、優(yōu)選不低于25wt％。所述接入率為最終產(chǎn)物的磷脂中n-3多不飽和脂肪酸(例如DHA或EPA)占總脂肪酸的峰面積百分含量，由氣相色譜分析測(cè)得。優(yōu)選地，所述PLA1型n-3多不飽和脂肪酸磷脂中，磷脂型(即，磷酸甘油基含有兩個(gè)脂肪酸殘基)與溶血磷脂型(即，磷酸甘油基含有一個(gè)脂肪酸殘基)的重量比為70:30至30:70、優(yōu)選80:20至40:60，該參數(shù)由核磁共振磷譜分析測(cè)得。

附圖說(shuō)明

圖1為利用色譜法對(duì)油脂標(biāo)準(zhǔn)樣品中全部脂肪酸的組成進(jìn)行分析的氣象色譜圖。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1獲得的油脂組合物1的氣相色譜圖。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例1獲得的油脂組合物1的核磁共振磷譜圖。

圖4為根據(jù)本發(fā)明的比較例3，利用液態(tài)PLA1酶催化獲得的油脂組合物c3的氣相色譜圖。

圖5為根據(jù)本發(fā)明的比較例3，利用液態(tài)PLA1酶催化獲得的油脂組合物c3的核磁共振磷譜圖。

實(shí)施例

以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。這些實(shí)施例僅僅是說(shuō)明性的，而不應(yīng)該理解為是對(duì)本發(fā)明的范圍的限制。凡是基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)方案及其變形均落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。

實(shí)施例和比較例中使用的磷脂購(gòu)自Sigma-Aldrich公司(產(chǎn)品號(hào) 1001900076)，該大豆磷脂中磷脂的含量為86wt％，其中磷脂酰膽堿(PC)的含量為55wt％。由于大豆磷脂中大部分成分是磷脂酰膽堿(PC)，在計(jì)算時(shí)僅考慮磷脂酰膽堿形式。實(shí)施例中使用的固定化的RM IM脂肪酶購(gòu)自諾維信公司(產(chǎn)品號(hào)CHE-20)。比較例中使用的PLA1酶(液態(tài))、TL IM酶(固定化)及SP435(固定化)均購(gòu)自諾維信(中國(guó))生物技術(shù)有限公司(產(chǎn)品號(hào)分別為L(zhǎng)YN05060、LA331342、LC200266)。DHA酯類(lèi)衍生物以及EPA酯類(lèi)衍生物分別購(gòu)自巴斯夫(中國(guó))有限公司(濃縮DHA(乙酯型)、50382353)及無(wú)錫市迅達(dá)海洋生物制品有限公司(濃縮EPA(乙酯型、EPE150818)。其中，DHA或其酯類(lèi)衍生物中DHA的含量為79.7wt％，EPA酯類(lèi)衍生物中EPA的含量為76.2wt％。正己烷為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)。

實(shí)施例和比較例中，按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 28404—2012所述的氣相色譜方法，對(duì)各樣品中脂肪酸的分布和含量進(jìn)行分析，進(jìn)而得出DHA或EPA接入率。所采用的氣相色譜儀的型號(hào)為Agilent 1890B。

首先，利用色譜法對(duì)油脂標(biāo)準(zhǔn)樣品(脂肪酸甲酯混標(biāo)，37種C4-C24，購(gòu)自sigma公司，產(chǎn)品編號(hào)：18919-1AMP)中全部脂肪酸的組成進(jìn)行分析(圖1)。通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)譜的比較，得出測(cè)試樣品中各脂肪酸的分布及含量。下表1和表2示出根據(jù)色譜法測(cè)得的本發(fā)明的原料，DHA酯類(lèi)衍生物、EPA酯類(lèi)衍生物及大豆磷脂中各脂肪酸的含量。

表1大豆磷脂中各脂肪酸的含量(wt％)

表2 DHA酯類(lèi)衍生物、EPA酯類(lèi)衍生物中各脂肪酸的含量

本發(fā)明中接入率的計(jì)算方法為：從色譜圖直接得出最終產(chǎn)物的磷脂中DHA或EPA占總脂肪酸的峰面積百分含量。

實(shí)施例和比較例中，磷脂型、1-溶血甘油基磷脂型、2-溶血甘油基磷脂型以及溶血磷脂型(即1-溶血甘油基磷脂型、2-溶血甘油基磷脂型之和)的n-3多不飽和脂肪酸均以卵磷脂形式計(jì)算。具體而言，由最終產(chǎn)物的核磁共振磷譜譜圖中各自的峰面積，得出卵磷脂型(PCs)DHA或EPA、1-溶血甘油基卵磷脂型(1-Lyso-PC)DHA或EPA、2-溶血甘油基卵磷脂型(2-Lyso-PC)DHA或EPA以及溶血卵磷脂型(LPCs)DHA或EPA的相對(duì)百分含量，從而得出卵磷脂型與溶血卵磷脂型DHA(或EPA)的重量比(PCs/LPCs)以及1-溶血甘油基卵磷脂型與2-溶血甘油基卵磷脂型DHA(或EPA)的重量比(1-Lyso-PC:2-Lyso-PC)。

需要指出的是，本領(lǐng)域目前沒(méi)有對(duì)接入至磷酸甘油基1位(即PLA1型)或2位(即PLA2型)的n-3多不飽和脂肪酸進(jìn)行直接測(cè)定的方法。考慮到PLA1酶和PLA2酶分別催化磷酸甘油基1位和2位的酯化/水解可逆反應(yīng)，終產(chǎn)物中1-溶血甘油磷脂和2-溶血甘油磷脂分別反映了生物酶制劑對(duì)PLA1接入和PLA2接入的n-3多不飽和脂肪酸的催化效率。因此，可通過(guò)終產(chǎn)物中1-溶血甘油基卵磷脂型與2-溶血甘油基卵磷脂型n-3多不飽和脂肪酸的重量比表征磷脂酶對(duì)1位和2位的選擇性。該比值越高，表明對(duì)PLA1位的選擇性越高，產(chǎn)物中接入至PLA1位的功能性磷脂的比例越高。

另一方面，PCs/LPCs表示酯化反應(yīng)與水解反應(yīng)的平衡。LPCs高表明平衡傾向于水解反應(yīng)，獲得的水解反應(yīng)產(chǎn)物較多，這是不利的。應(yīng)選擇PCs/LPCs較高的反應(yīng)條件。

所采用的核磁共振磷譜分析方法為：將最終產(chǎn)物按照100mg/ml的濃 度溶于氘代氯仿及甲醇的混合溶液中(氘代氯仿:甲醇＝2:1)，之后將混合溶液置于核磁共振儀(Bruke 400M Hz)上進(jìn)行分析，參數(shù)為：頻率：300MHz；掃描次數(shù)：128次；掃描溫度：25℃。

實(shí)施例1-14：利用RM IM固定化酶催化DHA或EPA接入至PLA1位的反應(yīng)

[油脂組合物1]

(1)稱(chēng)取EPA酯類(lèi)衍生物1400mg、大豆磷脂原料400mg，在室溫下的反應(yīng)器中加入所述EPA酯類(lèi)衍生物和大豆磷脂，并加入4ml正己烷，獲得油脂混合物；

(2)將步驟(1)獲得的所述油脂混合物預(yù)熱至52℃，精密量取6μl蒸餾水加入到反應(yīng)原料中并充分混勻；

(3)精密稱(chēng)取固定化的RM IM脂肪酶300mg，加入至步驟(2)獲得的反應(yīng)混合物中，在52℃的溫度下反應(yīng)8小時(shí)，獲得油脂組合物1。

油脂組合物1的氣相色譜圖如圖2所示，核磁共振磷譜圖如圖3所示。

[油脂組合物2]

(1)稱(chēng)取EPA酯類(lèi)衍生物525mg、大豆磷脂原料400mg，在室溫下的反應(yīng)器中加入所述EPA酯類(lèi)衍生物和大豆磷脂，并加入4ml正己烷，獲得油脂混合物；

(2)將步驟(1)獲得的所述油脂混合物預(yù)熱至52℃，精密量取6μl蒸餾水加入到反應(yīng)原料中并充分混勻；

(3)精密稱(chēng)取固定化的RM IM脂肪酶300mg，加入至步驟(2)獲得的反應(yīng)混合物中，在52℃的溫度下反應(yīng)8小時(shí)，獲得油脂組合物2。

[油脂組合物3]

(1)稱(chēng)取EPA酯類(lèi)衍生物1050mg、大豆磷脂原料400mg，在室溫下的反應(yīng)器中加入所述EPA酯類(lèi)衍生物和大豆磷脂，并加入4ml正己烷，獲得油脂混合物；

(2)將步驟(1)獲得的所述油脂混合物預(yù)熱至52℃，精密量取6μl蒸餾水加入到反應(yīng)原料中并充分混勻；

(3)精密稱(chēng)取固定化的RM IM脂肪酶300mg，加入至步驟(2)獲得的反應(yīng)混合物中，在52℃的溫度下反應(yīng)8小時(shí)，獲得油脂組合物3。

[油脂組合物4]

(1)稱(chēng)取EPA酯類(lèi)衍生物2100mg、大豆磷脂原料400mg，在室溫下的反應(yīng)器中加入所述EPA酯類(lèi)衍生物和大豆磷脂，并加入4ml正己烷，獲得油脂混合物；

(2)將步驟(1)獲得的所述油脂混合物預(yù)熱至52℃，精密量取6μl蒸餾水加入到反應(yīng)原料中并充分混勻；

(3)精密稱(chēng)取固定化的RM IM脂肪酶300mg，加入至步驟(2)獲得的反應(yīng)混合物中，在52℃的溫度下反應(yīng)8小時(shí)，獲得油脂組合物4。

[油脂組合物5]

(1)稱(chēng)取EPA酯類(lèi)衍生物1400mg、大豆磷脂原料400mg，在室溫下的反應(yīng)器中加入所述EPA酯類(lèi)衍生物和大豆磷脂，獲得油脂混合物；該混合體系為無(wú)溶劑體系；

(2)將步驟(1)獲得的所述油脂混合物預(yù)熱至52℃，精密量取6μl蒸餾水加入到反應(yīng)原料中并充分混勻；

(3)精密稱(chēng)取固定化的RM IM脂肪酶300mg，加入至步驟(2)獲得的反應(yīng)混合物中，在52℃的溫度下反應(yīng)8小時(shí)，獲得油脂組合物5。

[油脂組合物6]

(1)稱(chēng)取EPA酯類(lèi)衍生物1400mg、大豆磷脂原料400mg，在室溫下的反應(yīng)器中加入所述EPA酯類(lèi)衍生物和大豆磷脂，并加入4ml正己烷，獲得油脂混合物；

(2)將步驟(1)獲得的所述油脂混合物預(yù)熱至30℃，精密量取6μl蒸餾水加入到反應(yīng)原料中并充分混勻；

(3)精密稱(chēng)取固定化的RM IM脂肪酶300mg，加入至步驟(2)獲得的反應(yīng)混合物中，在30℃的溫度下反應(yīng)8小時(shí)，獲得油脂組合物6。

[油脂組合物7]

(1)稱(chēng)取EPA酯類(lèi)衍生物1400mg、大豆磷脂原料400mg，在室溫下的反應(yīng)器中加入所述EPA酯類(lèi)衍生物和大豆磷脂，并加入4ml正己烷， 獲得油脂混合物；

(2)將步驟(1)獲得的所述油脂混合物預(yù)熱至90℃，精密量取6μl蒸餾水加入到反應(yīng)原料中并充分混勻；

(3)精密稱(chēng)取固定化的RM IM脂肪酶300mg，加入至步驟(2)獲得的反應(yīng)混合物中，在90℃的溫度下反應(yīng)8小時(shí)，獲得油脂組合物7。

[油脂組合物8]

(1)稱(chēng)取EPA酯類(lèi)衍生物1400mg、大豆磷脂原料400mg，在室溫下的反應(yīng)器中加入所述EPA酯類(lèi)衍生物和大豆磷脂，并加入4ml正己烷，獲得油脂混合物；

(2)將步驟(1)獲得的所述油脂混合物預(yù)熱至52℃，不加入蒸餾水，直接將反應(yīng)原料充分混勻；

(3)精密稱(chēng)取固定化的RM IM脂肪酶300mg，加入至步驟(2)獲得的反應(yīng)混合物中，在52℃的溫度下反應(yīng)8小時(shí)，獲得油脂組合物8。

[油脂組合物9]

(1)稱(chēng)取EPA酯類(lèi)衍生物1400mg、大豆磷脂原料400mg，在室溫下的反應(yīng)器中加入所述EPA酯類(lèi)衍生物和大豆磷脂，并加入4ml正己烷，獲得油脂混合物；

(2)將步驟(1)獲得的所述油脂混合物預(yù)熱至52℃，精密量取18μl蒸餾水加入到反應(yīng)原料中并充分混勻；

(3)精密稱(chēng)取固定化的RM IM脂肪酶300mg，加入至步驟(2)獲得的反應(yīng)混合物中，在52℃的溫度下反應(yīng)8小時(shí)，獲得油脂組合物9。

[油脂組合物10]

(1)稱(chēng)取EPA酯類(lèi)衍生物1400mg、大豆磷脂原料400mg，在室溫下的反應(yīng)器中加入所述EPA酯類(lèi)衍生物和大豆磷脂，并加入4ml正己烷，獲得油脂混合物；

(2)將步驟(1)獲得的所述油脂混合物預(yù)熱至52℃，精密量取3.6μl蒸餾水加入到反應(yīng)原料中并充分混勻；

(3)精密稱(chēng)取固定化的RM IM脂肪酶180mg，加入至步驟(2)獲得的反應(yīng)混合物中，在52℃的溫度下反應(yīng)8小時(shí)，獲得油脂組合物10。

[油脂組合物11]

(1)稱(chēng)取EPA酯類(lèi)衍生物1400mg、大豆磷脂原料400mg，在室溫下的反應(yīng)器中加入所述EPA酯類(lèi)衍生物和大豆磷脂，并加入4ml正己烷，獲得油脂混合物；

(2)將步驟(1)獲得的所述油脂混合物預(yù)熱至52℃，精密量取10.8μl蒸餾水加入到反應(yīng)原料中并充分混勻；

(3)精密稱(chēng)取固定化的RM IM脂肪酶540mg，加入至步驟(2)獲得的反應(yīng)混合物中，在52℃的溫度下反應(yīng)8小時(shí)，獲得油脂組合物11。

[油脂組合物12]

(1)稱(chēng)取EPA酯類(lèi)衍生物1400mg、大豆磷脂原料400mg，在室溫下的反應(yīng)器中加入所述EPA酯類(lèi)衍生物和大豆磷脂，并加入4ml正己烷，獲得油脂混合物；

(2)將步驟(1)獲得的所述油脂混合物預(yù)熱至52℃，精密量取6μl蒸餾水加入到反應(yīng)原料中并充分混勻；

(3)精密稱(chēng)取固定化的RM IM脂肪酶300mg，加入至步驟(2)獲得的反應(yīng)混合物中，在52℃的溫度下反應(yīng)1小時(shí)，獲得油脂組合物12。

[油脂組合物13]

(1)稱(chēng)取EPA酯類(lèi)衍生物1400mg、大豆磷脂原料400mg，在室溫下的反應(yīng)器中加入所述EPA酯類(lèi)衍生物和大豆磷脂，并加入4ml正己烷，獲得油脂混合物；

(2)將步驟(1)獲得的所述油脂混合物預(yù)熱至52℃，精密量取6μl蒸餾水加入到反應(yīng)原料中并充分混勻；

(3)精密稱(chēng)取固定化的RM IM脂肪酶300mg，加入至步驟(2)獲得的反應(yīng)混合物中，在52℃的溫度下反應(yīng)48小時(shí)，獲得油脂組合物13。

[油脂組合物14]

(1)稱(chēng)取DHA酯類(lèi)衍生物1400mg、大豆磷脂原料400mg，在室溫下的反應(yīng)器中加入所述DHA酯類(lèi)衍生物和大豆磷脂，并加入4ml正己烷，獲得油脂混合物；

(2)將步驟(1)獲得的所述油脂混合物預(yù)熱至52℃，精密量取6μl 蒸餾水加入到反應(yīng)原料中并充分混勻；

(3)精密稱(chēng)取固定化的RM IM脂肪酶300mg，加入至步驟(2)獲得的反應(yīng)混合物中，在52℃的溫度下反應(yīng)8小時(shí)，獲得油脂組合物14。比較例1-3：利用其它酶催化劑催化EPA接入至PLA1位的反應(yīng)

[油脂組合物c1]

(1)稱(chēng)取EPA酯類(lèi)衍生物1400mg、大豆磷脂原料400mg，在室溫下的反應(yīng)器中加入所述EPA酯類(lèi)衍生物和大豆磷脂，并加入4ml正己烷，獲得油脂混合物；

(2)將步驟(1)獲得的所述油脂混合物預(yù)熱至52℃，精密量取6μl蒸餾水加入到反應(yīng)原料中并充分混勻；

(3)精密稱(chēng)取TL IM固定化酶300mg，加入至步驟(2)獲得的反應(yīng)混合物中，在52℃的溫度下反應(yīng)8小時(shí)，獲得油脂組合物c1。

[油脂組合物c2]

(1)稱(chēng)取EPA酯類(lèi)衍生物1400mg、大豆磷脂原料400mg，在室溫下的反應(yīng)器中加入所述EPA酯類(lèi)衍生物和大豆磷脂，并加入4ml正己烷，獲得油脂混合物；

(2)將步驟(1)獲得的所述油脂混合物預(yù)熱至52℃，精密量取6μl蒸餾水加入到反應(yīng)原料中并充分混勻；

(3)精密稱(chēng)取SP435固定化酶300mg，加入至步驟(2)獲得的反應(yīng)混合物中，在52℃的溫度下反應(yīng)8小時(shí)，獲得油脂組合物c2。

[油脂組合物c3]

首先，利用參考文獻(xiàn)9所述的方法對(duì)液態(tài)PLA1酶進(jìn)行固定。

(1)稱(chēng)取EPA酯類(lèi)衍生物1400mg、大豆磷脂原料400mg，在室溫下的反應(yīng)器中加入所述EPA酯類(lèi)衍生物和大豆磷脂，并加入4ml正己烷，獲得油脂混合物；

(2)將步驟(1)獲得的所述油脂混合物預(yù)熱至52℃，精密量取6μl蒸餾水加入到反應(yīng)原料中并充分混勻；

(3)精密稱(chēng)取PLA1固定化酶300mg，加入至步驟(2)獲得的反應(yīng)混合物中，在52℃的溫度下反應(yīng)8小時(shí)，獲得油脂組合物c3。

油脂組合物c3的氣相色譜圖如圖4所示，核磁共振磷譜圖如圖5所示。

實(shí)施例和比較例獲得的各油脂組合物的DHA或EPA接入率、PCs/LPCs以及1-Lyso-PC:2-Lyso-PC如表3所示。

表3