本發(fā)明涉及一種龍虎人丹植物藥的檢測(cè)方法，具體涉及一種大鼠血漿中龍虎人丹多種有效成分HS-SPDE-GC-MS/MS檢測(cè)方法，屬于中藥的技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

目前關(guān)于龍虎人丹揮發(fā)性的藥代動(dòng)力學(xué)方面的研究還沒(méi)有相關(guān)報(bào)道，其吸收進(jìn)入體內(nèi)的成分不清楚，不利于確定其產(chǎn)生藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)。

薄荷腦是一種單帖醇，具有抗炎、止癢、止痛等作用。龍腦，亦稱(chēng)為冰片可促進(jìn)血腦屏障(BBB)的生理性開(kāi)放，促進(jìn)某些藥物透過(guò)血腦屏障，以促進(jìn)藥物在腦組織的分布。冰片還能通過(guò)對(duì)P-gp底物的抑制，提高部分藥物的生物利用度。龍腦在生物體內(nèi)可以被氧化成樟腦。冰片是人的CYP2A6、CYP2B6、CYP3A4、CYP3A5的底物，也是UGT2B7的底物，同時(shí)也是CYP2B6中等抑制劑。其中異龍腦更易被CYP2B6代謝。冰片對(duì)CYP2C6/11、CYP3A酶的活性具有誘導(dǎo)作用。關(guān)于冰片的藥代動(dòng)力學(xué)已有研究報(bào)道。然而，這些成分和單味藥的藥代動(dòng)力學(xué)的研究，如血藥動(dòng)力學(xué)、吸收、代謝、排泄等，所闡明的藥動(dòng)學(xué)規(guī)律難以反映龍虎人丹的藥動(dòng)學(xué)規(guī)律。為了進(jìn)龍虎人丹多種揮發(fā)性成分的藥動(dòng)學(xué)研究，必須建立血漿多種揮發(fā)性成分的測(cè)定方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于，提供大鼠血漿中龍虎人丹多種有效成分HS-SPDE-GC-MS/MS檢測(cè)方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述缺點(diǎn)和不足。

本發(fā)明所需要解決的技術(shù)問(wèn)題，可以通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：

大鼠血漿中龍虎人丹多種有效成分的檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟：

1.材料的準(zhǔn)備

準(zhǔn)備龍虎人丹、標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)物；

2.方法：

2.1.溶液配制

各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制和內(nèi)標(biāo)溶液的配制；

2.2.血漿樣品預(yù)處理

100μl血漿中加入10μl內(nèi)標(biāo)溶液后，渦旋1min，進(jìn)行GC-MS/MS分析；

2.3.進(jìn)行固相動(dòng)態(tài)萃取SPDE

采用PDMS萃取頭：SPDE萃取頭涂層為聚二甲基硅氧烷PDMS內(nèi)徑50μm，長(zhǎng)56μm；

2.4.進(jìn)行GC-MS/MS

色譜：分析柱為VF-WAXms毛細(xì)管柱30m×0.25mm ID；Agiletnt Technologies，USA，涂層為100％聚乙二醇0.25μm膜厚度；

質(zhì)譜：離子源為EI，碰撞氣為氦氣和氮?dú)?，流速分別為2.25及1.5ml·min^-1，EI源溫度為250℃，電離能量為70Ev，分析時(shí)間為14.8min；

2.5.方法學(xué)考察

2.5.1.專(zhuān)屬性：取空白血漿，除不加內(nèi)標(biāo)外，其他按“血漿樣品預(yù)處理”項(xiàng)下操作，得空白血漿色譜圖；分別取6只不同來(lái)源的空白大鼠血漿100μl，將一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液加入空白血漿中，除不加內(nèi)標(biāo)外，其他按“血漿樣品預(yù)處理”項(xiàng)下操作，進(jìn)樣10μl，得空白血漿加標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖；取大鼠灌胃給予龍虎人丹后的血漿樣品，依同法操作，得給藥后血漿色譜圖；

2.5.2.標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：以各標(biāo)準(zhǔn)樣品血藥濃度為橫坐標(biāo)，各標(biāo)準(zhǔn)樣品與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值為縱坐標(biāo)，用加權(quán)(w＝1/x²)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算，求得的直線(xiàn)回歸方程即為標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.5.3.準(zhǔn)確度和精密度：根據(jù)QC樣品的各成分實(shí)測(cè)濃度計(jì)算本法的批內(nèi)和批間精密度與準(zhǔn)確度；

2.5.4.提取回收率：每一濃度兩種處理方法的峰面積比值計(jì)算提取回收 率；

2.5.5.穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

測(cè)試血漿樣品室溫放置12h穩(wěn)定性、血漿樣品-80℃凍融3次穩(wěn)定性、血漿樣品-80℃凍存15天穩(wěn)定性，上述樣品均按各分析批的隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出各QC樣品的濃度，計(jì)算各濃度的平均值與標(biāo)示濃度的比值，從而得出樣品的穩(wěn)定性；

2.5.6.稀釋方法學(xué)：配制相當(dāng)于高濃度QC樣品5和10倍的樣品，每個(gè)平行三樣本，用空白血漿基質(zhì)稀釋5和10倍后，按“血漿樣品預(yù)處理”項(xiàng)下操作，進(jìn)行GC-MS/MS分析。

其中，所述龍虎人丹上海中華藥業(yè)有限公司，產(chǎn)地：上海，批號(hào)：120503、120504；

所述標(biāo)準(zhǔn)品為樟腦批號(hào)：110747-2010008、薄荷腦批號(hào)：110728-200005、異龍腦批號(hào)：1512-200201、龍腦批號(hào)：110881-201107，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；

所述內(nèi)標(biāo)物為萘批號(hào)：11673-200803購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。

其中，所述各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制：精密稱(chēng)取各標(biāo)準(zhǔn)品，樟腦、薄荷腦、異龍腦、龍腦，精確至0.1mg，置10ml量瓶中，用乙酸乙酯溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

其中，所述內(nèi)標(biāo)溶液的配制：精密稱(chēng)取內(nèi)標(biāo)物，萘對(duì)照品2.46mg，置10ml量瓶中，用乙酸乙酯溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為儲(chǔ)備溶液200μg/ml冰箱4℃內(nèi)保存?zhèn)溆谩?nèi)標(biāo)溶液用乙酸乙酯稀釋至萘濃度為100ng/ml。

步驟(2.3)中，SPDE參數(shù)如下：烤箱預(yù)加熱時(shí)間：5min，進(jìn)樣針溫度：85℃，烤箱加熱溫度：80℃，加熱攪拌器的轉(zhuǎn)數(shù)：500rpm，取樣注射針的深度：20mm，萃取次數(shù)：40，解析氣體量：1000μl，注射針進(jìn)樣口插入深度：45mm，熱脫附時(shí)間：30s，熱脫附注射速度：50μl/s，萃取頭老化時(shí)間：6min，萃取頭老化溫度：250℃。

步驟(2.4)中，色譜采用載氣為氦氣，流速為2.5ml·min^-1，程序升溫方法：初始溫度為50℃維持1min，以12℃每分鐘的升溫速率升至150℃，以20℃每分鐘的升溫速率升至200℃，以45℃每分鐘的升溫速率升至245℃， 維持2min，進(jìn)樣口溫度：250℃，不分流，溶劑延遲：6min；

步驟(2.5.3)中，4種成分批內(nèi)和批間變異及準(zhǔn)確度，批內(nèi)及批間RSD在4.27％-9.53％之間，準(zhǔn)確度在95.20％-106.20％。

步驟(2.5.4)中，測(cè)得各成分在各濃度血漿樣品中的提取回收率為74.95％–88.55％。

步驟(2.5.5)中，穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)的血漿樣品在室溫下保存12h內(nèi)穩(wěn)定，未經(jīng)處理的血漿樣品在-80℃冰箱內(nèi)反復(fù)凍融3次穩(wěn)定，未經(jīng)處理的血漿樣品在-80℃冰箱內(nèi)保存15天內(nèi)穩(wěn)定。

步驟(2.5.6)中，將3.2μg/ml和1.6μg/ml的含樟腦、薄荷腦、異龍腦、龍腦的血漿樣品分別稀釋10倍和5倍，血漿樣品經(jīng)稀釋后測(cè)定結(jié)果的RSD在±15％以?xún)?nèi)，說(shuō)明血漿樣品經(jīng)5倍及10倍稀釋再測(cè)定，不會(huì)影響樣品測(cè)定的準(zhǔn)確度和精密度。

本發(fā)明的有益效果：

本研究建立同時(shí)測(cè)定龍虎人丹中3種主要成分薄荷腦、異龍腦、龍腦及代謝物樟腦的血漿HS-SPDE-GC-MS/MS檢測(cè)方法，為進(jìn)行了龍虎人丹多種揮發(fā)性成分的藥動(dòng)學(xué)研究提供基礎(chǔ)。

附圖說(shuō)明

圖1為標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)物的結(jié)構(gòu)式。

結(jié)構(gòu)式1為樟腦Camphor，結(jié)構(gòu)式2為薄荷腦Menthol，結(jié)構(gòu)式3為異龍腦Isoborneol，結(jié)構(gòu)式4為龍腦(亦稱(chēng)為冰片)Borneol，結(jié)構(gòu)式5為萘Naphthalene。

圖2為大鼠口服龍虎人丹30分鐘后的血漿樣品中各成分的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖。

(A)空白大鼠血漿、(B)空白血漿加標(biāo)準(zhǔn)品及(C)大鼠口服龍虎人丹30分鐘后的血漿樣品中各成分的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖，五個(gè)峰分別為(1)樟腦、(2)薄荷腦、(3)異龍腦、(4)龍腦和(5)萘。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)步說(shuō)明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1

1.材料

1.1.儀器

Agilent 7890A氣相–Agilent 7000B三重四級(jí)桿質(zhì)譜(Agiletnt Technologies,USA)，SPDE固相動(dòng)態(tài)萃取多功能全自動(dòng)進(jìn)樣器(Idstein,Germany)，ScanSpeed 1730MR冷凍離心機(jī)(LaboGene,Danmark)，JA 1203精密電子天平(上海精密科學(xué)儀器公司)，XS105DU型電子天平(METTLER TOLEDO,USA)，USC-502超聲波清洗器(上海波龍電子設(shè)備有限公司)，QT-1渦旋混合器(上海琪特分析儀器有限公司)。

1.2.藥品及試劑

龍虎人丹(上海中華藥業(yè)有限公司，產(chǎn)地：上海，批號(hào)：120503、120504)。

樟腦(批號(hào)：110747-2010008)、薄荷腦(批號(hào)：110728-200005)、異龍腦(批號(hào)：1512-200201)、龍腦(批號(hào)：110881-201107)、萘(批號(hào)：11673-200803)均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。以上標(biāo)準(zhǔn)品純度均大于98％，色譜純甲醇、乙腈購(gòu)自Burdick&Jackson公司(Ulsan,Korea)；乙酸乙酯，乙醇及正己烷為色譜純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；超純水由Millipore Milli-Q純水儀制備。

所有標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)的結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。

2.方法

2.1.溶液配制

各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制：

精密稱(chēng)取各標(biāo)準(zhǔn)品，樟腦、薄荷腦、異龍腦、龍腦，精確至0.1mg，置10ml量瓶中，用乙酸乙酯溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

內(nèi)標(biāo)溶液的配制：

精密稱(chēng)取內(nèi)標(biāo)物，萘對(duì)照品2.46mg，置10ml量瓶中，用乙酸乙酯溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為儲(chǔ)備溶液(200μg/ml)冰箱(4℃)內(nèi)保存?zhèn)溆谩?nèi)標(biāo)溶液用乙酸乙酯稀釋至萘濃度為100ng/ml。

以上儲(chǔ)備液及系列標(biāo)準(zhǔn)溶液均用經(jīng)過(guò)校正的容量器具配制。

2.2.血漿樣品預(yù)處理

100μl血漿中加入10μl內(nèi)標(biāo)溶液后，渦旋1min，進(jìn)行GC-MS/MS分析。

2.3.固相動(dòng)態(tài)萃取(SPDE)條件

采用PDMS萃取頭：SPDE萃取頭涂層為聚二甲基硅氧烷(PDMS)(內(nèi)徑50μm，長(zhǎng)56μm)。

SPDE參數(shù)如下：烤箱預(yù)加熱時(shí)間：5min，進(jìn)樣針溫度：85℃，烤箱加熱溫度：80℃，加熱攪拌器的轉(zhuǎn)數(shù)：500rpm，取樣注射針的深度：20mm，萃取次數(shù)：40，解析氣體量：1000μl，注射針進(jìn)樣口插入深度：45mm，熱脫附時(shí)間：30s，熱脫附注射速度：50μl/s，萃取頭老化時(shí)間：6min，萃取頭老化溫度：250℃。

2.4.GC-MS/MS條件

色譜條件：分析柱為VF-WAXms毛細(xì)管柱(30m×0.25mm ID；Agiletnt Technologies，USA)涂層為100％聚乙二醇(0.25μm膜厚度)。載氣為氦氣，流速為2.5ml·min^-1，程序升溫方法：初始溫度為50℃維持1min，以12℃每分鐘的升溫速率升至150℃，以20℃每分鐘的升溫速率升至200℃，以45℃每分鐘的升溫速率升至245℃，維持2min，進(jìn)樣口溫度：250℃，不分流，溶劑延遲：6min。

質(zhì)譜條件：離子源為EI，碰撞氣為氦氣和氮?dú)?，流速分別為2.25及1.5ml·min^-1，EI源溫度為250℃，電離能量為70Ev，分析時(shí)間為14.8min。

各成分及內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)見(jiàn)表1。

表1目標(biāo)分析物和內(nèi)標(biāo)物的GC–MS/MS儀器方法

2.5.方法學(xué)考察

2.5.1.專(zhuān)屬性

取空白血漿，除不加內(nèi)標(biāo)外，其他按“血漿樣品預(yù)處理”項(xiàng)下操作，得空白血漿色譜圖；分別取6只不同來(lái)源的空白大鼠血漿100μl，將一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液加入空白血漿中，除不加內(nèi)標(biāo)外，其他按“血漿樣品預(yù)處理”項(xiàng)下操作，進(jìn)樣10μl，得空白血漿加標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖；取大鼠灌胃給予龍虎人丹后的血漿樣品，依同法操作，得給藥后血漿色譜圖，參見(jiàn)圖2。

2.5.2.標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液用大鼠空白血漿稀釋至30μg/ml，然后再依次稀釋到400、320、80、20、4、1、0.5ng/ml，配制成濃度范圍為0.5～400ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)系列血漿樣品，按“血漿樣品預(yù)處理”項(xiàng)下的方法操作，每一濃度進(jìn)行六樣本分析，記錄色譜圖，以各標(biāo)準(zhǔn)樣品血藥濃度為橫坐標(biāo)，各標(biāo)準(zhǔn)樣品與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值為縱坐標(biāo)，用加權(quán)(w＝1/x²)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算，求得的直線(xiàn)回歸方程即為標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

2.5.3.準(zhǔn)確度和精密度

取空白血漿100μl，按“標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)與定量下限”項(xiàng)下的方法制成低、中、高三個(gè)濃度(即②、④、⑥濃度)的質(zhì)量控制(QC)樣品，每一濃度進(jìn)行五樣本分析，連續(xù)測(cè)定3批，根據(jù)當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算QC樣品中各成分的實(shí)測(cè)濃度。根據(jù)QC樣品的各成分實(shí)測(cè)濃度計(jì)算本法的批內(nèi)和批間精密度與準(zhǔn)確度。

2.5.4.提取回收率

取空白血漿100μl，按“標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)”項(xiàng)下方法制備低、中、高三個(gè)濃度(即②、④、⑥濃度)的質(zhì)量控制(QC)樣品，每一濃度進(jìn)行三樣本分析，獲得相應(yīng)峰面積。同時(shí)，取水100μl，按“標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)”項(xiàng)下方法制備低、中、高三個(gè)濃度(即②、④、⑥濃度)的質(zhì)量控制(QC)樣品，每一濃度進(jìn)行三樣本分析，獲得相應(yīng)峰面積進(jìn)樣分析，獲得相應(yīng)峰面積。以每一濃度兩種處理方法的峰面積比值計(jì)算提取回收率。

2.5.5.穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

血漿樣品室溫放置12h穩(wěn)定性：按“標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)”項(xiàng)下方法制備低、中、高三個(gè)濃度(即②、④、⑥濃度)的質(zhì)量控制(QC)樣品，混勻后在室溫放置12h，再按“血漿樣品預(yù)處理”項(xiàng)處理樣品(n＝3)，進(jìn)行測(cè)定。

血漿樣品-80℃凍融3次穩(wěn)定性：按“標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)”項(xiàng)下方法制備低、中、高三個(gè)濃度(即②、④、⑥濃度)的質(zhì)量控制(QC)樣品，放置-80℃冰箱反復(fù)凍融3次，第3次融化后，按再按“血漿樣品預(yù)處理”項(xiàng)處理樣品(n＝3)，進(jìn)行測(cè)定。

血漿樣品-80℃凍存15天穩(wěn)定性：按“標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)”項(xiàng)下方法制備低、中、高三個(gè)濃度(即②、④、⑥濃度)的質(zhì)量控制(QC)樣品，放置-80℃冰箱凍存15天，再按“血漿樣品預(yù)處理”項(xiàng)處理樣品(n＝3)，進(jìn)行測(cè)定。

上述樣品均按各分析批的隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出各QC樣品的濃度，計(jì)算各濃度的平均值與標(biāo)示濃度的比值，從而得出樣品的穩(wěn)定性。

2.5.6.稀釋方法學(xué)

對(duì)于超出定量上限的血漿樣品，需用空白血漿基質(zhì)按一定比例稀釋到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的線(xiàn)性范圍后測(cè)定。為了考察稀釋過(guò)程是否影響血漿樣品測(cè)定的準(zhǔn)確度和精密度，按下列步驟進(jìn)行了稀釋方法確證：配制相當(dāng)于高濃度QC樣品5和10倍的樣品，每個(gè)平行三樣本，用空白血漿基質(zhì)稀釋5和10倍后，按“血漿樣品預(yù)處理”項(xiàng)下操作，進(jìn)行GC-MS/MS分析。根據(jù)測(cè)定結(jié)果，計(jì)算稀釋樣品的準(zhǔn)確度和精密度。

3.結(jié)果

3.1.方法學(xué)考察

3.1.1專(zhuān)屬性

專(zhuān)屬性結(jié)果見(jiàn)圖2，結(jié)果表明：空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾樟腦、薄荷腦、異龍腦、龍腦以及內(nèi)標(biāo)物萘的測(cè)定。

圖2(A)空白大鼠血漿、(B)空白血漿加標(biāo)準(zhǔn)品及(C)大鼠口服龍虎人丹30分鐘后的血漿樣品中各成分的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖(1)樟腦、(2)薄荷腦、(3)異龍腦、(4)龍腦和(5)萘。

3.1.2.標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和定量下限

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程結(jié)果、線(xiàn)性范圍和最低定量限見(jiàn)表2。

表2樟腦、薄荷腦、異龍腦和龍腦在大鼠血漿中的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)、線(xiàn)性范圍和最低定量下限

3.1.3.準(zhǔn)確度和精密度

4種成分批內(nèi)和批間變異及準(zhǔn)確度結(jié)果見(jiàn)表3，批內(nèi)及批間RSD在4.27％-9.53％之間，準(zhǔn)確度在95.20％-106.20％，均符合要求。

表3 4種分析物的精密度和準(zhǔn)確度

3.1.4.提取回收率及穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

回收率見(jiàn)表4，測(cè)得各成分在各濃度血漿樣品中的提取回收率為74.95％–88.55％。

穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)的具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表4，結(jié)果表明：血漿樣品在室溫下保存12h內(nèi)穩(wěn)定，未經(jīng)處理的血漿樣品在-80℃冰箱內(nèi)反復(fù)凍融3次穩(wěn)定，未經(jīng)處理的血漿樣品在-80℃冰箱內(nèi)保存15天內(nèi)穩(wěn)定。

表4樟腦、薄荷腦、異龍腦和龍腦在大鼠血漿中的穩(wěn)定性和回收率

(n＝3)

3.1.7.稀釋方法學(xué)考察

將3.2μg/ml和1.6μg/ml的含樟腦、薄荷腦、異龍腦、龍腦的血漿樣品分別稀釋10倍和5倍，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5。

表5質(zhì)控樣品稀釋倍數(shù)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(n＝3)

結(jié)果表明，血漿樣品經(jīng)稀釋后測(cè)定結(jié)果的RSD在±15％以?xún)?nèi)，說(shuō)明血漿樣品經(jīng)5倍及10倍稀釋再測(cè)定，不會(huì)影響樣品測(cè)定的準(zhǔn)確度和精密度。

以上方法學(xué)考察結(jié)果說(shuō)明建立的方法符合按照生物樣品分析的規(guī)范要求。

以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行了說(shuō)明，但本發(fā)明并不以此為限，只要不脫離本發(fā)明的宗旨，本發(fā)明還可以有各種變化。