本發(fā)明涉及一種超高效液相色譜法測定中藥提取物的方法，特別涉及測定黃芪提取物中四種黃酮類成分的方法。
背景技術(shù)：
：黃芪為豆科植物蒙古黃芪和莢膜黃芪的根，其有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、保肝、利尿、抗衰老、抗應(yīng)激、降壓和較廣泛的抗菌作用。黃芪中主要含有三類主要成分，分別為三萜皂苷、黃酮類化合物和多糖。黃酮類化合物(flavonoids)是一類存在于自然界的、具有2-苯基色原酮(flavone)結(jié)構(gòu)的化合物。根據(jù)三碳鍵(C3)結(jié)構(gòu)的氧化程度和B環(huán)的連接位置等特點(diǎn)，黃酮類化合物可分為下列幾類：黃酮和黃酮醇；黃烷酮和黃烷酮醇；異黃酮；異黃烷酮；查耳酮；黃烷和黃烷醇等。黃酮類化合物中有藥用價值的化合物很多，例如由銀杏葉制成的舒血寧片含有黃酮和雙黃酮類，用于冠心病、心絞痛的治療。在傳統(tǒng)HPLC系統(tǒng)基礎(chǔ)上開發(fā)的超高效液相色譜(UltraPerformanceLC，UPLC)系統(tǒng)突破了色譜科學(xué)的瓶頸，充分利用了傳統(tǒng)HPLC望塵莫及的亞二微米小粒度色譜柱的優(yōu)勢，使色譜分離的解析度達(dá)到新的高度；主要優(yōu)勢表現(xiàn)在：高分離度、高分離速度和高靈敏度。黃芪提取物是芪參益氣滴丸的制劑中間體，是由黃芪藥材經(jīng)水提、醇沉、減壓濃縮制成的提取物。經(jīng)過前期針對黃芪提取物的研究，我們發(fā)現(xiàn)黃芪提取物中主要含有四種黃酮類成分：毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素和芒柄花苷。針對黃芪提取物，目前已經(jīng)建立起了一整套全面的工藝和質(zhì)量控制體系，但對于黃芪提取物中的黃酮類成分還缺乏檢測方法。因此需要建立這樣一種方法，進(jìn)一步提升產(chǎn)品質(zhì)量控制水平，從而更加準(zhǔn)確的把握產(chǎn)品質(zhì)量。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明目的在于提供一種測定黃芪提取物中的黃酮類成分的方法，該方法采用超高效液相色譜法，其中供試品采用50～80％的甲醇提取，色譜條件為采用HSST3色譜柱，流動相A為含0-0.5％甲酸的水，流動相B為含0-0.5％甲酸的乙腈，流速為0.3-0.6mL/min，檢測波長205-280nm。根據(jù)本發(fā)明的實施方式之一，其中，供試品采用70％甲醇超聲提取。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選方式之一，其中，流動相A相為0.2％甲酸水溶液，B相為乙腈。根據(jù)本發(fā)明的實施方式之一，其中，流動相速度為0.4mL/min。根據(jù)本發(fā)明的又一實施方式，其中，檢測波長為254nm。根據(jù)本發(fā)明，流動相梯度程序可以為：根據(jù)本發(fā)明所提供的方法，對照品采取毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素和芒柄花苷，加甲醇配制成每毫升含毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素和芒柄花苷分別為0.01mg、0.04mg、0.004mg和0.15mg的溶液。根據(jù)本發(fā)明的實施方式之一，采用超高效液相色譜檢測黃芪提取物中黃酮類成分的方法，包括以下步驟：(1)對照品溶液的制備：分別取毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素和芒柄花苷對照品，加50～80％的甲醇配制成每毫升含毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素和芒柄花苷分別為0.01mg、0.04mg、0.004mg和0.15mg的溶液；(2)供試品溶液的制備：取黃芪提取物0.5克，用50～80％的甲醇提取，提取液定容至25毫升；(3)測定法：取各對照品溶液和供試品溶液各1-3μl，注入液相色譜儀，記錄峰面積，外標(biāo)法計算毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素和芒柄花苷的含量。色譜條件：色譜柱：HSST3流動相：流動相A為含0-0.5％甲酸的水；流動相B為含0-0.5％甲酸的乙腈；流速：0.3-0.6mL/min；檢測波長：205-280nm。流動相梯度程序根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選方法，其中對照品溶液和供試品溶液均采用70％甲醇配制，測定過程中各對照品溶液和供試品溶液加樣量均為2μl，流動相A為含0.2％甲酸的水，流動相B為乙腈，流速為0.4mL/min，檢測波長為254nm。本發(fā)明中的黃芪提取物，包括任何一種黃芪經(jīng)過水提，醇提，水提醇沉，醇提水沉等方法提取得到的黃芪提取物，可以通過現(xiàn)有技術(shù)制備，也可以從市場上購買得到。黃芪提取物制備方法，可以參考以下方法：黃芪飲片加水回流提取兩次，提取液合并，濃縮，進(jìn)行兩次醇沉，回收乙醇至密度約為1.3g/ml的浸膏，既得。本發(fā)明優(yōu)選的實驗方法、色譜條件和溶劑提取方法，是經(jīng)過篩選得到的，篩 選過程如下：(一)儀器與試藥1、儀器液相色譜儀：Waters2695四元泵，Waters2996PDA檢測器，Empower3化學(xué)工作站Milli-Q超純水處理系統(tǒng)(MILLIPORE公司)AG104電子天平、XS105DU電子天平(METTLERTOREDO公司)KQ-100DB超聲清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)2、試藥毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品(批號：111920-201304)、芒柄花素對照品(批號：111703-200603)，均購自中國食品藥品檢定研究院；毛蕊異黃酮對照品(批號：20575-57-9，含量98％)、芒柄花苷對照品(批號：20587-51-3，含量98％)，均購自天津士蘭科技有限公司甲醇：天津化學(xué)試劑二廠，201405113、試驗樣品黃芪浸膏(在線產(chǎn)品)：天津天士力現(xiàn)代中藥資源有限公司(二)色譜條件的選擇1、流動相選擇分別考查0.1％、0.2％、0.5％甲酸水溶液為流動相A，乙腈為流動相B進(jìn)行梯度洗脫，結(jié)果顯示，0.1％甲酸水溶液為流動相A時，黃酮成分的色譜峰峰形較差，分離度偏低，0.2％、0.5％甲酸水溶液為流動相A的色譜峰峰形及分離度較好，考慮試驗條件的溫和性，采用0.2％甲酸水溶液為流動相A。2、檢測波長選擇分別對毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素和芒柄花苷四個對照品溶液進(jìn)樣分析，通過對色譜峰的二極管陣列波長掃描，四個成分均在254nm處有較大吸收，因此采用254nm為檢測波長。3、洗脫梯度為使各黃酮成分色譜峰得到了良好的分離效果，考查了不同梯度洗脫條件，在保證分離度的前提下盡量縮短檢驗周期。梯度條件如下：表2梯度條件(1)表3梯度條件(2)表4梯度條件(3)相應(yīng)色譜圖參見附圖1。(三)樣品處理方法的選擇分別考查30％、50％、70％甲醇溶解樣品后的色譜峰，結(jié)果顯示，70％甲醇溶解樣品后，色譜峰雜峰較少，黃酮成分的色譜峰更高，回收率更好。(四)方法學(xué)考察1、線性關(guān)系考察：精密稱取經(jīng)五氧化二磷干燥過的毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素和芒柄花苷對照品適量，加甲醇配制成每毫升含毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素和芒柄花苷分別為0.1mg、0.4mg、0.04mg和1.5mg的混合對照溶液，再分別取量取0.5、1、2、4、5、10ml混合對照溶液置于50ml量瓶中，加水至刻度，混勻，制成系列溶液，注入液相色譜儀，測定，以濃度對測得的峰面積進(jìn)行線性回歸，求得回歸方程。1.1毛蕊異黃酮線性關(guān)系考察數(shù)據(jù)：表5毛蕊異黃酮線性關(guān)系數(shù)據(jù)參見附圖2。1.2毛蕊異黃酮葡萄糖苷線性關(guān)系考察數(shù)據(jù)：表6毛蕊異黃酮葡萄糖苷線性關(guān)系數(shù)據(jù)參見附圖3。1.3芒柄花苷線性關(guān)系考察數(shù)據(jù)：表7芒柄花苷線性關(guān)系數(shù)據(jù)參見附圖4。1.4芒柄花素線性關(guān)系考察數(shù)據(jù)：表8芒柄花素線性關(guān)系數(shù)據(jù)濃度(mg/ml)0.0004050.000810.0016190.0040480.008096峰面積101901931644590102316214553參見附圖5。2、進(jìn)樣精密度試驗：取20140103批樣品，依法制備供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素和芒柄花苷的峰面積，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。表9進(jìn)樣精密度驗證數(shù)據(jù)3、重現(xiàn)性試驗：取20140103批樣品，依法制備供試品溶液6份，分別測定毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素和芒柄花苷的含量，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。表10重現(xiàn)性驗證數(shù)據(jù)4、回收率試驗：精密稱取20140103批樣品6份，每份約0.25g，置25ml量瓶中，各分別精密加入混合對照品溶液5ml(每毫升含毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷和芒柄花素分別為0.0185mg、0.1055mg、0.4765mg和0.01055mg)，自“加70％甲醇溶液適量，超聲溶解”起，照含量測定項下依法處理，作為供試品溶液，取2ul注入色譜儀，分別計算毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷和芒柄花素的回收率。表11毛蕊異黃酮葡萄糖苷回收率數(shù)據(jù)表12毛蕊異黃酮回收率數(shù)據(jù)表13芒柄花苷回收率數(shù)據(jù)表14芒柄花素回收率數(shù)據(jù)5、穩(wěn)定性考察取20140103批制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24h進(jìn)樣，記錄毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素和芒柄花苷的峰面積，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。表15方法穩(wěn)定性數(shù)據(jù)經(jīng)方法學(xué)驗證，本專利涉及的含量測定方法的線性、精密度、重現(xiàn)性及準(zhǔn)確性良好，能夠有效測定黃芪提取物中的黃酮類成分。本發(fā)明的方法中采用超高效液相色譜法，色譜填料為亞二微米雜化顆粒填料，分離效率更高，分析時間更短，工作效率大大提高。本發(fā)明的色譜柱應(yīng)用ACQUITYUPLCHSST3色譜柱，特別適用于反相色譜分離中增強(qiáng)對極性化合物的保留，本色譜柱C18碳鏈鍵合密度低，使分析物能更容易進(jìn)入顆粒材料的孔結(jié)構(gòu)中，為極性和疏水性分子提供均衡的保留性能而無需使用離子對試劑，能夠使單一色譜方法用于分析多種不同極性的成分；而黃芪提取物中的黃酮成分極性差別很大，使用HSST3色譜柱保證了各成分的色譜分離度。本方法采用的流動相非常簡單，以0.2％甲酸水溶液為流動相A，乙腈為流動相B，色譜條件溫和，操作簡單，重現(xiàn)性更好。因為采用的色譜柱對極性化合物有很好的保留，免去了在流動相B中添加甲酸或異丙醇等高粘度溶劑，使柱壓更低。本方法對洗脫梯度條件進(jìn)行了優(yōu)化，最大限度排除了其他成分對目標(biāo)成分的干擾，能夠在8分鐘內(nèi)對四種黃酮類成分實現(xiàn)有效的分離，分離度均大于3，達(dá)到了分析時間最短、重現(xiàn)性更好的高效、快速分離的效果。經(jīng)方法學(xué)驗證，本發(fā)明涉及的含量測定方法的線性、精密度、重現(xiàn)性及準(zhǔn)確性良好。本發(fā)明利用快速高效的UPLC技術(shù)建立了針對黃芪提取物中的黃酮類化合物的含量測定方法，通過本方法的應(yīng)用，可以進(jìn)一步提升產(chǎn)品質(zhì)量控制水平，從而更加準(zhǔn)確的把握產(chǎn)品質(zhì)量。附圖說明圖1梯度篩選色譜圖圖2毛蕊異黃酮線性關(guān)系圖圖3毛蕊異黃酮葡萄糖苷線性關(guān)系圖圖4芒柄花苷線性關(guān)系圖圖5芒柄花素線性關(guān)系圖圖6黃芪提取物四種黃酮成分UPLC圖譜具體實施方式以下通過實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不作為對本發(fā)明的限制。實施例1色譜條件和系統(tǒng)適用性試驗儀器為WatersACQUITY超高效液相色譜儀，采用UPLCHSST3色譜柱，以0.2％甲酸水溶液為流動相A，乙腈為流動相B，梯度設(shè)置見下表，流速為0.4mL/min；檢測波長：254nm。對照品溶液的制備分別取毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素和芒柄花苷對照品適量，加70％甲醇配制成每毫升含毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素和芒柄花苷分別為0.01mg、0.04mg、0.004mg和0.15mg的溶液。供試品溶液的制備取黃芪浸膏約0.5克，精密稱定，加70％甲醇溶液適量，超聲溶解，定容至25毫升，搖勻，即得。測定法分別精密吸取各對照品溶液和供試品溶液各2μl，注入液相色譜儀，記錄峰面積。外標(biāo)法計算含量。隨機(jī)抽取的黃芪提取物產(chǎn)品，測定其中的黃酮成分，結(jié)果如下表16和圖6所示：表16黃芪提取物黃酮成分測定結(jié)果實施例2色譜條件和系統(tǒng)適用性試驗儀器為WatersACQUITY超高效液相色譜儀，采用UPLCHSST3色譜柱，以0.1％甲酸水溶液為流動相A，0.1％甲酸乙腈為流動相B，梯度設(shè)置見表1，流速為0.3mL/min；檢測波長：254nm。對照品溶液的制備分別取毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素和芒柄花苷對照品適量，加甲醇配制成每毫升含毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素和芒柄花苷分別為0.01mg、0.04mg、0.004mg和0.15mg的溶液。供試品溶液的制備取黃芪浸膏約0.5克，精密稱定，加50％甲醇溶液適量，超聲溶解，定容至25毫升，搖勻，即得。測定法分別精密吸取各對照品溶液和供試品溶液各2μl，注入液相色譜儀，記錄峰面積。外標(biāo)法計算含量。實施例3色譜條件和系統(tǒng)適用性試驗儀器為WatersACQUITY超高效液相色譜儀，采用UPLCHSST3色譜柱，以0.5％甲酸水溶液為流動相A，0.5％甲酸乙腈為流動相B，梯度設(shè)置見表1，流速為0.6mL/min；檢測波長：280nm。對照品溶液的制備分別取毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素和芒柄花苷對照品適量，加甲醇配制成每毫升含毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素和芒柄花苷分別為0.01mg、0.04mg、0.004mg和0.15mg的溶液。供試品溶液的制備取黃芪浸膏約0.5克，精密稱定，加50％甲醇溶液適量， 超聲溶解，定容至25毫升，搖勻，即得。測定法分別精密吸取各對照品溶液和供試品溶液各2μl，注入液相色譜儀，記錄峰面積。外標(biāo)法計算含量。實施例4色譜條件和系統(tǒng)適用性試驗儀器為WatersACQUITY超高效液相色譜儀，采用UPLCHSST3色譜柱，以0.2％甲酸水溶液為流動相A，乙腈為流動相B，梯度設(shè)置見表1，流速為0.6mL/min；檢測波長：205nm。對照品溶液的制備分別取毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素和芒柄花苷對照品適量，加甲醇配制成每毫升含毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素和芒柄花苷分別為0.01mg、0.04mg、0.004mg和0.15mg的溶液。供試品溶液的制備取黃芪浸膏約0.5克，精密稱定，加80％甲醇溶液適量，超聲溶解，定容至25毫升，搖勻，即得。測定法分別精密吸取各對照品溶液和供試品溶液各2μl，注入液相色譜儀，記錄峰面積。外標(biāo)法計算含量。實施例5色譜條件和系統(tǒng)適用性試驗儀器為WatersACQUITY超高效液相色譜儀，采用UPLCHSST3色譜柱，以水為流動相A，0.5％甲酸乙腈為流動相B，梯度設(shè)置見表1，流速為0.3mL/min；檢測波長：254nm。對照品溶液的制備分別取毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素和芒柄花苷對照品適量，加甲醇配制成每毫升含毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素和芒柄花苷分別為0.01mg、0.04mg、0.004mg和0.15mg的溶液。供試品溶液的制備取黃芪浸膏約0.5克，精密稱定，加50％甲醇溶液適量，超聲溶解，定容至25毫升，搖勻，即得。測定法分別精密吸取各對照品溶液和供試品溶液各2μl，注入液相色譜儀，記錄峰面積。外標(biāo)法計算含量。實施例6色譜條件和系統(tǒng)適用性試驗儀器為WatersACQUITY超高效液相色譜儀，采用UPLCHSST3色譜柱，以0.2％甲酸水溶液為流動相A，乙腈為流動相B， 梯度設(shè)置見表1，流速為0.3mL/min；檢測波長：270nm。對照品溶液的制備分別取毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素和芒柄花苷對照品適量，加甲醇配制成每毫升含毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素和芒柄花苷分別為0.01mg、0.04mg、0.004mg和0.15mg的溶液。供試品溶液的制備取黃芪浸膏約0.5克，精密稱定，加80％甲醇溶液適量，超聲溶解，定容至25毫升，搖勻，即得。測定法分別精密吸取各對照品溶液和供試品溶液各2μl，注入液相色譜儀，記錄峰面積。外標(biāo)法計算含量。當(dāng)前第1頁1 2 3